摘 要：為探究鯽（Carassius auratus）鰓組織對低氧的適應(yīng)性變化，使用RNA-seq技術(shù)對低氧（溶解氧0.6 mg/L±0.2 mg/L，水溫16 ℃±0.5 ℃）處理0 h和96 h的鯽的鰓組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得40.22 Gbp Clean Base，每個樣本93%～96%的堿基質(zhì)量值大于Q30。差異分析共獲得7 142個差異基因（| log2FoldChange |≥1且FDR＜0.05）。GO功能富集分析表明，差異表達基因主要在DNA復(fù)制啟動、MCM復(fù)合體等功能顯著富集。KEGG通路富集分析表明，差異基因主要在DNA復(fù)制、VEGF信號通路、壞死型凋亡等通路中被顯著富集。綜上所述，vegf、vegfb、hba、hbb、mcm2—mcm6、ripk3等基因是鯽96 h低氧適應(yīng)的關(guān)鍵基因。

關(guān)鍵詞：鯽（Carassius auratus）；低氧脅迫；轉(zhuǎn)錄組

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32303030）；河北省自然科學(xué)基金（C2021204089；V1654588161890；236Z6701G）；河北農(nóng)業(yè)大學(xué)人才引進科研基金（YJ2020032）；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系淡水養(yǎng)殖創(chuàng)新團隊名優(yōu)特種類繁育及綠色高效養(yǎng)殖（HBCT2023230205）。

作者簡介：侯智廣（2000-），男，碩士研究生，研究方向：魚類遺傳育種。E-mail：hzg66888@sina.com。

通訊作者：吳成賓（1988-），男，副教授，研究方向：魚類遺傳育種。E-mail： hyxywcb@hebau.edu.cn。

DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2024.10.004

鯽（Carassius auratus）隸屬于鯉形目（Cypriniformes），鯉科（Cyprinidae），是一種廣泛分布于江河、湖泊、水庫、池塘等大小水體中的魚類，主要棲息于水域的中下層，具有極強的耐低氧能力，當(dāng)含氧量低達0.1 mg/L時，開始死亡。當(dāng)水體中溶解氧（DO）小于2 mg/L 時，被認為處于低氧狀態(tài)。氧氣是影響魚類活動的重要因素之一，是魚類生存的基礎(chǔ)。當(dāng)水體中的溶解氧下降時，會引起魚類攝食量減少、生長速度減慢、免疫力降低、生殖力下降，甚至死亡。水體中的溶解氧易受到外界因素的影響，如氣候變暖、水體富營養(yǎng)化、浮游動物呼吸等，魚類為了適應(yīng)低氧環(huán)境，在其生理狀態(tài)和行為上也會發(fā)生相應(yīng)的改變，例如增加呼吸頻率、到達水面呼吸、增強血氧親和力等。

鯽在缺氧狀態(tài)下還會發(fā)生鰓重塑。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在低氧狀態(tài)下鯽鰓絲上皮細胞變薄，且有明顯突出的鰓小片和 7.5 倍大的鰓表面積，進而增加氧氣交換效率。重塑過程中涉及到鰓小片間細胞（ILCM）的增殖與凋亡，某些細胞可能會增殖以形成新的鰓絲結(jié)構(gòu)，而一些老化的或不再需要的細胞則可能會凋亡。這可能是鯽耐低氧的原因之一。當(dāng)水中溶解氧水平發(fā)生變化時，魚類某些與氧感應(yīng)相關(guān)基因的表達（hif-α、phd2、vhl和fih-1）也會發(fā)生變化。本研究運用轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)技術(shù)，對鯽鰓組織進行轉(zhuǎn)錄測序，分析低氧脅迫下鰓組織基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，探究調(diào)控鯽低氧適應(yīng)的功能基因，旨在為探究魚類耐低氧適應(yīng)機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本課題使用的鯽取自河北省張家口市。取鯽30尾（體質(zhì)量：225 g±25 g，體長：18～21 cm），隨機平分為3缸（即每缸10尾，水體150 L，水溫16 ℃±0.5 ℃，溶解氧＞6 mg/L），置于室內(nèi)水體中暫養(yǎng)。7 d后開始低氧處理，使用玻璃板封閉水體表面，采用空氣和氮氣混合充氣的方法使魚缸內(nèi)溶解氧保持在（0.6±0.2）mg/L，水溫（16±0.5）℃，低氧處理96 h。鯽鰓樣本取自常氧0 h（C_0）和低氧96 h（T_96）。解剖前用MS-222將魚麻醉，立即收集第二片魚鰓樣本，冷凍在液氮中并儲存在-80 ℃下直至RNA測序。

1.2 分析方法

將采集的鰓組織樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進行高通量測序。測序完成后，使用fastp對下機Raw Data（原始數(shù)據(jù)）進行質(zhì)控、去除接頭，得到Clean Data（過濾后數(shù)據(jù)）。在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載參考基因組（GCF_003368295.1），使用HISAT2構(gòu)建索引，并將Clean Data映射到參照基因組。featureCounts用于計算映射到每個基因的讀數(shù)。使用DESeq2進行差異基因分析，通過以下閾值進行識別：| log2FoldChange |≥1且FDR＜0.05 ，被認為是顯著差異基因。使用clusterProfiler將所有的差異基因映射到GO數(shù)據(jù)庫 （http：//geneontology.org/）和KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.genome.jp/kegg/）進行富集分析，P＜0.05被認為顯著富集，ggplot2進行可視化。

1.3 熒光定量PCR驗證

按照制造商的方案使用TRIzol法提取鰓組織的總RNA，使用核酸蛋白檢測儀檢測RNA的純度和濃度，隨后反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR， RT-PCR）合成cDNA。使用NCBI-BLAST在線設(shè)計引物（表1）。以cDNA為模板，18S rRNA為內(nèi)參基因，選取6個關(guān)鍵差異表達基因使用熒光定量PCR儀（Bio-Rad CFX96）進行實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR， qRT-PCR）驗證，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，然后 95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s（39個循環(huán)），65 ℃延伸5 s。采用2-ΔΔCt值計算每個基因的相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果用平均值±標準差（Mean±SD）表示。P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

對兩組鯽鰓組織樣品測序共獲得40.22 Gbp Clean Base（過濾后有效數(shù)據(jù)量），Q20堿基在97%～98%，Q30堿基在93%～96%，GC含量在42%～46%，轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較好，測序數(shù)據(jù)符合后續(xù)的基因功能分析和注釋要求（表2）。

2.2 差異表達基因

通過對常氧組和低氧組基因進行差異分析，按差異倍數(shù)（FoldChange≥2）和校正后的P值（FDR＜0.05）篩選，共得到7 142個差異表達基因，包括3 146個下調(diào)基因和3 996個上調(diào)基因（封二圖1）。

2.3 KEGG和GO富集

KEGG富集分析（封二圖2）共得到26條顯著富集通路（P＜0.05）。包括DNA復(fù)制（caua03030）、甘油磷脂代謝（caua00564）、壞死性凋亡（caua04217）、VEGF信號傳導(dǎo)通路（caua04370）、ErbB信號通路（caua04012）、胞質(zhì)DNA感應(yīng)通路（caua04623）和胞葬作用（caua04148）等。

GO富集分析顯示（封二圖3），差異基因富集到3個功能類別：生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和細胞成分（Cellular Component，CC），顯著富集到的條目共33個（P＜0.05）。在生物過程類別中，富集到DNA 復(fù)制啟動（GO∶0006270）、染色體組織（GO∶0051276）、DNA 復(fù)制（GO∶0006260）、激活免疫應(yīng)答（GO∶0002253）等。在分子功能類別中，富集到高爾基體（GO∶0005794）、微染色體維持復(fù)合體（GO∶0042555）等。在細胞成分類別中，富集到ATP水解活性（GO∶0016887）、氨基?；D(zhuǎn)移酶活性（GO∶0016755）等。

2.4 功能基因表達量驗證

利用qRT-PCR驗證6個差異基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)差異基因qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果具有相似的表達趨勢（封二圖4），表明本研究中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。

3 討論與分析

Wang等在低氧誘導(dǎo)的細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)了HIF。大量的研究表明低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia- inducible factors 1，HIF-1）蛋白在生物體低氧適應(yīng)時起著重要作用。低氧脅迫下花鱸、花斑裸鯉、團頭魴的hif-1α基因表達顯著上調(diào)。在本研究中鯽低氧96 h后hif-1α基因沒有顯著上調(diào)。Sollid等研究發(fā)現(xiàn)這可能由于鯽在常氧下動脈血氧分壓就保持在較低的水平且Hif-1α蛋白含量存在較高的水平，是hif-1α基因在低氧時保持穩(wěn)定的原因，Hif-1α蛋白的含量與鯽體重相關(guān)，這表明hif-1α基因的表達可能與鯽生理學(xué)缺氧無關(guān)。

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制、VEGF信號傳導(dǎo)通路和甘油磷脂代謝顯著富集，該通路與細胞的增殖、血管內(nèi)皮生長和細胞膜的通透性相關(guān)，vegf、vegfb等基因具有促進內(nèi)皮增殖、血管生成、血管通透性增加的作用。缺氧為導(dǎo)致vegf基因高表達的因素之一。vegf通過影響血漿酶原活化因子（PA）和血漿酶原活化因子抑制因子-l（PAI-1）的表達，來提高血漿酶原活化因子的活性，促進細胞外蛋白水解，從而增強毛細血管的形成，這表明在96 h時鯽可能通過促進血管的生成和血管通透性增加適應(yīng)低氧環(huán)境。Lu等研究發(fā)現(xiàn)在低氧誘導(dǎo)的紅鰭東方鲀中與血管生成相關(guān)基因也顯著上調(diào)。血管中的紅細胞是脊椎動物運輸氧氣的主要媒介，本研究發(fā)現(xiàn)與血紅蛋白生成相關(guān)的hba、hbb、hbbe基因表達顯著上調(diào)，而血紅蛋白是紅細胞內(nèi)運輸氧氣的特殊蛋白，該蛋白的增加提高了紅細胞攜帶氧的能力，這可能是鯽對低氧適應(yīng)的表現(xiàn)。張曦等研究發(fā)現(xiàn)鯽幼魚急性低氧處理后血液中紅細胞數(shù)、血紅蛋白濃度增加。此外，本研究發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡和胞葬作用也被顯著富集，壞死性凋亡是當(dāng)細胞凋亡受阻時，通過細胞外信號或細胞內(nèi)信號被激活的細胞自我破壞的過程，mlkl、ripk3和ripk1基因在此過程中起著主要作用。這表明低氧脅迫過程中存在細胞的凋亡和清除，凋亡的細胞可能是鰓小片間細胞，巨噬細胞通過胞葬作用對其凋亡細胞進行清除，gulp1基因編碼的蛋白是吞噬細胞吞噬凋亡細胞的銜接蛋白，低氧96 h時顯著上調(diào)。

GO富集發(fā)現(xiàn)差異基因顯著富集到DNA復(fù)制啟動、DNA復(fù)制、MCM復(fù)合物等功能，其中mcm2—mcm6基因顯著下調(diào)，微小染色體維持蛋白（Minichromosome maintenance proteins，MCM）是DNA復(fù)制啟動和延伸所必需的復(fù)制解旋酶，被稱為“復(fù)制許可證”的復(fù)制前復(fù)合物，是細胞進入DNA合成期和分裂期的前提，這可能與鰓重塑過程中鰓小片間細胞的增殖受到抑制有關(guān)。

4 結(jié)論

通過對鯽鰓組織進行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，hif-1α基因的表達可能與鯽生理學(xué)缺氧無關(guān)，VEGF信號傳導(dǎo)通路、DNA復(fù)制為96 h時鯽低氧適應(yīng)的主要通路。其血管生成、血紅蛋白、細胞膜通透性增加和鰓小片間細胞的增殖受抑制可能在鯽低氧96 h時起主要作用，vegf、vegfb、hba、hbb、mcm2—mcm6、ripk3等基因是鯽低氧96 h的關(guān)鍵基因。本研究為探索鯽低氧適應(yīng)的方式和相關(guān)功能基因表達的變化提供一定的參考。

參考文獻：

饒發(fā)祥. 鯽魚種類生物學(xué)特性及其特殊的繁殖方式.北京水產(chǎn)， 1996（Z1）： 21-23.

ZHANG Z，WELLS M C，BOSWELL M G，et al. Identification of robust hypoxia biomarker candidates from fin of medaka （Oryzias latipes）.Comp. Biochem. Physiol.2012，155：11-17.

ABDEL-TAWWAB M， MONIER M N， HOSEINIFAR S H， et al. Fish response to hypoxia stress： growth， physiological， and immunological biomarkers.Fish Physiol.Biochem.2019，45：997-1013.

WU R S，ZHOU B S，RANDALL D J，et al.Aquatic hypoxia is an disrupter and impairs fish reproduction.Environmental Science & Technology，2003，37（6）：1137-1141.

LEVIN L A， BREITBURG D L.Linking coasts and seas to address ocean deoxygenation.Nat Clim Chang，2015，5（5）：401-403.

SAHA N， KONER D， SHARMA R.Environmental hypoxia： A threat to the gonadal development and reproduction in bony fishes.Aquaculture and Fisheries，2022，7（5）;572-582.

DHILLON R S， YAO L， MATEY V， et al.Interspecific differences in hypoxia-induced gill remodeling in carp.Physiological and Biochemical Zoology，2013，86（6）：727-739.

SILKIN Y A，SILKINA E N. Effect of hypoxia on physiological biochemical blood parameters in some marine fish.Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology，2005，41：527-532．

SOLLID J， DE ANGELIS P， GUNDERSEN K， et al.Hypoxia induces adaptive and reversible gross morphological changesin crucian carp gills.The Journal of Experimental Biology，2003，206：3667-3673．

郭志雄.低氧環(huán)境對軍曹魚幼魚生化指標、相關(guān)基因表達的影響及其轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析.湛江：廣東海洋大學(xué)，2020.

PEI X Y， CHU M X， TANG P， et al.Effects of acute hypoxia and reoxygenation on oxygen sensors， respiratory metabolism， oxidative stress， and apoptosis in hybrid yellow catfish "Huangyou-1".Fish physiology and biochemistry，2021，47（5）：1429 -1448

WANG G L， SEMENZA G L.Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1.Journal of Biological Chemistry，1995，270（3）：1230-1237.

張凱強，常志成，溫海深，等.花鱸低氧誘導(dǎo)因子基因（hifs）的序列分析及低氧誘導(dǎo)表達.中國海洋大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2020， 50 （1）： 39-47.

趙永麗.花斑裸鯉低氧脅迫轉(zhuǎn)錄組學(xué)及其主要差異基因表達調(diào)控研究.西寧：青海大學(xué)，2018.

WU C， ZHENG G， ZHAO X， et al.Hypoxia tolerance in a selectively bred F 4 population of blunt snout bream （Megalobrama amblycephala） under hypoxic stress.Aquaculture， 2020， 518：734484-734484.

SOLLID J， RISSANEN E，TRANBERG H K，et al.HIF-1ɑ and iNOS levels in crucian carp gills during hypoxia-induced transformation.Journal of Comparative Physiology B，2006，176：359-369.

劉曉揚，呂婷，楊光路.血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)性研究進展.臨床醫(yī)學(xué)進展， 2021， 11（2）： 821-825.

SHWEIKI D， ITIN A， SOFFER D， et al.Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis . Nature，1992，359（6398）：843-845.

LU Y， LI Y， BAO M，et al.Comparative transcriptome profiling and functional analysis in the blood of tiger puffer （Takifugu rubripes） in response to acute hypoxia.Aquaculture Reports，2023，30：101618.

張曦，付世建，彭姜嵐，等.急性低氧對鯽魚幼魚血液基礎(chǔ)指標的影響.重慶師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，28（4）：19-22.

WAHLER A， BEYER A S， KELLER I E， et al. Engulfment adaptor phosphotyrosine-binding- domain-containing 1 （GULP1） is a nucleocytoplasmic shuttling protein and is transactivationally active together with low-density lipoprotein receptor-related protein 1 （LRP1）.Biochem J，2013，450（2）：333-343.

TODOROV I T， PEPPERKOK R， PHILIPOVA R N， et al. A human nuclear protein with sequence homology to a family of early S phase proteins is required for entry into S phase and for cell division.J Cell Sci，1994，107：253-65.

Transcriptome analysis of the effects of hypoxic stress on gene expressi on in gill tissues of crucian carp

HOU Zhiguang1， CHEN Li2， XING Mengchao1，CHANG Ruize1， WU Chengbin1

（1.Ocean College of Hebei Agricalture University， Qinhuangdao 066000， China；2. Hebei Academy of Marine and Fishery Sciences， Qinhuangdao 066003， China）

Abstract：In order to investigate the adaptive changes of crucian carp （Carassius auratus） to hypoxia， gill tissues treated with hypoxia （dissolved oxygen 0.6 mg/L±0.2 mg/L， water temperature 16 ℃±0.5 ℃） for 0 h and 96 h and were subjected to transcriptome sequencing by RNA-seq， and a total of 40.22 Gbp Clean Base was obtained， and 93%～96% of bases in each sample had a mass value greater than Q30. Differential analysis yielded a total of 7 142 differential genes （| log2FoldChange |≥1 and FDR＜0.05）. GO functional enrichment analysis showed that the differentially expressed genes were significantly enriched mainly in DNA replication initiation， MCM complex， etc. KEGG pathway enrichment analysis showed that the differentially expressed genes were mainly in DNA replication， VEGF signaling pathway， necrotic apoptosis and other functions. In summary， vegf， vegfb， hba， hbb， mcm2—mcm6， ripk3 and other genes are the key genes for 96 h hypoxia adaptation in crucian carp.

Key words：Carassius auratus;hypoxic;RNA-seq

（收稿日期：2024-07-12）