摘要：為減少癌細(xì)胞對藥物的抗藥性，通過液質(zhì)聯(lián)用法、MTT法和流式細(xì)胞儀分析法對蕎麥和燕麥多酚提取物進(jìn)行組分鑒定以及對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用進(jìn)行研究，并結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜鑒定（-）-表阿夫兒茶精-表兒茶素等10種化合物。結(jié)果表明，蕎麥和燕麥多酚提取物對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞抑制作用表現(xiàn)為一定的濃度范圍內(nèi)隨著多酚提取物濃度的增加而極顯著增加（Plt;0.01），其中，燕麥多酚提取物的抑制作用顯著高于蕎麥（Plt;0.05），最佳培養(yǎng)時間皆為24 h。聯(lián)合作用條件下，燕麥濃度增加至6.0 mg·mL-1以上時，蕎麥和燕麥多酚提取物呈現(xiàn)出協(xié)同抑制作用，其最佳濃度組合為蕎麥（2.0或3.0 mg·mL-1）和燕麥（10.0 mg·mL-1），對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖抑制率濃度分別為47.03%和50.10%。經(jīng)凋亡圖譜分析發(fā)現(xiàn)，蕎麥和燕麥組（C和D）不僅遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組，與同劑量燕麥組（B）相比，細(xì)胞凋亡率分別增加了3.5%和6.8%。因此，說明蕎麥和燕麥中多酚化合物存在形式之間的互補(bǔ)可有效地誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且能夠?qū)Χ喾影┘?xì)胞增殖協(xié)同抑制作用提供幫助。

關(guān)鍵詞：蕎麥；燕麥；多酚；結(jié)腸癌；協(xié)同抑制作用

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在所有腫瘤中占第3位，其治療多以手術(shù)為主并輔以化療和放療，但術(shù)后5年發(fā)病率卻在50%左右。因此，探索新的、更有效的藥物用于改善結(jié)腸癌的治療顯得尤為重要[1-3]。多酚化合物的抗氧化、抗炎和抗癌等生物活性功能已被證實。例如，山柰酚能抑制人結(jié)腸癌SW48細(xì)胞的生長，通過誘導(dǎo)p53介導(dǎo)的線粒體凋亡通路及阻滯細(xì)胞周期來實現(xiàn)對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用[4]；槲皮素對人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用并能引起細(xì)胞周期阻滯，為一種極具發(fā)展?jié)摿Φ目菇Y(jié)腸癌藥物[5]；γ-生育三烯酚對體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，并可有效誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]。隨著山柰酚、槲皮素抗癌機(jī)理的發(fā)現(xiàn)，以其為組成成分的雜糧多酚化合物抗癌作用也陸續(xù)展開了研究，例如，薏米多酚提取物被證實了可抑制老鼠中肉瘤-180腫瘤生長、可對U937白血病細(xì)胞及A549肺癌細(xì)胞的增殖起到抑制作用[7-8]。此外，在多組分體系中，多酚與其它抗氧化劑共存時二者之間存在著協(xié)同增效作用[9]。例如，多酚化合物可與VE的自由基發(fā)生反應(yīng)，使VE的結(jié)構(gòu)得到修復(fù)而繼續(xù)發(fā)揮抗氧化作用；在完整的膜細(xì)胞中，酚酸與阿魏酸、生育酚、β-胡蘿卜素之間協(xié)同抗氧化作用明顯會高于單一抗氧化劑的抗氧化效果。因此，具有生物活性的營養(yǎng)素之間的協(xié)同作用研究已成為一個嶄新的課題。雜糧蕎麥中含有的蘆丁、3-黃酮醇、酚酸及其衍生物等多酚化合物不僅對自由基損傷具有一定的修復(fù)能力，還可影響基因的表達(dá)和細(xì)胞中結(jié)合激酶以后的信號傳遞，進(jìn)而幫助機(jī)體對抗由于氧化作用帶來的疾病[10-14]。而燕麥除了含有豐富的蛋白質(zhì)、可溶性膳食纖維和維生素外還含有肉桂酸衍生物、對香豆酸、對羥基苯甲酸等多酚類物質(zhì)[15-16]，其二者含有的多酚化合物相互之間是否存在協(xié)同增效作用卻鮮見報道。

本研究以蕎麥和燕麥多酚提取物為研究對象，通過二者對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖抑制作用的研究，可以更好地了解氧化應(yīng)激狀態(tài)下，多酚化合物清除自由基或抑制蛋白磷酸化的能力。對二者協(xié)同作用的探究可為多酚化合物的聯(lián)合使用，增強(qiáng)藥用功效，減少癌細(xì)胞對藥物的抗藥性起到積極的指導(dǎo)作用，進(jìn)而為谷物食品保健功能的開發(fā)和增效作用提供一定理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料

蕎麥和燕麥（阜新化石戈谷業(yè)有限責(zé)任公司）；人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)）；福林-酚試劑、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、胰蛋白酶（美國Sigma公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素、二甲基亞砜（DMSO）（北京索萊寶科技有限公司）；Giemsa吉姆薩染液（上海古朵生物科技有限公司）；PBS緩沖液（科德角國際生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）；碘化丙啶PI染色液（上海居里生物科技有限公司）；膜聯(lián)蛋白v-fitcpropidium碘凋亡檢測試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；甲醇和乙腈為色譜純；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī)（紹興市科宏儀器有限公司）；F-101S集熱式磁力加熱攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；LCQ Deca XP Plus液質(zhì)聯(lián)用儀（美國熱電菲尼根公司）；VD-1320型無菌超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造廠）；HF-90型CO2培養(yǎng)箱（HealForce公司；Model 680型酶標(biāo)儀）BIO-RAD公司；AE-31型倒置顯微鏡（麥克奧迪公司）；FACS分選型流式細(xì)胞儀（BDAria公司）。

1.2方法

本研究于2023年10月10日在齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院212實驗室開始

蕎麥和燕麥多酚提取物的提取，與此同時在學(xué)院細(xì)胞間開展結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的培養(yǎng)，于2023年11月中旬完成多酚鑒定，2023年11月下旬開展結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞協(xié)同抑制作用研究，最終于2023年12月18日完成本研究。

1.2.1多酚提取物制備

分別稱取蕎麥和燕麥粉各10.0 g于燒杯中，按料液比1∶10加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液后，于37 ℃條件下攪拌提取5.0 h，經(jīng)離心、濃縮、凍干，即得蕎麥和燕麥多酚凍干粉。

1.2.2多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteau法[17]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=0.011 9X+0.005 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。

1.2.3高效液相色譜-質(zhì)譜分析

取蕎麥和燕麥凍干粉于離心管中，加入10.0 mL甲醇溶解，超聲30 min，經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后進(jìn)行液質(zhì)分析。色譜分析條件：采用島津18C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL；流動相A相為乙腈，B相為體積分?jǐn)?shù)2%的乙酸水溶液。梯度洗脫程序：0～30 min，100%A；30～35 min，40%A；35～42 min，1%A。

質(zhì)譜分析條件：霧化氣（N2）流速為25 Psi；干燥氣（N2）流速為9.0 L·min-1；毛細(xì)管溫度為350 ℃，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，采用正、負(fù)離子模式，測定范圍為m/z=100～2 000。

1.2.4結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱中37.0 ℃培養(yǎng)。其培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基，其中含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)1.0%的100 U·mL-1青霉素及0.1 mg·mL-1鏈霉素。

1.2.5蕎麥和燕麥多酚提取物對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的抑制作用

采用MTT法進(jìn)行測定。其操作過程為：取對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞。用RPMI-1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×104個·mL-1。接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化?；?.2.2的測定調(diào)整蕎麥和燕麥多酚化合物含量為同一濃度，試驗組濃度經(jīng)調(diào)整設(shè)定為：蕎麥組0.6，1.2，1.8，2.4和3.0 mg·mL-1；燕麥組2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mg·mL-1，同時設(shè)定等體積培養(yǎng)液為空白對照組。每個濃度設(shè)8個復(fù)孔，培養(yǎng)時間為24和48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄各孔中殘余培養(yǎng)液，每孔中加入0.5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，37.0 ℃孵育4 h吸棄各孔中的液體，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）200 μL，室溫低速振蕩5 min，使結(jié)晶充分溶解并混勻，于全自動酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度值。平行3次取平均值。

細(xì)胞增殖抑制率計算公式為：

CPI（%）=A1-A2A1×100

式中，CPI為細(xì)胞增殖抑制率（%）；A1為空白對照組吸光度值；A2為試驗組吸光度值。

1.2.6蕎麥和燕麥多酚提取物對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用

在1.2.5試驗基礎(chǔ)之上選取濃度為0，2.0和3.0 mg·mL-1的蕎麥提取物與濃度為2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mg·mL-1的燕麥提取物進(jìn)行組合，按1.2.5方法對經(jīng)24 h培養(yǎng)的結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行測定。

1.2.7細(xì)胞凋亡和細(xì)胞形態(tài)觀察

調(diào)整結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞密度為5.0×104 個·mL-1，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5 mL，培養(yǎng)24 h，棄去舊的培養(yǎng)基。共設(shè)置4組分別加入含有10.0 mg·mL-1燕麥，2.0 mg·mL-1蕎麥+10.0 mg·mL-1燕麥，3.0 mg·mL-1蕎麥+10.0 mg·mL-1燕麥和空白對照組的多酚提取物的新鮮培養(yǎng)基，37.0 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后進(jìn)行Giemsa染色，倒置顯微鏡觀察。

1.2.8細(xì)胞凋亡的檢測

為了檢測蕎麥和燕麥的多酚協(xié)同引起的生長抑制是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)，根據(jù)試驗結(jié)果，采用了抑制24 h的細(xì)胞來探討細(xì)胞凋亡情況。凋亡細(xì)胞用Annexin-V/PI標(biāo)記法進(jìn)行檢測，由流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察，實驗分組為對照組A，燕麥組B以及蕎麥和燕麥協(xié)同作用組C、D。體積分?jǐn)?shù)為0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，離心（1 000 r·min-1，7 min），4.0 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，用250 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞調(diào)整其濃度為1.0×106 個·mL-1。取100 μL的細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL annexin V-FITC和10 μL、20 μg·mL-1的碘化丙啶溶液，混勻，于室溫避光孵育15 min，在反應(yīng)管中加400 μLPBS，上流式細(xì)胞儀分析。

1.2.9數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 2021軟件進(jìn)行作圖且圖中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差繪制。在Plt;0.01水平進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1蕎麥和燕麥提取物中多酚化合物的鑒定

蕎麥和燕麥多酚提取物在280 nm處的HPLC光譜的主要UV峰如圖1所示，其主要化合物如表1所示。根據(jù)這些化合物保留時間、分子離子峰和碎片離子峰參考相應(yīng)文獻(xiàn)[18-23]確定蕎麥中多酚化合物主要為（-）-表阿夫兒茶精-表兒茶素、咖啡酸-己糖、原花青素B2、葡糖基蘆丁、（-）-表阿夫兒茶精-表兒茶素-O-（3，4-二-O-甲基）沒食子酸酯、（-）-表兒茶素-3-O-（3，4-二-O-甲基）沒食子酸酯；燕麥中主要為N-3′，4′-二羥基肉桂酰-5-羥基鄰氨基苯甲酸、燕麥蒽酰胺及其衍生物、二烯酸與二十六烷-1-醇、26-羥基二十六烷酸和28-羥基二十八烷酸組成的酚酸酯化合物。

2.2蕎麥和燕麥多酚提取物對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2.1蕎麥

單獨對蕎麥多酚提取物5組濃度孵育24和48 h探討其多酚提取物對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的抑制作用。由圖2可知，在培養(yǎng)24 和48 h后，蕎麥多酚提取物對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖清除率隨著濃度增加都呈現(xiàn)極顯著的先增加后下降的趨勢，差異顯著性具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01），且只在0.5～2.5 mg·mL-1之間存在濃度依賴性。

培養(yǎng)時間為24 h，蕎麥提取物濃度為2.4 mg·mL-1時，對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖抑制效果最好，抑制率達(dá)到了29.14%。此外，作用24 h后蕎麥多酚提取物比作用48 h后蕎麥多酚提取物對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的清除率更高，可極顯著抑制結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞，推測可能與細(xì)胞周期有關(guān)。孵育24和48 h的清除率在經(jīng)過2.4 mg·mL-1呈現(xiàn)下降趨勢，推測可能是因為蕎麥多酚高濃度下對癌細(xì)胞的抑制作用減弱。

因此，蕎麥多酚提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2抑制的最佳作用時間是24 h，提取物濃度2.4 mg·mL-1。

2.2.2燕麥多酚提取物

根據(jù)MTT法，單獨對燕麥多酚提取物5組濃度孵育24和48 h探討結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的抑制作用。由圖3可知，在培養(yǎng)時間為24和48 h后，燕麥多酚提取物對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖清除率隨著濃度增加而呈現(xiàn)極顯著增加的趨勢，差異顯著性具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01），且清除率隨著濃度的增加呈現(xiàn)劑量依賴性。培養(yǎng)時間增加至48 h時，燕麥多酚提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖清除率極顯著下降，推測可能是燕麥多酚對人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞凋亡受到了細(xì)胞周期的影響。因此，燕麥多酚提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2抑制的最佳作用時間是24 h，最佳濃度10.0 mg·mL-1。

2.3蕎麥和燕麥多酚提取物對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用

對蕎麥和燕麥多酚提取物5組濃度協(xié)同作用下孵育24 h探討結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的抑制作用，由圖4可知，在燕麥多酚提取物濃度為6.0，8.0和10.0 mg·mL-1時，其與蕎麥（2.0和3.0 mg·mL-1）混合時對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的清除率顯著高于單一燕麥多酚提取物處理，差異顯著性具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01）。其混合物協(xié)同作用濃度最佳組合模式為蕎麥（2.0和3.0 mg·mL-1）+10.0 mg·mL-1燕麥，其對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖清除率為47.03%和50.10%。結(jié)合蕎麥和燕麥多酚化合物的鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物多酚的自由態(tài)和結(jié)合態(tài)存在形式在功效發(fā)揮過程中有著重要作用。

2.4細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞凋亡發(fā)生時，會產(chǎn)生細(xì)胞的形態(tài)變化，本研究通過倒置顯微鏡200×狀態(tài)下觀察不同處理Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)48 h后的形態(tài)變化。由圖5可知，正常對照組的Caco-2細(xì)胞核大而均勻著色，核仁清晰（圖5A），與對照組進(jìn)行比較，隨著蕎麥多酚的濃度增加試驗組細(xì)胞發(fā)生不同程度的皺縮，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，排列變得松散，胞核與胞質(zhì)比例拉開，核染色體濃縮密集于核膜下，核碎裂崩解成多個小塊連同萎縮退變的細(xì)胞器被膜性結(jié)構(gòu)包裹形成凋亡小體，胞膜內(nèi)陷為凋亡細(xì)胞形態(tài)（圖5B、C、D）。證明蕎麥和燕麥多酚能夠協(xié)同抑制結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的增殖，符合細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化，并且結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞抑制力隨著蕎麥濃度的增加而增強(qiáng)。

2.5細(xì)胞凋亡的檢測

由圖6可知，對照組A活細(xì)胞的百分比為85.0%，細(xì)胞早期和晚期凋亡率分別為3.4%和2.0%，壞死細(xì)胞率為9.6%；試驗組B活細(xì)胞百分比80.3%，細(xì)胞早期和晚期凋亡率分別為6.8%和9.9%，壞死細(xì)胞率為3.0%；試驗組C活細(xì)胞的百分比78.1%，細(xì)胞早期和晚期凋亡率分別為15.6%和4.6%，壞死細(xì)胞率為1.7%；試驗組D的活細(xì)胞百分比為75.8%，細(xì)胞早期和晚期凋亡率分別為21.3%和2.2%，壞死細(xì)胞率為0.7%。由于活細(xì)胞和壞死細(xì)胞不屬于凋亡分析范疇內(nèi)，因此對細(xì)胞凋亡圖譜分析發(fā)現(xiàn)，蕎麥和燕麥組（C和D）無論早期還是晚期凋亡率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組A，總體凋亡率分別增加14.8%和18.1%，與同劑量燕麥組B相比，晚期凋亡率略下降，早期凋亡率明顯上升，但細(xì)胞總體凋亡率分別增加了3.5%和6.8%。由此可見，燕麥與蕎麥多酚提取物共存時可通過提取物協(xié)同作用誘導(dǎo)Caco-2癌細(xì)胞凋亡，促使谷物多酚抗腫瘤活性最大化發(fā)揮作用。

3討論

目前對于蕎麥與燕麥的多酚提取物研究主要集中在抗氧化活性、氧化損傷[24]和酶抑制[25]方面，而關(guān)于癌細(xì)胞抑制的研究少之又少。姚軼俊[26]做了關(guān)于蕎麥多酚對Caco-2 培養(yǎng)模型的細(xì)

胞毒理性試驗，結(jié)果顯示2.5 mg·mL-1無毒性，證明了蕎麥多酚可以用來做Caco-2 結(jié)腸癌細(xì)胞抑制研究。本研究以東北的蕎麥和燕麥為原材料提取多酚，并進(jìn)行多酚化合物的鑒定，鑒定結(jié)果與此前顧金瑞[27]共鑒定到31種多酚化合物，包括原花青素三聚體T2、香草酸、芝麻林素、肉桂鞣質(zhì)、原花青素B7、對香豆素-二己糖苷等，其中（-）-表兒茶素-3-O-（3，4-二-O-甲基）沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯結(jié)果一致。因此，提取出來的多酚得到了驗證，證明了此提取流程具有可操作性和合理性。

關(guān)于多酚對于癌細(xì)胞增殖抑制的影響，本研究先分別對蕎麥多酚和燕麥多酚進(jìn)行了癌細(xì)胞抑制探討，然后對二者協(xié)同抑制作用進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞清除率隨濃度增大而升高。而董麗華等[28]研究發(fā)現(xiàn)隨著茶多酚濃度的升高，Caco-2細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，且在茶多酚濃度為 100 μmol·L-1 時抑制率達(dá)到最高，但隨著時間的延長，Caco-2細(xì)胞的增殖抑制率卻無明顯規(guī)律性改變。因此，本研究進(jìn)一步證明了蕎麥多酚與燕麥多酚對癌細(xì)胞增殖的抑制作用上具有劑量依賴性。

在分別培養(yǎng)24和48 h時間下，48 h出現(xiàn)了顯著下降趨勢，可能受到細(xì)胞周期影響。而Shan等[29]研究結(jié)果表明粟糠的結(jié)合多酚能夠通過減少結(jié)直腸癌CpG島的甲基化來上調(diào)miR-149的表達(dá)，從而誘導(dǎo)G2/M期的細(xì)胞周期停滯，從而增強(qiáng)HCT-8/Fu細(xì)胞的化學(xué)敏感性，證明了多酚具有作為結(jié)直腸癌（CRC）抗MDR劑的潛力。高恩光[30]研究花生紅衣原花青素聯(lián)合白藜蘆醇對Caco-2結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究，說明二者多酚聯(lián)合使用增強(qiáng)了白藜蘆醇阻滯Caco-2細(xì)胞G0/G1期的能力。因此，通過（PI）DNA染色法測定細(xì)胞周期與凋亡蛋白的表達(dá)證實無論是結(jié)合多酚方面還是協(xié)同抑制方面Caco-2細(xì)胞都受到了細(xì)胞周期的影響。

蕎麥和燕麥協(xié)同作用于Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞與多酚的存在形式有關(guān)。本研究在鑒定基礎(chǔ)上，結(jié)合協(xié)同抑制試驗發(fā)現(xiàn)了隨著結(jié)合態(tài)多酚的數(shù)目增多，抑制效果顯著增強(qiáng)。Bonoli等[31]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合酚類化合物的提取率增加時，堿水解消化時間延長，采用溶劑提取法，通過將幾個分光光度指數(shù)與提取物抗氧化相關(guān)聯(lián)，評估每種方法提取率，比較游離酚與結(jié)合酚，證明結(jié)合態(tài)多酚對結(jié)腸癌起到預(yù)防作用。蕎麥和燕麥中多酚化合物的構(gòu)成恰好符合上述模式進(jìn)而二者混合時表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同抑制作用?？赡苡捎谧杂蓱B(tài)多酚主要在人體胃和小腸中被消化吸收而發(fā)揮作用，而結(jié)合態(tài)多酚多以糖苷或酚酸酯形式存在，可完整地通過胃腸到達(dá)人體結(jié)腸部位，在此被分解而發(fā)揮抗氧化作用進(jìn)而對結(jié)腸癌起到預(yù)防作用。

多酚可能通過氧化應(yīng)激途徑對癌細(xì)胞進(jìn)行抑制。根據(jù)da Silva等[32]研究巴西水果Tucum-Do-Cerrado水提物的促氧化作用對結(jié)直腸癌Caco-2細(xì)胞抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多酚誘導(dǎo)了線粒體ROS產(chǎn)生，可作為促氧化劑誘導(dǎo)DNA損傷從而使得細(xì)胞活力下降，其將提取物對癌細(xì)胞進(jìn)行作用，評估ROS的產(chǎn)生、SOD1和SOD2、CAT、GPX1、NFE2L2、HIF1A 和 NOS2的mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力降低，ROS增加其余成分下調(diào)，以癌細(xì)胞特異性方式誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，從ROS和基因表達(dá)調(diào)控探索結(jié)直腸癌Caco-2細(xì)胞抑制。

多酚的協(xié)同作用對癌細(xì)胞抑制有著顯著效果。根據(jù)Yang等[33]研究了木犀草素和3種多酚（槲皮素、芹菜素、對香豆酸）的組合單獨或聯(lián)合評估MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的抗增殖活性，以CI（組合關(guān)系）隨抑制率關(guān)系表現(xiàn)出協(xié)同作用，表明了甘蔗中多酚抑制癌細(xì)胞生長的協(xié)同作用。

綜上所述，燕麥與蕎麥結(jié)合態(tài)多酚共存時通過協(xié)同作用誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，以不同機(jī)制抑制Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞，其抑制作用可能激活了多種抗癌機(jī)制以及相關(guān)通路。對于未來的研究應(yīng)該主要集中在二者協(xié)同作用下對癌細(xì)胞周期對凋亡的影響，氧化應(yīng)激途徑下的誘導(dǎo)凋亡以及激活的信號通路。

4結(jié)論

使用醇提法對蕎麥和燕麥多酚進(jìn)行提取，用液質(zhì)聯(lián)用法對蕎麥和燕麥多酚組分進(jìn)行鑒定，鑒定出來了確定蕎麥和燕麥中主要的多酚化合物組成。采用MTT法分別測定蕎麥和燕麥多酚提取物對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的抑制率以及協(xié)同抑制率，得到燕麥多酚提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2抑制的最佳作用時間是24 h，最佳濃度10.0 mg·mL-1，蕎麥和燕麥協(xié)同抑制結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的最佳組合模式為蕎麥（2.0或3.0 mg·mL-1）+燕麥10.0 mg·mL-1，最佳孵育時間24 h。通過倒置顯微鏡200×狀態(tài) 下觀察不同組多酚48 h后，與對照組相比，隨著蕎麥多酚的濃度增加實驗組（B，C，D）細(xì)胞發(fā)生不同程度的皺縮，結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞抑制力隨著蕎麥濃度的增加而增強(qiáng)。用Annexin-V/PI標(biāo)記法進(jìn)行檢測細(xì)胞凋亡，由流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察得出凋亡圖譜，2.0 mg·mL-1蕎麥+10.0 mg·mL-1燕麥和3.0 mg·mL-1蕎麥+10.0 mg·mL-1燕麥處理，無論早期還是晚期凋亡率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組。

參考文獻(xiàn)：

［1］PIERCE B A. CA： A Cancer Journal for Clinicians[M]. 2012.

[2]BALAN K V， PRINCE J， HAN Z， et al. Antiproliferative activity and induction of apoptosis in human colon cancer cells treated in vitro with constituents of a product derived from Pistacia lentiscus L. var. chia[J]. Phytomedicine， 2007， 14（4）： 263-272.

[3]PASCHALL A V， YANG D F， LU C W， et al. CD133+CD24lo defines a 5-Fluorouracil-resistant colon cancer stem cell-like phenotype[J]. Oncotarget， 2016， 7（48）： 78698-78712.

[4]李暐，杜秉娜，張嶸，等.山柰酚對人結(jié)腸癌SW48細(xì)胞增殖的抑制作用[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2009，26（9）：727-730.

[5]田波，傅穎珺，田亮.槲皮素對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的體外實驗研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012，52（4）：16-21.

[6]徐偉麗，張?zhí)m威，楊鑫，等.γ-生育三烯酚對體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞生長的抑制作用[J].中國糧油學(xué)報，2014，29（1）：47-51.

[7]CHANG H C， HUANG Y C， HUNG W C. Antiproliferative and chemopreventive effects of adlay seed on lung cancer in vitro and in vivo[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2003， 51（12）： 3656-3660.

[8]KUO C C， SHIH M C， KUO Y H， et al. Antagonism of free-radical-induced damage of adlay seed and its antiproliferative effect in human histolytic lymphoma U937 monocytic cells[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2001， 49（3）： 1564-1570.

[9]DING R， MAO Z Y， WANG J L. Synergistic effects of 4-nitrophenol degradation using gamma irradiation combined with a advanced oxidation process[J]. Nuclear Science and Techniques， 2016， 27（1）： 4.

[10]MARINOVA E， TONEVA A， YANISHLIEVA N. Synergistic antioxidant effect of α-tocopherol and myricetin on the autoxidation of triacylglycerols of sunflower oil[J]. Food Chemistry， 2008， 106（2）： 628-633.

[11]KIM S L， KIM S K， PARK C H. Introduction and nutritional evaluation of buckwheat sprouts as a new vegetable[J]. Food Research International， 2004， 37（4）： 319-327.

[12]BONAFACCIA G， MAROCCHINI M， KREFT I. Composition and technological properties of the flour and bran from common and Tartary buckwheat[J]. Food Chemistry， 2003， 80（1）： 9-15.

[13]WJTOWICZ A， KOLASA A， MOS′CICKI L. Influence of buckwheat addition on physical properties， texture and sensory characteristics of extruded corn snacks[J]. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences， 2013， 63（4）： 239-244.

[14]周曉婷，張根義.苦蕎提取物成分分析及不同極性提取物對α-淀粉酶的抑制作用[J].食品科學(xué)，2017，38（18）：42-47.

[15]XING Y M， WHITE P J. Identification and function of antioxidants from oat groats and hulls[J]. Journal of the American Oil Chemists Society， 1997， 74（3）： 303-307.

[16]CHU Y F， WISE M L， GULVADY A A， et al. In vitro antioxidant capacity and anti-inflammatory activity of seven common oats[J]. Food Chemistry， 2013， 139（1/2/3/4）： 426-431.

[17]WALTER M， MARCHESAN E， MASSONI P F S， et al. Antioxidant properties of rice grains with light brown， red and black pericarp colors and the effect of processing[J]. Food Research International， 2013， 50（2）： 698-703.

[18]VERARDO V， ARREZ-ROMN D， SEGURA-CARRETERO A， et al. Identification of buckwheat phenolic compounds by reverse phase high performance liquid chromatography-electrospray ionization-time of flight-mass spectrometry （RP-HPLC-ESI-TOF-MS）[J]. Journal of Cereal Science， 2010， 52（2）： 170-176.

[19]REN Q， WU C S， REN Y， et al. Characterization and identification of the chemical constituents from Tartary buckwheat （Fagopyrum tataricum Gaertn） by high performance liquid chromatography/photodiode array detector/linear ion trap FTICR hybrid mass spectrometry[J]. Food Chemistry， 2013， 136（3/4）： 1377-1389.

[20]朱禮艷.燕麥中活性成分的提取、分離與結(jié)構(gòu)鑒定[D].無錫：江南大學(xué)，2012.

[21]CAI S B， HUANG C， JI B P， et al. In vitro antioxidant activity and inhibitory effect， on oleic acid-induced hepatic steatosis， of fractions and subfractions from oat （Avena sativa L.） ethanol extract[J]. Food Chemistry， 2011， 124（3）： 900-905.

[22]HITAYEZU R， BAAKDAH M M， KINNIN J， et al. Antioxidant activity， avenanthramide and phenolic acid contents of oat milling fractions[J]. Journal of Cereal Science， 2015， 63： 35-40.

[23]DKA O， BRUNORI A， SCHMIDT R， et al. Rutin in buckwheat grain meal determined by UV photoacoustic spectroscopy and HPLC[J]. Nova Biotechnologica et Chimica， 2017， 16（1）： 61-67.

[24]凌阿靜.蕎麥發(fā)芽過程中多酚變化及對HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[D].西安：陜西師范大學(xué)，2017.

[25]胡童霞，張楠，朱鑫麗，等.蕎麥蜂花粉多酚對α-淀粉酶的抑制作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2024，36（6）：930-937.

[26]姚軼俊.蕎麥多酚消化吸收及其對脂質(zhì)代謝調(diào)控機(jī)制研究[D].無錫：江南大學(xué)，2020.

[27]顧金瑞.基于譜效關(guān)系的歐李酚類物質(zhì)抗腫瘤關(guān)鍵成分研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2019.

[28]董麗華，楊鵬春，戴遲兵.茶多酚對人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)，2015，36（1）：50-52.

[29]SHAN S H， LU Y， ZHANG X L， et al. Inhibitory effect of bound polyphenol from foxtail millet bran on miR-149 methylation increases the chemosensitivity of human colorectal cancer HCT-8/Fu cells[J]. Molecular and Cellular Biochemistry， 2021， 476（2）： 513-523.

[30]高恩光.花生紅衣原花青素聯(lián)合白藜蘆醇對CACO-2結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2023.

[31]BONOLI M， VERARDO V， MARCONI E， et al. Antioxidant phenols in barley （Hordeum vulgare L.） flour： comparative spectrophotometric study among extraction methods of free and bound phenolic compounds[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52（16）： 5195-5200.

[32]da SILVA R C， FAGUNDES R R， FABER K N， et al. Pro-oxidant and cytotoxic effects of tucum-do-cerrado （Bactris setosa Mart.） extracts in colorectal adenocarcinoma caco-2 cells[J]. Nutrition and Cancer， 2022， 74（10）： 3723-3734.

[33]YANG Y J， ZHENG R， ZHANG P L， et al. Combination effects of polyphenols present in sugarcane on proliferation in MCF-7 human breast cancer cells[J]. Sugar Tech， 2022， 24（3）： 832-840.

Synergistic Inhibitory Effects of Buckwheat and Oat Polyphenol Extracts on Colon Cancer Caco-2 Cell Proliferation

WANG Xuesong1，ZHANG Yutong1，YANG Wanting1，WANG Xu1，XIE Fengying2，WANG Yan1

（1.College of Food and Biological Engineering， Qiqihar University， Qiqihar 161006， China; 2.School of Food Science， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China）

Abstract：In order to reduce the drug resistance of cancer cells， the fractional identification of buckwheat and oat polyphenol extracts and their synergistic inhibition of colon cancer Caco-2 cell proliferation were investigated by liquid mass spectrometry， MTT and flow cytometry analysis. Ten compounds were identified by high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS）， including （-）-epi-affeocatechin-epicatechin. The inhibitory effect of buckwheat and oat polyphenol extracts on colon cancer Caco-2 cells was shown to increase significantly （Plt;0.01） with increasing concentrations of polyphenol extracts in a range of concentrations， with the inhibitory effect of oat polyphenol extracts being significantly higher than that of buckwheat （Plt;0.05）， and the optimal incubation time was 24 hours for both. Under the combined conditions， buckwheat and oat polyphenol extracts showed synergistic inhibition when the concentration of oats was increased above 6.0 mg·mL-1. The optimal combination of buckwheat （2.0 or 3.0 mg·mL-1） and oats （10.0 mg·mL-1） inhibited the proliferation of colon cancer Caco-2 cells by 47.03% and 50.10%， respectively. Analysis of the apoptosis profiles revealed that not only were the buckwheat and oat groups （C and D） much higher than the control group， the apoptosis rates increased by 3.5% and 6.8%， respectively， compared with the same dose of oats （B）. The results suggest that complementarity between the forms of polyphenolic compounds present in buckwheat and oats can be effective in inducing apoptosis and will contribute to the synergistic inhibition of polyphenolic cancer cell proliferation.

Keywords：buckwheat; oatmeal; polyphenols; colon cancer; synergistic inhibitor

基金項目：2023年度黑龍江省省屬高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費科研項目（145309631）；黑龍江省重點研發(fā)項目（2022ZX02B16）；黑龍江省“百千萬”工程科技重大專項子課題（2021ZX12809-3）。

第一作者：王雪松（1998-），男，碩士研究生，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：1960218739@qq.com。

通信作者：王巖（1982-），男，博士，教授，從事食品功能因子研究與開發(fā)。E-mail：pitwang05@163.com。