【摘要】近年來，薄層色譜在中獸藥的分析和檢驗中的應用越來越廣泛，為中獸藥的真假和優(yōu)劣提供了判斷依據(jù)，但在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)供試品溶液黏性、點樣方式、溫度、相對濕度、蒸氣溶劑、顯色劑和操作等會對薄層色譜產(chǎn)生影響。本文對這些問題產(chǎn)生的原因進行分析，并提出相應的解決措施，為薄層色譜鑒別在中獸藥材及成方制劑的分析和檢驗中的應用提供指導。

【關鍵詞】中獸藥；薄層色譜；因素；對策

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.05.049

Analysis of Influencing Factors of TLC of Traditional Chinese Veterinary Medicine and Its Countermeasures

GAO Hongqian， XU Bin， HAN Chunxiao， LYU Yao

（Liaoning Inspection ，Examination&Certification Centre〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Liaoning Key Laboratory of Livestock Product Safety， Shenyang 110036， China）

Abstract： In recent years， the application of TLC in the analysis and inspection of traditional Chinese veterinary medicine are more and more widely， it provides the basis for judging the authenticity and superiority of traditional Chinese veterinary medicine， but in the process of operation， the influence of viscosity of sample solution，temperature， relative humidity，steam solvent color developing agent and operation on TLC was found， it is believed that TLC identification will play a greater role in the analysis and inspection of traditional Chinese veterinary medicine in prescription and preparations.

Keywords： traditional Chinese veterinary medicine； TLC； factors； countermeasures

薄層色譜鑒別是研究和控制中獸藥材及中獸藥成方制劑質量標準的重要手段之一。其具有靈敏度高、專屬性強、可比性好和方便操作等特點。但在利用薄層色譜技術對中獸藥材和成方制劑進行鑒別檢驗時，比較容易出現(xiàn)精密度差以及重現(xiàn)性不足等問題，從而在一定程度上降低了檢驗結果的準確性，給結果的判斷帶來困難[1]。因此，我們分析影響薄層色譜的因素，并提出相應的解決對策，以提高中獸藥材和成方制劑薄層色譜鑒別檢驗結果的準確性。

1基本方法及原理

薄層色譜法（TLC，thin-layer chromatography）是將固定相吸附劑均勻地涂在玻璃板上制成薄層板。試樣中的各組分在固定相和作為展開劑的流動相之間不斷地發(fā)生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配過程。不同物質上升的距離不同而形成彼此分開的斑點從而達到分離的目的[2]。通過查看同一個薄層色譜上是否存在斑點，以及對斑點的位置和顏色進行對比，能夠準確判斷中獸藥材和成方制劑的真?zhèn)?，并且斑點顏色深淺程度、大小等也能在一定程度上反映出藥品的優(yōu)劣。

2影響因素分析及對策

2.1供試品溶液的黏性問題

第一種情況：因有蔗糖和糊精的影響，用溶劑提取后再經(jīng)過水浴蒸干，之后加入適量的溶劑溶解后，供試品溶液的黏性會變得非常高。這時不但用點樣針很難吸取溶液，而且點在薄層板上后，也很難吸附在薄層板的硅膠上。不管是手動點樣還是儀器點樣，都能看到供試品溶液如葉子上的露珠一般貼在硅膠上。這種情況違背了薄層色譜的原理。第二種情況：對照溶液和供試品溶液點在薄層板上后，溶液溶解在硅膠上，但是受蔗糖和糊精的影響，所用的展開劑不能帶動斑點沿著薄層板上行，導致實驗失敗。第三種情況：因為對照溶液沒有蔗糖和糊精的干擾，能夠隨著展開劑逐漸上行，但是爬行速度慢，所以斑點的位置會低于對照溶液。這將對結果的判斷產(chǎn)生影響，降低了結果的準確性。以板青顆粒的薄層鑒別為例，在同一個薄層板上，精氨酸對照品的斑點位置高于供試品的位置，如圖1所示，1為對照品，2～5為供試品。

解決對策：一是簡化供試品溶液的提取過程，如液體劑型盡量加有機溶劑稀釋，顆粒劑盡量加入有機溶劑溶解，過濾；二是根據(jù)所提取成分的極性來選擇提取溶液，同時還要考慮蔗糖和糊精的影響因素；三是在供試品溶液黏度略高的情況下，建議控制點樣量，一般盡量不超過5μL，這樣可以解決樣品比較黏稠，點樣量又相對比較大時可能出現(xiàn)斑點拖尾以及變形等問題[3]。

2.2點樣方式的影響

1）手動點樣。當點樣量小于5μL時，可以選用定量毛細管，當點樣量在5～20μL時，可以選用微量注射器。手動點樣應少次多量地將溶液點到薄層板上，如果上一次點的溶液沒有干透，又繼續(xù)在薄層板的同一個位置點溶液，就會讓斑點越來越大，進而產(chǎn)生拖尾等現(xiàn)象。《中國獸藥典》（2020版）二部關于點樣的規(guī)定是：圓點一般不大于4 mm，高效板一般不大于2 mm，所以采用手動點樣時，不僅要少量多次，還要注意圓點的大小，要盡可能地使每次點樣的中心重合，并且在點樣過程中不要因為多次點樣而把硅膠表面劃傷和刮破。

2）儀器點樣。選用半自動點樣儀或全自動點樣儀，設定好單次的點樣量，通過連通的氮氣吹干斑點，這樣點在薄層板上的斑點規(guī)整且一致。此外，實驗人員可以根據(jù)實驗的要求和供試品溶液的狀態(tài)來選擇斑點形狀和長短，包括條帶狀斑點的長度和寬度。

2.3溫度的影響

展開時溫度的改變首先會影響Rf值，其次影響分離度，嚴重時甚至導致分離失敗[4]。溫度會影響展開劑中有機溶劑在硅膠上的爬行速度。特別是在分配層析中，溫度直接影響分配系數(shù)，并影響展開劑中溶劑的組成比例。而有機相中水的含量會隨著溫度的改變而發(fā)生明顯變化。展開溫度相差較大會對薄層色譜的質量產(chǎn)生不同程度的影響如圖2所示。

從圖2所顯示的結果可以看出，溫度對薄層色譜展開的影響是非常明顯的，不容忽視。對于溫度的影響，我們可以通過加熱或制冷設備來控制實驗環(huán)境的溫度保持恒定。

2.4相對濕度的影響

相對濕度主要影響的是薄層板的吸附能力。把活化后的薄層板從干燥器中取出，從點樣到展開的整個過程中，薄層板都是直接裸露在實驗室的環(huán)境中，因此薄層板的活性很大程度上取決于實驗室空氣的相對濕度。通常薄層板的重現(xiàn)性差不僅與實驗方法有關，還與操作環(huán)境的相對濕度密切相關。在其他條件基本相同的情況下，相對濕度對薄層色譜展開的影響是顯而易見的。這不僅體現(xiàn)在不同實驗室之間，即使在同一實驗室內(nèi)，不同季節(jié)的濕度變化也可能導致結果的差異。因此，我們要采取適當?shù)拇胧﹣砜刂茖嶒灜h(huán)境的相對濕度。例如，在雙槽展開缸的一側放入適當濃度的硫酸溶液，再將薄層板放在另一側的槽中，密閉放置15～30 min，然后立即將薄層板放置在有展開劑的一側進行展開。全自動展開設備一般采用的是飽和鹽溶液來調(diào)節(jié)和控制相對濕度的恒定。

2.5溶劑蒸氣的影響

薄層色譜展開劑的蒸氣相在展開缸中也參與色譜展開，它和液相（展開劑）、固定相（吸附劑）一起構成了一個三維層析過程。薄層色譜的展開方式分為三種：1）在展開缸中加入展開劑后直接放入薄層板展開的；2）展開劑（或規(guī)定的溶劑）蒸汽在展開缸中預平衡一定時間再行展開的；3）展開劑（或規(guī)定的溶劑）蒸氣在展開缸中達到飽和后再展開的。因此，溶劑蒸氣在薄層色譜展開中起著重要的作用。例如，黃連解毒散中黃連生物堿的薄層鑒別屬于展開方式的第三種情況，其展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）[5]，其中濃氨溶液實際上起著雙重作用。若氨是以蒸氣相在薄層板上預吸附參與生物堿的分離，在液相（展開劑）中起作用的是水；若氨蒸氣濃度不夠，則分離度明顯降低；若展開前不用氨蒸氣預飽和而直接展開，則各生物堿斑點的位置偏低，所以Rf值偏小，造成黃連對照藥材和供試品的四個斑點只能看到兩個，難以分開。具體如圖3所示，圖中1為鹽酸小檗堿對照品；2為黃連對照藥材；3～6為供試品。為了避免溶劑蒸氣的影響，在做黃連生物堿薄層色譜時，使用的濃氨試液最好是新開瓶的或是開瓶不久的，這樣在展開缸中氨蒸氣才會達到飽和的狀態(tài)，對黃連生物堿的分離起到?jīng)Q定性的作用。

2.6顯色劑的影響

薄層板在展開、晾干后，有的可以在日光下直接觀察，有的需要在紫外光燈254 nm和365 nm下觀察，有的則需要噴顯色劑后再進行觀察。理想的顯色劑應該靈敏度高，可以使斑點顏色穩(wěn)定，斑點與背景間的對比較明顯，而且斑點的大小和顏色的深淺度與所需要檢測物質的含量成正比。薄層色譜的顯色方式有噴霧顯色、浸漬顯色和蒸氣熏蒸顯色等[6]。最常用的是噴霧顯色。它是用噴霧瓶把顯色劑以氣溶膠的形式均勻地噴在薄層板上。如果顯色劑是以水滴的形式噴在薄層板上，則很難分辨對照和供試品的斑點是否在相同的位置上顯現(xiàn)相同顏色的斑點，影響了結果的準確性。另一個問題是，對于噴完顯色劑需要加熱的薄層板，需要注意加熱的時間和溫度。尤其是采用羧甲基纖維素鈉為黏合劑制備的薄層板，噴了含有硫酸溶液的顯色劑，若加熱溫度過高或加熱時間太長，容易造成薄層板面炭化，就是我們俗稱的“糊了”，所以盡量選擇在（105±5）℃加熱，然后在烘箱旁隨時觀察，防止薄層板炭化，影響結果的準確性。

2.7人員操作方面的影響

在對中獸藥材和成方制劑進行薄層色譜鑒別的檢驗時，除了儀器、所用試劑和薄層板的質量外，檢驗員也是影響因素之一。第一，如果檢驗員的實驗操作流程不符合規(guī)范或是使用的檢驗方法不正確，將導致難以判斷檢驗結果。第二，如果檢驗員沒有豐富的實驗操作經(jīng)驗，會出現(xiàn)斑點呈念珠狀等薄層色譜檢驗常見的問題，也會對實驗結果的準確性產(chǎn)生影響。為了消除人員操作方面的影響，除了安排具有豐富檢驗經(jīng)驗的檢驗員做相關工作外，還應該定期對檢驗員進行實驗操作的培訓和考核，及時發(fā)現(xiàn)問題并解決。除此之外，還應該要求檢驗員嚴格要求自己，按照相關的檢驗標準和流程進行檢驗，盡可能地減少人為因素對實驗結果的影響，以達到提高檢驗結果準確性的目的。

3結束語

除上述影響因素外，薄層板的黏合劑和品牌的不同、試劑和耗材的質量等也會對薄層色譜質量有一定的影響。隨著薄層技術的日益發(fā)展，操作流程越來越規(guī)范，儀器自動化程度不斷提高，薄層色譜鑒別將在中獸藥材及成方制劑中的分析和檢驗發(fā)揮更大的作用。

【參考文獻】

[1]孫楠.中藥及中成藥薄層色譜鑒別檢驗相關問題的探討[J].臨床醫(yī)藥文獻電子雜志，2017，4（27）：5290.

[2]國家藥典委員會.中國藥典分析檢測技術指南[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2017：160.

[3]劉愛香.中藥及中成藥薄層色譜鑒別檢驗中的問題分析[J].光明中醫(yī)，2018，33（22）：3437-3439.

[4]韓立.中藥顯微鑒別和薄層色譜彩色圖集[M].鄭州：河南科學技術出版社，2018.

[5]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（二部）[M].2020版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2020：739.

[6]獸用中藥檢驗員：NY/T 2807—2015[S].

【作者簡介】

高紅倩，女，1984年出生，學士，研究方向為畜牧，中獸藥。

（編輯：于淼）