【摘要】隨著抗菌藥物種類增多和抗生素處方數(shù)量的增加，廣泛的抗菌素耐藥性傳播成了一個(gè)日益嚴(yán)重的衛(wèi)生保健問(wèn)題，對(duì)細(xì)菌感染的有效治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。目前，對(duì)于耐藥性檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性判斷控制的研究相對(duì)較少。本文從人員、設(shè)施與環(huán)境、設(shè)備和試劑、樣本采集及運(yùn)送、檢驗(yàn)過(guò)程和檢驗(yàn)后過(guò)程6個(gè)方面，對(duì)動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室需要注意的質(zhì)量控制問(wèn)題進(jìn)行了詳細(xì)的講解，不僅保證了實(shí)驗(yàn)達(dá)到生物安全的要求，同時(shí)也保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)可靠。為不同實(shí)驗(yàn)室間實(shí)驗(yàn)過(guò)程的準(zhǔn)確度、試劑的可靠性和操作的正確性提供了指導(dǎo)方向，為后續(xù)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析提供了準(zhǔn)確、合理、規(guī)范的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，進(jìn)而能夠真實(shí)反映耐藥性現(xiàn)狀的要求。

【關(guān)鍵詞】耐藥性；質(zhì)量控制；動(dòng)物源

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.05.037

Quality Control Requirements for Antibiotic Resistance Testing Laboratories of Animal Derived Bacteria

HAN Juanzhu， LI Xinnan， QIU Yue， SUN Yuanyuan， GUO Yucui， SU Weiyi

（Liaoning Inspection， Examination & Certification Centre〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Liaoning Key Laboratory of Livestock Product Safety， Shenyang 110036， China）

Abstract： With the increase in the variety of antibiotics and the number of antibiotic prescriptions， the widespread spread of antibiotic resistance has become an increasingly serious healthcare problem， posing great challenges to the effective treatment of bacterial infections. There is relatively little research on the accuracy judgment and control of antibiotic resistance monitoring results. This article provides a detailed explanation of the quality control issues that need to be paid attention to in antibiotic resistance testing laboratories of animal derived bacterial resistance from six aspects： personnel， facilities and environment， equipment and reagents， sample collection and transportation， testing process， and post testing process. This not only ensures that biological safety requirements are met during the experimental process， but also ensures the authenticity and reliability of data. This provides guidance on the accuracy of inter laboratory testing processes， the reliability of reagents， and the correctness of operations， providing accurate， reasonable， and standardized basic data for subsequent data statistical analysis， in order to achieve the requirement of truly reflecting the current situation of drug resistance.

Keywords： antibiotic resistance； quality control； animal origin

為了提高動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室（以下簡(jiǎn)稱“實(shí)驗(yàn)室”）質(zhì)量控制能力，我們以《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》《檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評(píng)審準(zhǔn)則》《農(nóng)業(yè)部產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試機(jī)構(gòu)基本條件》為基本原則，結(jié)合世界各國(guó)先進(jìn)管理經(jīng)驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)室角度對(duì)該過(guò)程相關(guān)因子的真實(shí)性和準(zhǔn)確性制定規(guī)范準(zhǔn)則。該規(guī)范準(zhǔn)則涵蓋了實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程，包括前期、中期和后期，以及動(dòng)態(tài)影響因子（人員和環(huán)境）和靜態(tài)影響因子（設(shè)備、設(shè)施和方法學(xué)）。

1人員

從事耐藥性檢測(cè)的人員應(yīng)滿足《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》中“6.2人員”、《檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評(píng)審準(zhǔn)則》中第九條、《農(nóng)業(yè)部產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試機(jī)構(gòu)基本條件》中“第二章機(jī)構(gòu)與人員”的相關(guān)要求。耐藥性檢測(cè)負(fù)責(zé)人還應(yīng)具有獨(dú)立簽發(fā)藥物敏感性檢驗(yàn)報(bào)告的能力。耐藥性檢測(cè)人員應(yīng)具備微生物檢驗(yàn)、生物安全相關(guān)理論知識(shí)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，能夠正確使用耐藥監(jiān)測(cè)系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)上報(bào)，并具有對(duì)耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析總結(jié)的能力。耐藥性檢測(cè)人員應(yīng)相對(duì)固定，數(shù)量可以滿足工作需要。新員工或長(zhǎng)時(shí)間不從事該方面檢驗(yàn)人員應(yīng)經(jīng)相應(yīng)崗位能力評(píng)估合格后方可獨(dú)立操作。檢測(cè)人員每年需參加專業(yè)學(xué)習(xí)，包括自行組織學(xué)習(xí)、線上學(xué)習(xí)、外出學(xué)習(xí)等形式。

2設(shè)施與環(huán)境

2.1設(shè)計(jì)原則

實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)參照GB 50346—2011《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》、GB 19489—2008《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》、NY/T 1948—2010《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求通則》和WHO《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》，遵循科學(xué)的設(shè)計(jì)理念，合理選址、規(guī)范布局、流程通暢、設(shè)計(jì)先進(jìn)。

實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)要符合生物安全法的理念，保證生物安全性，確保實(shí)驗(yàn)室人員及環(huán)境的安全；要結(jié)合現(xiàn)有條件合理規(guī)劃，既保證功能齊全達(dá)到檢測(cè)要求，又能經(jīng)濟(jì)實(shí)用營(yíng)造舒適的檢測(cè)環(huán)境；要有適當(dāng)超前原則，在空間上留有發(fā)展余地；布局上要體現(xiàn)出專業(yè)特征，便于控制、操作和管理。

2.2布局

實(shí)驗(yàn)室可采用常壓和負(fù)壓兩種狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)室。常壓狀態(tài)實(shí)驗(yàn)室主要用于培養(yǎng)基制備、生化鑒定、血清分型及藥敏試驗(yàn)和濕熱干熱滅菌消毒等；負(fù)壓狀態(tài)實(shí)驗(yàn)室的生物安全防護(hù)性能高于常壓狀態(tài)實(shí)驗(yàn)室，其主要用于細(xì)菌的分離純化、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)、真菌檢測(cè)等。

2.3設(shè)施

實(shí)驗(yàn)室可以設(shè)置在共用建筑物內(nèi)，但應(yīng)相對(duì)獨(dú)立。入口處應(yīng)有對(duì)應(yīng)等級(jí)的生物安全黃色警告防護(hù)標(biāo)識(shí)、標(biāo)明負(fù)責(zé)人、聯(lián)系電話等。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部布局應(yīng)滿足微生物實(shí)驗(yàn)室基本要求，配備實(shí)驗(yàn)操作區(qū)域、人員緩沖區(qū)域和物品清潔區(qū)域；物流、人流不應(yīng)出現(xiàn)重疊；操作間的門應(yīng)配有玻璃窗，并且門能夠自動(dòng)感應(yīng)；大門需配有門禁卡。

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部空氣流通可以使用自然風(fēng)，同時(shí)配備防蚊蟲(chóng)紗窗。當(dāng)使用器械人工通風(fēng)時(shí)，通風(fēng)系統(tǒng)應(yīng)獨(dú)立于公共的中央空調(diào)系統(tǒng)，以防污染。采用內(nèi)部循環(huán)排風(fēng)系統(tǒng)的生物安全柜，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備通風(fēng)換氣裝置；采用管道排風(fēng)式生物安全柜，實(shí)驗(yàn)室的排風(fēng)系統(tǒng)要求獨(dú)立安裝，不應(yīng)與公共通風(fēng)系統(tǒng)相連。另外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和儀器管理辦法，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)必須配備足夠數(shù)量的洗手池。洗手池要位于實(shí)驗(yàn)操作區(qū)域出口處，并配有腳踏式、長(zhǎng)手柄式或自動(dòng)感應(yīng)式洗手龍頭，同時(shí)配備消毒設(shè)施，包括洗手液、消毒皂液、新潔爾滅等，特殊時(shí)期配備快速手部消毒液。另外，耐藥性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作區(qū)內(nèi)應(yīng)安裝足夠數(shù)量的洗眼設(shè)備，重點(diǎn)區(qū)域配備應(yīng)急噴淋裝置。

3設(shè)備和試劑

3.1設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備的設(shè)備包括：二級(jí)生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、低溫冰箱、超低溫冰箱、光學(xué)顯微鏡、比濁儀、高壓滅菌器、細(xì)菌鑒定儀、菌液接種儀、定量PCR儀、基質(zhì)輔助激光解吸電離-微生物質(zhì)譜、細(xì)菌藥敏結(jié)果分析儀等。各種設(shè)備應(yīng)定期做好驗(yàn)證、檢定或校準(zhǔn)，做好維護(hù)和使用記錄；對(duì)于溫度依賴的儀器，要做好溫度監(jiān)控記錄；對(duì)于壓力容器要每個(gè)滅菌包外貼化學(xué)指示膠帶，定期進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)。

3.2試劑

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備的試劑包括：在細(xì)菌分離及鑒定過(guò)程中涉及的培養(yǎng)基，藥敏實(shí)驗(yàn)的菌株等。購(gòu)買的培養(yǎng)基、試劑及試劑盒要按照GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》、SN/T 1538.1—2016《培養(yǎng)基制備指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則》和SN/T 1538.2—2016《培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能測(cè)試實(shí)用指南》要求進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證后分類存儲(chǔ)，并建立清單。培養(yǎng)基的配制和使用應(yīng)及時(shí)進(jìn)行記錄。對(duì)使用中的試劑制定管理辦法，包括質(zhì)量控制周期和檢測(cè)方法。對(duì)于染色劑，使用頻率高時(shí)每周用陽(yáng)性和陰性質(zhì)控菌株檢測(cè)，使用頻率低時(shí)，每次實(shí)驗(yàn)用陽(yáng)性和陰性質(zhì)控菌株檢測(cè)；對(duì)于血清試劑，每次實(shí)驗(yàn)時(shí)做多價(jià)血清陽(yáng)性和陰性質(zhì)控。

藥敏試驗(yàn)應(yīng)選用標(biāo)準(zhǔn)菌株，確保檢測(cè)結(jié)果的溯源性和穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)室需要建立完善的記錄文件，包括標(biāo)準(zhǔn)菌株臺(tái)賬、標(biāo)準(zhǔn)菌株使用記錄、標(biāo)準(zhǔn)菌株傳代記錄、標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證記錄、標(biāo)準(zhǔn)菌株期間核查、標(biāo)準(zhǔn)菌株銷毀記錄等。

在菌種保藏和分類鑒定中，要核查菌種質(zhì)量，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)團(tuán)、污染或泄漏要立即重新保存。對(duì)菌種的操作要有詳細(xì)的記錄，要做到每一步實(shí)驗(yàn)有記錄可查。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備基本的標(biāo)準(zhǔn)菌株，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株F1代要在-80℃保存，儲(chǔ)備菌株F2代在-20℃多管保存，工作菌株F3～F5代在4℃冰箱斜面或平板保存。

4樣本采集及運(yùn)送

4.1樣本來(lái)源的確定

對(duì)于彎曲菌屬腸球菌屬和腸桿菌屬，樣本主要來(lái)自養(yǎng)殖場(chǎng)或屠宰場(chǎng)，對(duì)象為雞或豬的糞便；對(duì)于葡萄球菌屬，樣本只針對(duì)生鮮乳；對(duì)于寵物源大腸桿菌和腸球菌，樣品主要來(lái)自動(dòng)物醫(yī)院的寵物犬或貓。樣本的代表性通過(guò)以下方法來(lái)得到保證：一個(gè)圈舍只收集1株一種菌，一個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的樣本分離獲得的菌株收集不超過(guò)10株，致病菌收集不超過(guò)5株。

4.2采樣單填寫(xiě)

詳細(xì)填寫(xiě)NY/T 4141—2022《動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)樣品采集技術(shù)規(guī)程》中采樣單內(nèi)容，填寫(xiě)預(yù)防用抗生素藥的種類與藥物使用方式、治療用抗生素藥物的種類與藥物使用方式，有特殊情況要詳細(xì)注明。

4.3樣品的運(yùn)輸

在運(yùn)輸中要選用合適的運(yùn)送培養(yǎng)基。對(duì)于大腸桿菌、腸球菌的拭子使用商業(yè)化的運(yùn)輸培養(yǎng)基即可；沙門氏菌的盲腸和金黃色葡萄球菌的生鮮牛乳不需要運(yùn)送培養(yǎng)基；彎曲菌最好是在采樣現(xiàn)場(chǎng)直接涂布到分離培養(yǎng)基中。運(yùn)輸溫度盡量保證在4℃左右，24 h內(nèi)盡快到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，如若無(wú)法準(zhǔn)時(shí)到達(dá)，最多延長(zhǎng)到72 h。

4.4樣本接收耐藥性

實(shí)驗(yàn)室對(duì)收到的樣本要進(jìn)行手寫(xiě)或電腦登記，主要記錄樣本接錄時(shí)間，同時(shí)粗略判斷樣本狀態(tài)，對(duì)于腐爛變質(zhì)和不符合運(yùn)輸要求的樣本不能接收。

5檢驗(yàn)過(guò)程

目前，耐藥性實(shí)驗(yàn)中對(duì)抗生素敏感性測(cè)試的方法主要有E-test法、肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法和紙片擴(kuò)散法等。在這些方法中，肉湯稀釋法的結(jié)果綜合性評(píng)定結(jié)果最好，建議實(shí)驗(yàn)室以微量肉湯稀釋法為主，快速檢測(cè)時(shí)可采用E-test法等。動(dòng)物源細(xì)菌分離純化及耐藥性檢測(cè)依據(jù)NY/T 4149—2022《動(dòng)物源大腸埃希菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程》、NY/T 4147—2022《動(dòng)物源腸球菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程》、NY/T 4146—2022《動(dòng)物源沙門氏菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程》、NY/T 4145—2022《動(dòng)物源金黃色葡萄球菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程》、NY/T 4148—2022《動(dòng)物源彎曲桿菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程》、NY/T 4142—2022《動(dòng)物源細(xì)菌抗菌藥物敏感性測(cè)試技術(shù)規(guī)程微量肉湯稀釋法》等標(biāo)準(zhǔn)。每次進(jìn)行藥敏檢測(cè)時(shí)，都需要跟隨質(zhì)控菌株重復(fù)3～4次，保證結(jié)果的可靠性。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定人員比對(duì)質(zhì)量控制程序，由多名技術(shù)人員進(jìn)行專業(yè)性強(qiáng)檢驗(yàn)項(xiàng)目的考核和比較，定期對(duì)工作人員技能素質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，保證檢驗(yàn)結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性，同時(shí)還要參加實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)。參加實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)和能力驗(yàn)證不僅是對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力和分析能力的評(píng)判，也是對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制效果的考察，更是發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)誤差和標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室的比對(duì)。通過(guò)參加能力驗(yàn)證活動(dòng)，證實(shí)實(shí)驗(yàn)室對(duì)耐藥性監(jiān)測(cè)程序和方法的有效控制，提高實(shí)驗(yàn)室可信度，完善實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系。同時(shí)參加實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)可確定各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行某些項(xiàng)目檢測(cè)的能力，以及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室耐藥性監(jiān)測(cè)的持續(xù)能力，有利于實(shí)驗(yàn)室技術(shù)水平的提高。耐藥性實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)能力驗(yàn)證或者不同耐藥性實(shí)驗(yàn)室之間質(zhì)量評(píng)估的原始記錄、結(jié)果和證書(shū)要實(shí)時(shí)留存，為實(shí)驗(yàn)室能力體現(xiàn)提供證明。

6檢驗(yàn)后過(guò)程

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定合理和完善的衛(wèi)生管理制度、廢棄物管理制度、菌種保藏制度、數(shù)據(jù)結(jié)果上報(bào)制度，以確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求規(guī)范。檢驗(yàn)后的樣本、污染培養(yǎng)基等廢棄物應(yīng)采取合理處理，然后投入指定的容器內(nèi)，經(jīng)無(wú)害化處理后方可廢棄，以防對(duì)環(huán)境和人員造成危害，以及引起病原微生物的傳播。分離純化獲得的耐藥性菌株應(yīng)遵照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》要求，對(duì)菌種、菌株、菌粉制定保管要求，并按規(guī)定嚴(yán)格實(shí)施，控制好菌種、菌株、菌粉。

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【作者簡(jiǎn)介】

韓鐫竹，女，1985年出生，高級(jí)畜牧師，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物源細(xì)菌耐藥性。

（編輯：劉一童）