摘要:為明確云南省昆明市西洋杜鵑葉斑病病原菌的分類地位、生物學(xué)特性及其有效防控藥劑,以西洋杜鵑葉斑病病葉為試驗(yàn)材料,采用組織分離法分離病原菌,通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證其致病性,聯(lián)合形態(tài)學(xué)與多基因序列(ITS、TEF-1、TUB2)分析鑒定病原菌種類,并對(duì)其主要生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定。采用菌絲生長(zhǎng)速率法分析5種藥劑對(duì)病原菌的抑制效果。結(jié)果表明,從云南省西洋杜鵑葉斑病病葉組織中分離得到1種致病菌,將其回接到健康植株上,接種后的葉片病癥較為明顯,葉片生成黃褐色病斑,嚴(yán)重時(shí)脫落,與田間癥狀一致。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果將其鑒定為棒孢新擬盤(pán)多毛孢(Neopestalotiopsis clavispora)。該病原菌菌絲體生長(zhǎng)的最適溫度為25 ℃,最適pH值為7,甘露醇和蛋白胨分別為其最適碳源、氮源;在供試的5種化學(xué)藥劑中,苯醚甲環(huán)唑的抑菌效果較好,EC50為 0.020 0 mg/mL。
關(guān)鍵詞:杜鵑;葉斑病;病原鑒定;生物學(xué)特性;殺菌劑
中圖分類號(hào):S436.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號(hào):1002-1302(2024)16-0155-06
杜鵑(Rhododendron simsii)是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一,又稱映山紅、滿山紅和山石榴等,為杜鵑花科杜鵑屬植物,約有1 000種,多數(shù)種集中在亞洲。我國(guó)既是杜鵑花的重要發(fā)源地,也是世界杜鵑花分布中心,其中以云南、四川、貴州和西藏為主要分布區(qū)[1]。杜鵑擁有很高的價(jià)值:(1)藥用價(jià)值。杜鵑全株供藥用,可治療咳嗽多痰、慢性支氣管炎、高血壓、冠心病等疾?。?]。(2)觀賞價(jià)值。杜鵑枝繁葉茂,花色艷麗,花期長(zhǎng),根樁奇特,是優(yōu)良的盆景材料和綠化植物;萌發(fā)力強(qiáng),耐修剪,可作為矮墻或屏障,是花籬的良好材料。(3)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。杜鵑葉、花可入藥或提取芳香油,皮、葉可提制烤膠。(4)生態(tài)價(jià)值。高山杜鵑根系發(fā)達(dá),是很好的水土保持植物。
云南省擁有豐富的杜鵑資源,是我國(guó)重要的杜鵑花資源集中地和主產(chǎn)區(qū),其品種占全國(guó)品種的一半以上,其資源利用及產(chǎn)業(yè)化已形成一定規(guī)模[2]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于杜鵑的研究較多,但大多是關(guān)于植物育種繁殖、資源調(diào)查或者脅迫方面。近年來(lái),由于人類活動(dòng)和環(huán)境氣候變化等原因,杜鵑病害加劇泛濫,新的致病菌不斷被報(bào)道出,從致病部位角度看,主要集中在葉片病害、根部病害、莖及枝干病害等。關(guān)于杜鵑病害研究報(bào)道較多的是枯梢病、莖腐病、根腐病等危害植株根或枝干的病害,以及炭疽病、葉斑病、葉腫病等感染杜鵑花葉片致病的病害[2-8]。本研究主要針對(duì)西洋杜鵑楊梅紅葉斑病,通過(guò)鑒定病害病原,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定,研究病原菌的最適生長(zhǎng)條件;通過(guò)研究5種常用殺菌劑的防治效果,為治理西洋杜鵑楊梅紅葉斑病提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 供試材料
供試植物:感病西洋杜鵑楊梅紅葉斑病病葉于2022年8月23日采自西南林業(yè)大學(xué)白龍校區(qū)(25°00′N,102°44′E),病株表現(xiàn)為部分葉片出現(xiàn)不同程度的紅褐色病斑,嚴(yán)重時(shí)葉片掉落、枝葉干枯(圖1-a)。
供試藥品:10%腈菌唑可濕性粉劑,25%多菌靈可濕性粉劑,80%代森錳鋅可濕性粉劑,45%石硫合劑結(jié)晶粉,10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑,均購(gòu)自北京中保綠農(nóng)科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 病原菌分離純化
使用組織分離法,將病葉消毒晾干,從葉片病健交界處獲取5 mm×5 mm左右的組織,接種到PDA平板中,倒置在28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi),3 d后挑取病葉附近的菌絲純化,純化3~5次后獲得6株純菌株。
1.2.2 病原菌致病性測(cè)定
離體回接:采取同植株健康無(wú)病、生長(zhǎng)良好的葉片,表面消毒后晾干備用。用5 mm打孔器取培養(yǎng)7 d 的菌餅,菌絲面直接覆蓋于用滅菌針刺破的葉片傷口處,放置于保濕培養(yǎng)皿,以無(wú)菌PDA為空白對(duì)照。觀察記錄接種情況,7 d 后用組織分離法從發(fā)病的葉片分離病原菌,得到病原菌DJ-2。
活體回接:將分離純化得到的病原菌打取6個(gè)菌餅(直徑d=5.0 mm),接種于150 mL PDB溶液中,放置于轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱搖培7 d。將制備好的菌液均勻噴灑在健康植株葉片上,覆上黑色塑料膜避光保濕,用PDB溶液作對(duì)照處理。
1.2.3 病原菌鑒定
形態(tài)鑒定:采用玻片培養(yǎng)法對(duì)純化得到的菌株進(jìn)行培養(yǎng)觀察,將察氏培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿,厚度約為1 mm,用解剖刀在凝固好的培養(yǎng)基劃1.5 cm×1.5 cm的方塊,并放置在載玻片上,挑取病原菌菌絲接種在方塊邊緣,蓋上蓋玻片,放置在保濕培養(yǎng)皿中。28 ℃培養(yǎng)4~7 d,長(zhǎng)出菌絲后,在顯微鏡下觀察并拍照記錄分生孢子形態(tài)、大小和著生方式等特征。將觀察結(jié)果與已報(bào)道的病原菌進(jìn)行比較,并進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。
分子生物學(xué)鑒定:采用真菌DNA抽提試劑盒提取病菌DNA,以真菌總DNA為模板擴(kuò)增ITS、TUB2和TEF-1基因序列,所用引物見(jiàn)表1。ITS擴(kuò)增體系:12.5 μL MIX,9.5 μL雙蒸水,1 μL ITS1,1 μL ITS4,1 μL DNA。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,52 ℃退火45 s,72 ℃延伸50 s,循環(huán)35次;最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。其他引物擴(kuò)增體系:15 μL MIX,12 μL雙蒸水,正反引物各 1 μL,1.2 μL DNA。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性 40 s,52 ℃或55 ℃退火45 s(退火溫度視情況而定),72 ℃延伸1 min,循環(huán)34次;最后72 ℃延伸 10 min,4 ℃保存[9]。把擴(kuò)增后的序列送至北京擎科生物科技股份有限公司測(cè)序,獲得的測(cè)序結(jié)果在NCBI官網(wǎng)進(jìn)行BLAST比對(duì),并參考文獻(xiàn)篩選出相關(guān)菌株序列。用MEGA7的最大似然法(maximum-likelihood,ML),設(shè)置Bootstrap值為 1 000,進(jìn)行Bootstrap校驗(yàn),構(gòu)建真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),確定病原菌種類。
1.2.4 生物學(xué)特性
溫度篩選試驗(yàn):設(shè)置5、15、25、35、45 ℃共5個(gè)溫度,用打孔器在菌落邊緣打取直徑為 5 mm 的菌餅,將其置于新的PDA平板中央,倒置在25 ℃培養(yǎng)箱下恒溫培養(yǎng)[10]。每處理設(shè)3次重復(fù),分別在培養(yǎng)5、7 d時(shí),采用十字交叉法測(cè)得菌落直徑并計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速率。菌絲平均生長(zhǎng)速率=(培養(yǎng)7 d菌落直徑平均值-培養(yǎng)5 d菌落直徑平均值)/2。
pH值篩選試驗(yàn):用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH對(duì)PDA培養(yǎng)基pH值進(jìn)行調(diào)整,設(shè)置4、5、6、7、8、9、10共7個(gè)pH值梯度。每處理設(shè)3次重復(fù),培養(yǎng)及測(cè)量數(shù)據(jù)方法同上。
碳源篩選試驗(yàn):將察氏培養(yǎng)基中的蔗糖分別用等質(zhì)量的葡萄糖、麥芽糖、D-木糖、可溶性淀粉和甘露醇進(jìn)行替換,制成不同的碳源培養(yǎng)基。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù),以不加碳源的察氏培養(yǎng)基為對(duì)照,培養(yǎng)及測(cè)量數(shù)據(jù)方法同上。
氮源篩選試驗(yàn):在不加氮源的察氏培養(yǎng)基中分別加入硝酸鈉、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨和氯化銨各20 g,制成不同的氮源培養(yǎng)基。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù),以不加氮源的察氏培養(yǎng)基為對(duì)照,培養(yǎng)及測(cè)量數(shù)據(jù)方法同上。
1.2.5 藥劑篩選
采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定病原菌對(duì)5種供試殺菌劑的敏感性,將苯醚甲環(huán)唑、石硫合劑、多菌靈、腈菌唑和代森錳鋅分別設(shè)置1 000、1 500、2 000、2 500、5 000倍液5個(gè)濃度梯度(有效濃度見(jiàn)表2),制成含藥平板,含藥體積比1 ∶10。以無(wú)菌水為對(duì)照,每個(gè)濃度梯度重復(fù)3次,25 ℃倒置暗培養(yǎng)7 d。采用十字交叉法測(cè)定菌落生長(zhǎng)直徑,記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算不同濃度梯度下殺菌劑的抑菌率[23]。以防治藥劑濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),抑制率的生物統(tǒng)計(jì)概率值為縱坐標(biāo),繪制毒力回歸方程,并計(jì)算有效中濃度(EC50),比較不同防治藥劑的相對(duì)抑制效果。
1.3 數(shù)據(jù)分析
采用DPS和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,應(yīng)用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。
2 結(jié)果與分析
2.1 致病性測(cè)定
在離體回接中,將從西洋杜鵑楊梅紅葉斑病病葉樣品上分離得到的6株純菌株,回接到健康植株葉片上發(fā)現(xiàn),DJ-2菌株接種5~7 d開(kāi)始顯示病癥,回接后的葉片開(kāi)始出現(xiàn)褐色病斑,從傷口處向外擴(kuò)增直至蔓延整個(gè)葉片(圖1-c),與采集的病癥一致。在活體回接中,西洋杜鵑楊梅紅在接種5~7 d 后開(kāi)始出現(xiàn)癥狀,葉片出現(xiàn)褐色病斑,開(kāi)始萎縮(圖1-e)。接種10 d左右,葉片出現(xiàn)干枯死亡脫落的現(xiàn)象(圖1-f)。
2.2 病原菌鑒定
形態(tài)鑒定:菌絲白色,菌落圓形具輪紋,逐層向外生長(zhǎng)。氣生菌絲濃密呈絮狀,白色至灰白色,背面淡黃色。分生孢子長(zhǎng)梭形,分生孢子有4個(gè)橫隔5個(gè)細(xì)胞,中間3個(gè)細(xì)胞顏色較深,為褐色,兩端細(xì)胞均為透明三角[10]。
分子鑒定:利用ITS、TEF-1、TUB2引物擴(kuò)增病原菌DJ-2的rDNA-ITS區(qū)間、TEF-1區(qū)間和TUB2區(qū)間序列,測(cè)序后分別獲得 560、469、934 bp 的基因片段。在NCBI的GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì),病原菌DJ-2與已知模式屬的最大相似性達(dá)到了99%,說(shuō)明新分離菌株的科學(xué)分類地位比較明確。選用同源性較高的菌株序列作為參比對(duì)象,利用MEGA 7的鄰接法(NJ)合并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果表明,DJ-2與棒孢新擬盤(pán)多毛孢(Neopestalotiopsis clavispora)聚集在同一分支上(圖3)?;谛螒B(tài)鑒定與多基因系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果,進(jìn)一步證實(shí)了病原菌DJ-2為棒孢新擬盤(pán)多毛孢,并將DJ-2序列上傳NCBI,獲得登錄號(hào)OR086090、OR257737、OR257736。
2.3 病原菌的生物學(xué)特性
菌株DJ-2的適宜生長(zhǎng)溫度范圍為5~35 ℃,在低溫5 ℃條件下生長(zhǎng)緩慢,高溫35~45 ℃幾乎不能生長(zhǎng),在25 ℃條件下菌絲生長(zhǎng)最快,培養(yǎng)7 d菌落直徑為5.822 cm,菌絲平均生長(zhǎng)速率為1.003 cm/d(圖4-a)。
菌株DJ-2的適宜生長(zhǎng)pH值范圍為4~10,其中pH值為7時(shí)菌絲生長(zhǎng)較快,在pH值為7條件下培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑為7.050 cm,菌絲平均生長(zhǎng)速率為0.735 cm/d;其次pH值為5時(shí)菌落直徑較大,為6.707 cm,菌絲平均生長(zhǎng)速率為1.195 cm/d(圖4-b)。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn),pH值為5時(shí)與pH值為7時(shí)相比,前3 d生長(zhǎng)緩慢,培養(yǎng)5 d后菌絲生長(zhǎng)速率較快,但是菌絲生長(zhǎng)較為稀??;而在pH值為7時(shí)菌落前后期生長(zhǎng)速率趨于穩(wěn)定。
以不加氮源的察氏培養(yǎng)基為對(duì)照,在供試5種氮源中,菌株DJ-2對(duì)蛋白胨的利用效果最好,培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑為8.206 cm,菌絲平均生長(zhǎng)速率為0.960 cm/d;該菌株對(duì)其他種類氮源的利用效果無(wú)顯著差異(圖4-c)。
以不加碳源的察氏培養(yǎng)基為對(duì)照,在供試5種碳源中,菌株DJ-2對(duì)甘露醇的利用效果較好,對(duì)葡萄糖和D-木糖的利用效果較差。培養(yǎng)7 d后,對(duì)照和甘露醇處理的菌株DJ-2菌落直徑相差不大,但是對(duì)照處理下的菌株DJ-2生長(zhǎng)稀疏,菌絲稀薄。整體而言,菌株對(duì)甘露醇的利用效果較好,培養(yǎng)7 d后菌落直徑為5.662 cm,菌絲平均生長(zhǎng)速率為1.280 cm/d(圖4-d)。
2.4 病原菌的藥劑室內(nèi)篩選
采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定5種供試殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力,結(jié)果表明,DJ-2在不同濃度含藥平板上均能生長(zhǎng),但與對(duì)照組相比,菌絲生長(zhǎng)緩慢,且抑制率與殺菌劑濃度呈正相關(guān),表明5種供試殺菌劑對(duì)其菌絲的生長(zhǎng)均有較好的抑制效果。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得到5種殺菌劑的毒力回歸方程(表3)。其中苯醚甲環(huán)唑?qū)Σ≡L(zhǎng)的抑制效果最好,EC50值為0.0 200 mg/mL,腈菌唑和多菌靈次之。由EC50可知,病原菌對(duì)5種殺菌劑的敏感性依次為苯醚甲環(huán)唑>腈菌唑>多菌靈>石硫合劑>代森錳鋅。
3 討論
呈褐色的小斑點(diǎn),后逐漸擴(kuò)展呈不規(guī)則狀,病斑顏色逐漸呈暗褐色,蔓延到整個(gè)植株。致病菌能在植株內(nèi)潛伏過(guò)冬,在第2年成為分生孢子,借助雨水或者風(fēng)力傳播,在溫度過(guò)高和過(guò)濕的環(huán)境下會(huì)增加發(fā)病概率。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果將云南省昆明市西洋杜鵑楊梅紅葉斑病的病原菌鑒定為棒孢新擬盤(pán)多毛孢(N. clavispora)。2023年,寸海春等在研究高山杜鵑褐斑病時(shí)發(fā)現(xiàn)了該病原菌[10]。除此之外,該病原菌還可以引起香龍血樹(shù)、紅豆杉、月季、鐵皮石斛、黑老虎、芒果和草莓的葉斑病,藍(lán)莓、小翠云枯稍病,紅掌枯萎?。?1-20]。
本研究對(duì)西洋杜鵑楊梅紅葉斑病病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)定,該病原菌菌絲體在5~35 ℃范圍內(nèi)都能生長(zhǎng),其中最適溫度為25 ℃;另外該病原菌最適pH值為7,之后下降趨于穩(wěn)定,說(shuō)明病原菌適宜在偏酸性培養(yǎng)基中生長(zhǎng),這與薛德勝等的研究結(jié)果[21]基本一致。而本研究最適碳源研究結(jié)果與薛德勝等的研究結(jié)果[21]存在一定出入,說(shuō)明引起不同植物的棒孢新擬盤(pán)多毛孢最適生長(zhǎng)條件存在差異。因此,明確病原菌的生物學(xué)特性是研究其所致病害的發(fā)生規(guī)律、流行動(dòng)態(tài)以及綜合防治的基礎(chǔ)。結(jié)合本研究病原菌的最適生長(zhǎng)條件,在進(jìn)行西洋杜鵑楊梅紅種植時(shí)應(yīng)該避免高溫高濕這種有利于病原菌生長(zhǎng)的環(huán)境,防止病害發(fā)生。
目前杜鵑葉斑病的防治措施主要集中在化學(xué)防治和園藝措施。在近幾年的研究中,證實(shí)唑醚·代森聯(lián)、苯醚甲環(huán)唑、福美雙、苯甲·丙環(huán)唑和二甲酰亞胺類殺菌劑異菌脲對(duì)棒孢新擬盤(pán)多毛孢均具有一定的抑制效果[22-23]。本研究選擇了5種常用化學(xué)藥劑進(jìn)行毒力測(cè)定,結(jié)果表明,10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和10%腈菌唑可濕性粉劑的抑菌作用較為突出,對(duì)病原菌的EC50分別為0.020 0 mg/mL和0.021 7 mg/mL。其中效果最明顯的是苯醚甲環(huán)唑,表明苯醚甲環(huán)唑?qū)τ诎翩咝聰M盤(pán)多毛孢引起的西洋杜鵑楊梅紅葉斑病具有一定的防控潛力,這與薛德勝等的研究結(jié)果[21]一致。
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基金項(xiàng)目:云南農(nóng)業(yè)聯(lián)合專項(xiàng)(編號(hào):202301BD070001-091)。
作者簡(jiǎn)介:田蕓菁(1999—),女,四川達(dá)州人,碩士研究生,研究方向?yàn)閳@藝植物病害治理。E-mail:2111413923@qq.com。
通信作者:蘆俊佳,博士,副教授,從事植物病蟲(chóng)害綜合治理研究。E-mail:58826911@qq.com。