摘要 利用麥類殼多胞斑點病菌β-tubulin一段保守基因序列，設(shè)計特異性引物進(jìn)行麥類殼多胞斑點病菌的檢測，并進(jìn)行特異性與靈敏度驗證。結(jié)果顯示，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度可達(dá)5 pg/μL，適合于麥類殼多胞斑點病菌的快速檢測。

關(guān)鍵詞 β-tubulin基因；麥類殼多胞斑點病菌；特異性；靈敏度

中圖分類號 S41 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）18-0118-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.025

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Rapid Identification Method of Parastagonospora pseudonodorum

LI Jin-qing1，2，WANG Ying-chao1，3，SHAO Xiu-ling1 et al

（1.Technical Center of Qingdao Customs，Qingdao，Shandong 266109；2.Technical Center of Yantai Customs，Yantai，Shandong 264000;3.Linyi Vocational University of Science and Technology，Linyi，Shandong 276000）

Abstract This study utilized partly conserved gene sequence of β-tubulin in Parastagonospora pseudonodorum，designed specific primers for the detection of Parastagonospora pseudonodorum，with specificity and sensitivity verified.The results showed that this method had strong specificity and a sensitivity of up to 5 pg/μL and suitable for rapid detection of Parastagonospora pseudonodorum.

Key words β-tubulin gene;Parastagonospora pseudonodorum;Specificity;Sensitivity

基金項目 國家重點研發(fā)計劃（2021YFD1400100，2021YFD1400103）；青島海關(guān)科研項目（QK202053，QK202016）。

作者簡介 李金慶（1982—），男，山東安丘人，高級農(nóng)藝師，碩士，從事植物檢疫研究。*通信作者，研究員，從事植物檢疫研究。

收稿日期 2023-10-20；修回日期 2023-11-20

麥類殼多胞斑點病菌可為害小麥、大麥等禾本科植物，引起小麥等作物的斑點病，生長后期可引起壞死癥狀，導(dǎo)致小麥等嚴(yán)重減產(chǎn)［1-3］。病菌主要危害葉片和葉鞘上部，葉斑橢圓形，常聚結(jié)，稻草色或淺黃色，中央部分有球果狀分生孢子器，通常為灰色到黑色［4］。麥類殼多胞斑點病菌現(xiàn)已逐漸成為世界性病害，已在非洲［1］、美洲［1-3］、亞洲［1，5］、歐洲［6-8］、大洋洲［1］有分布，并被列入我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄，是一種重要的檢疫性菌物。近年來由于菌物分類研究的快速發(fā)展，許多檢疫性菌物的分類地位已經(jīng)發(fā)生變化［9］，麥類殼多胞斑點病菌的學(xué)名Stagonospora avenae Bissett f. sp. triticea T. Johnson已更新為Parastagonospora pseudonodorum B. A. McDonald，P. C. Brunner，Croll，D. Pereira & Crous ［10-11］。目前麥類殼多胞斑點病菌還未有分子檢測等方面的研究。

隨著分子生物學(xué)發(fā)展，β-微管蛋白基因（β-tubulin）、Histone H3、核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列、EF-1α和nadh1等被廣泛應(yīng)用在菌株間的親緣關(guān)系和病原菌的分子鑒定。由于麥類殼多胞斑點病菌與近似種之間的ITS序列同源性較高，較難通過ITS序列將麥類殼多胞斑點病菌與近似種區(qū)分［12］，因此有必要選擇其他的基因片段進(jìn)行麥類殼多胞斑點病菌的檢測。微管是細(xì)胞骨架、紡錘體等的主要組分，微管蛋白是微管的組成單位，由α-tubulin蛋白和β-tubulin蛋白組成，其中β-tubulin蛋白由β-tubulin基因所編碼［13］，可影響菌絲生長及形態(tài)、孢子形成和附著胞分化等［14］。由于β-tubulin基因既有保守的外顯子又有許多內(nèi)含子，廣泛用于物種鑒定和真菌各級分類水平上的系統(tǒng)發(fā)育研究［15-19］。曹繼芬等［20］以β-tubulin基因為靶標(biāo)設(shè)計了特異性引物Tbas-tub2F/Tbas-tubR用于根黑腐病菌的PCR 檢測，對其檢測特異性、靈敏度、早期診斷技術(shù)進(jìn)行了測試，該引物對根黑腐病菌基因組DNA 檢測的靈敏度為10 fg/μL，可從接種侵染24 h后的煙草組織中檢測到根黑腐病菌，從而對根黑腐病進(jìn)行準(zhǔn)確的早期診斷。彭軍等［21］研究利用β-tubulin保守序列建立一種 PCR檢測方法用于從感病組織及根際土壤中檢測香蕉枯萎菌，可以從海南、廣東分離的18個菌株中擴(kuò)增到單一明顯的497 bp條帶，并在此基礎(chǔ)上建立了巢式PCR，提高了檢測靈敏度。目前還未有利用β-tubulin基因用于麥類殼多胞斑點病菌檢測方法的研究。

筆者在麥類殼多胞斑點病菌新的分類進(jìn)展的基礎(chǔ)上，基于β-tubulin基因探索開發(fā)麥類殼多胞斑點病菌的特異性檢測方法，填補(bǔ)該病菌沒有特異性檢測方法的空缺，以期為口岸檢疫鑒定提供快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

麥類殼多胞斑點病菌（Parastagonospora pseudonodorum）（寧波海關(guān)技術(shù)中心贈送）；6種進(jìn)境大麥中經(jīng)常截獲的病菌［22］：侵染鏈格孢菌（Alternaria infectoria）、互隔鏈格孢菌（Alternaria alternata）、大麥網(wǎng)斑病菌（Pyrenophora teres）、麥根腐平臍孺孢菌（Bipolaris sorokiniana）、梨孢鐮刀菌（Fusarium poae）、大麥黑變病菌（Cladosporium herbarum）；3種小麥上發(fā)生的病菌：小麥基腐病菌（Oculimacula yallundae）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis var.tritici）、假禾谷鐮刀菌（Fusarium pseudograminearum）。

1.2 DNA提取

利用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的高效植物基因組DNA提取試劑盒（DP350-02）刮取在PDA平板上生長的病原菌菌絲進(jìn)行DNA提取。提取完成后測定其濃度與純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)麥類殼多胞斑點病菌一段β-tubulin基因保守序列，用NCBI的Primer-Blast功能模塊設(shè)計Parastagonospora pseudonodorum的特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Psp-tub-F：5′- TGGTCCAAATTGCACAACGC-3′，Psp-tub-R：5′- GGGTGATCTGGAAACCCTGG-3′。

1.4 引物特異性驗證

以麥類殼多胞斑點病菌、侵染鏈格孢菌、互隔鏈格孢菌、大麥網(wǎng)斑病菌、麥根腐平臍孺孢菌、梨孢鐮刀菌、大麥黑變病菌、小麥基腐病菌、小麥全蝕病菌、假禾谷鐮刀菌的基因組DNA及ddH2O為模板，分別用特異性引物Psp-tub-F、Psp-tub-R進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增采用25 μL PCR反應(yīng)體系：Premix Mix 12.5 μL、引物Psp-tub-F／Psp-tub-R各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，加入ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。將反應(yīng)體系混合均勻后置于普通PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min。

1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測普通PCR產(chǎn)物，進(jìn)行引物特異性驗證。

1.5 引物靈敏度驗證

以麥類殼多胞斑點病菌DNA模板（50 ng/μL）做10倍濃度梯度稀釋，共8個稀釋度，將DNA原液及稀釋液作為模板，依照方法“1.4”中設(shè)計的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件來檢測麥類殼多胞斑點病菌PCR反應(yīng)的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性驗證檢測結(jié)果

特異性驗證結(jié)果表明，建立的麥類殼多胞斑點病菌PCR檢測方法具有高度的特異性，只有麥類殼多胞斑點病菌DNA模板的反應(yīng)中出現(xiàn)片段大小為291 bp的特異性條帶，而其他9種病菌及ddH2O均未出現(xiàn)特異性條帶（圖1）。

注：M.DL 2000 DNA Marker。a.麥類殼多胞斑點病菌; b.侵染鏈格孢菌; c.互隔鏈格孢菌; d.大麥網(wǎng)斑病菌; e.麥根腐平臍孺孢菌; f.梨孢鐮刀菌; g.大麥黑變病菌; h.小麥基腐病菌; i.小麥全蝕病菌; j.假禾谷鐮刀菌;k.ddH2O。

Note：M.DL 2000 DNA Marker.a. Parastagonospora pseudonodorum;b.Alternaria infectoria;c.Alternaria alternata;d.Pyrenophora teres;e.Bipolaris sorokiniana;f.Fusarium poae;g.Cladosporium herbarum;h.Oculimacula yallundae;i.Gaeumannomyces graminis var.tritici;j.Fusarium pseudograminearum;k.ddH2O.

2.2 靈敏度驗證檢測結(jié)果

靈敏度驗證結(jié)果表明，模板DNA原液及10-1、10-2、10-3、10-4稀釋度均出現(xiàn)特異性條帶，而10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度均未出現(xiàn)特異性條帶。由此可見，10-4稀釋度是該試驗的檢測下限。換算后可知，麥類殼多胞斑點病菌PCR試驗的靈敏度可達(dá)5 pg/μL（圖2）。

注：M.DL 2000 DNA Marker；a.DNA原液；b.10-1；c.10-2；d.10-3；e.10-4；f.10-5；g.10-6；h.10-7；i.10-8。

3 討論

麥類殼多胞斑點病菌是我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄中的一種檢疫性真菌病害，檢疫意義重大。為保護(hù)我國糧食產(chǎn)業(yè)不受麥類殼多胞斑點病菌入侵和危害，保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)，促進(jìn)對外貿(mào)易的正常開展，需要加強(qiáng)對麥類殼多胞斑點病菌的檢疫，嚴(yán)防其傳入國內(nèi)。我國已于2014年頒布了麥類殼多胞斑點病菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 3892—2014），該標(biāo)準(zhǔn)是建立在形態(tài)學(xué)、生物學(xué)等基礎(chǔ)上的常規(guī)鑒定手段，為提高貨物檢疫的準(zhǔn)確性和通關(guān)放行速度，建立一套快速、完整、準(zhǔn)確的分子特異性檢測方法迫在眉睫。

目前，麥類殼多胞斑點病菌主要集中在形態(tài)、防治方面的研究，而分子鑒定方面的研究較少［11］。該研究基于麥類殼多胞斑點病菌（Parastagonospora pseudonodorum）的β-tubulin基因，建立了一套快速、靈敏、高效的PCR分子檢測方法。該研究根據(jù)GenBank中得到的麥類殼多胞斑點病菌與其近似種的β-tubulin基因序列，用NCBI的Primer-Blast功能模塊設(shè)計Parastagonospora pseudonodorum的特異性引物Psp-tub-F和Psp-tub-R，PCR反應(yīng)中只有麥類殼多胞斑點病菌DNA模板的反應(yīng)出現(xiàn)片段大小291 bp的特異性條帶，而其近似種及陰性對照均未出現(xiàn)特異性條帶，表明該對引物特異性強(qiáng)，可有效從進(jìn)口糧食中鑒定出麥類殼多胞斑點病菌。該方法靈敏度較高，檢測靈敏度可達(dá)5 pg/μL。該研究填補(bǔ)了麥類殼多胞斑點病菌鑒定沒有特異性檢測方法的空缺，首次將β-tubulin基因序列分析應(yīng)用于麥類殼多胞斑點病菌的鑒定中，為麥類殼多胞斑點病菌的鑒定開拓了途徑。該研究結(jié)果可為麥類殼多胞斑點病菌標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考，為海關(guān)一線執(zhí)法提供數(shù)據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)

［1］

MCDONALD M C，RAZAVI M，F(xiàn)RIESEN T L，et al.Phylogenetic and population genetic analyses of Phaeosphaeria nodorum and its close relatives indicate cryptic species and an origin in the Fertile Crescent［J］.Fungal Genet Biol，2012，49（11）：882-895.

［2］ FERNANDEZ M R，CELETTI M J，HUGHES G.Leaf diseases of common and durum wheat in Saskatchewan in 1998［J］.Can Plant Dis Surv，1999，79：86-89.

［3］ DA LUZ W C，BERGSTROM G C.Distribution，prevalence，and severity of fungal foliar diseases of spring wheat in New York in 1984 and 1985［J］.Plant Dis，1986，70：842-847.

［4］ JOHNSON T.A form of Leptosphaeria avenaria on wheat in Canada［J］.Can J Res，1947，25（6）：259-270.

［5］ CROLL D，CROUS P W，PEREIRA D，et al.Genome-scale phylogenies reveal relationships among Parastagonospora species infecting domesticated and wild grasses［J］.Persoonia，2021，46：116-128.

［6］ QUAEDVLIEG W，VERKLEY G J M，SHIN H D，et al.Sizing up Septoria［J］.Stud Mycol，2013，75：307-390.

［7］ VU D，GROENEWALD M，DE VRIES M，et al.Large-scale generation and analysis of filamentous fungal DNA barcodes boosts coverage for kingdom fungi and reveals thresholds for fungal species and higher taxon delimitation［J］.Stud Mycol，2019，92：135-154.

［8］ MULENKO W，MAJEWSKI T，RUSZKIEWICZ-MICHALSKA M.A preliminary checklist of micromycetes in Poland［M］.Krakow，Poland：W.Szafer Institute of Botany，Polish Academy of Sciences，2008.

［9］ 段維軍，嚴(yán)進(jìn)，劉芳，等.我國進(jìn)境檢疫性菌物名錄亟待修訂完善［J］.菌物學(xué)報，2015，34（5）：942-960.

［10］ ZHAO P，CROUS P W，HOU L W，et al.Fungi of quarantine concern for China I：Dothideomycetes［J］.Persoonia，2021，47：45-105.

［11］ 李金慶，王英超，段維軍，等.麥類殼多胞斑點病菌研究進(jìn)展［J］.植物檢疫，2023，37（2）：28-31.

［12］ UENG P P，SUBRAMANIAM K，CHEN W，et al.Intraspecific genetic variation of Stagonospora avenae and its differentiation from S.nodorum［J］.Mycol Res，1998，102（5）：607-614.

［13］ BALDAUF S L，PALMER J D.Animals and fungi are each other’s closest relatives：Congruent evidence from multiple proteins［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90（24）：11558-11562.

［14］ ZHANG J，JIN K，XIA Y X.Contributions of β-tubulin to cellular morphology，sporulation and virulence in the insect-fungal pathogen，Metarhizium acridum［J］.Fungal Genet Biol，2017，103：16-24．

［15］ BALDAUF S L，DOOLITTLE W F.Origin and evolution of the slime molds （Mycetozoa） ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94 （22）：12007-12012.

［16］ O’DONNELL K，CIGELNIK E，NIRENBERG H I.Molecular systematics and phylogeography of the Gibberella fujikuroi species complex［J］.Mycologia，1998，90（3）：465-493.

［17］BEGEROW D，JOHN B，OBERWINKLER F.Evolutionary relationships among beta-tubulin gene sequences of basidiomycetous fungi［J］.Mycol Res，2004，108：1257-1263.

［18］ KEELING P J，LUKER M A，PALMER J D.Evidence from beta-tubulin phylogeny that microsporidia evolved from within the fungi［J］.Mol Biol Evol，2000，17（1）：23-31.

［19］MSISKA Z，MORTON J B.The beta-tubulin gene as a means to discriminate species of arbuscular mycorrhizal fungi［J］.Phytopathology，2005，95：s157-s157.

［20］ 曹繼芬，戶艷霞，王新中，等.基于微管蛋白基因的煙草根黑腐病菌分子檢測［J］.中國煙草科學(xué)，2016，37（6）：60-65.

［21］ 彭軍，梁昌聰，趙培靜，等.香蕉枯萎病菌β-微管蛋白基因分子檢測研究［C］//彭友良，王振中.中國植物病理學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會論文集.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2008：278-284.

［22］ 孫民琴，楊瑾，朱林，等.進(jìn)境大麥中病原真菌的分離與鑒定［J］.中國植保導(dǎo)刊，2022，42（3）：89-91.