摘要 ［目的］研究不同固定劑及切片制樣方式對菊花花蕾激光顯微切割樣品RNA提取質(zhì)量的影響。［方法］以丙酮和乙醇冰醋酸2種試劑固定菊花花蕾，采用石蠟和冰凍切片2種方式制作樣本，顯微切割并收集最外兩輪小花原基，提取RNA后比較提取質(zhì)量。［結(jié)果］石蠟和經(jīng)梯度蔗糖保護的冰凍切片均能很好地保存花蕾組織形態(tài)，就石蠟切片而言，乙醇冰醋酸固定組織切割樣品的RNA降解明顯低于丙酮固定樣品；而2種固定劑的冰凍切片切割樣品RNA提取質(zhì)量無明顯差異。與石蠟切片相比，冰凍切片顯微切割樣品RNA質(zhì)量更高。切割時收集管蓋加入RNA提取緩沖液可明顯緩解RNA降解。顯微切割的不同品種菊花花原基與花發(fā)育有關(guān)的基因表達水平存在差異，表明切割獲得的材料可用于下一步研究。［結(jié)論］植物組織經(jīng)乙醇冰醋酸固定、梯度蔗糖保護后冰凍切片進行顯微切割效果較佳，可富集特異組織或細胞并從中獲得較高質(zhì)量的RNA。

關(guān)鍵詞 固定劑；石蠟切片；冰凍切片；激光顯微切割；RNA；提取質(zhì)量

中圖分類號 Q94-336 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）18-0001-05

doi：10.kXl6dXLwb1b/JPHinal3W4GmMrEUNvbXyQ434Q+AeFg=3969/j.issn.0517-6611.2024.18.001

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effect of Sample Preparation Methods on the Quality of RNA Extraction from Chrysanthemum Bud Laser Microdissection Samples

MA Yue-hua，DING Lian，ZHANG Xue et al

（College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095）

Abstract ［Objective］To study the effect of different fixatives and section methods on RNA quality of flower primordia of Chrysanthemum buds collected by microdissection.［Method］Chrysanthemum buds was fixed by acetone or ethanol acetic acid and then paraffin section/frozen section was prepared for laser microdissection respectively.Outermost two whorls of flower primordia were identified and collected by laser microdissection.The quantity and quality of isolated RNA were assessed.［Result］Both tissues embedded in paraffin for paraffin section or OCT for cryosection preserves well the anatomical structure and morphology of the buds.For paraffin-section，ethanol acetic acid was a better choice being a fixative than that of acetone，as that RNA extracted from the microdissection samples was less degraded.There was no significant difference in RNA integrity of cryosection between these two fixatives.The tissues conducted cryosection could get higher quality of RNA compared with that of paraffin-section.Furthermore，when microdissection was conducted，containing the extraction buffer from RNA isolation kit in the cap of PCR tube could preserved RNA integrity of the samples.Genes expression of flowering locus T in flower primordia was different in species of chrysanthemum showed that samples captured by microdissection can be used for subsequent research.［Conclusion］Plant tissues fixed by ethanol-acetic acid and protected by gradient sucrose before cryosection could collect specific cell-type populations by laser microdissection.From those populations we could obtain enough RNA with high integrity.

Key words Fixative；Paraffin section；Cryosection；Laser microdissection；RNA；Extraction quality

基金項目 中央高?；緲I(yè)務費科技平臺實驗技術(shù)人才基金項目（10307201705）。

作者簡介 馬月花（1975—），女，青海海東人，高級實驗師，博士，從事實驗室和大型儀器管理工作。

收稿日期 2023-10-19

激光顯微切割技術(shù)是通過在顯微鏡下識別目的組織或細胞，利用激光作為能量，從不同的組織中快速切割、分離和純化生物體的目標組織、細胞，從而進行后續(xù)的分子生物學、質(zhì)譜等分析的一種手段，它是顯微觀察和分子生物學、代謝組學等研究之間的橋梁。植物體內(nèi)相似或相同形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理功能的細胞群構(gòu)成了組織，組織結(jié)構(gòu)越多越復雜則植物的適應性越強，各個組織來源、分工不同，但相互有機結(jié)合，協(xié)同完成植物的生命活動。以往多數(shù)研究往往取材于混合的異質(zhì)組織進行細胞分析，其結(jié)果往往是數(shù)量較大的幾類細胞的綜合平均值。為研究某種細胞或組織的特殊功能，必須對特殊的細胞類型進行單一分離和分析。激光顯微切割技術(shù)成功地解決了大塊分離組織中的細胞功能異質(zhì)性問題，自1996年以來廣泛應用于腫瘤等醫(yī)學研究，但在植物樣品中的應用則起步較晚［1］。近些年來隨著蛋白質(zhì)組學技術(shù)、測序技術(shù)的發(fā)展，激光顯微切割在植物方面的研究應用越來越廣泛。Pires等［2］利用激光切割技術(shù)對木本植物如橡木的木栓形成層、皮孔、木質(zhì)部、韌皮部分別進行取樣并測序，Balestrini等［3］通過激光顯微切割技術(shù)研究了不同類型細胞在植物和病原侵染過程中轉(zhuǎn)錄組和基因表達的反應，Verma等［4］收集了蘋果芽分生組織并通過激光顯微切割技術(shù)對其miRNAs的表達進行了分析；Cahill等［5］利用激光切割結(jié)合質(zhì)譜對單個洋蔥表皮和衣藻細胞進行了代謝組研究；Zhong等［6］利用激光切割結(jié)合熒光定量PCR、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分別測定了小麥籽粒糊粉層、外胚乳、中胚乳、內(nèi)胚乳和傳遞細胞的基因表達及其游離和結(jié)合蛋白質(zhì)的氨基酸水平，揭示了胚乳中蛋白質(zhì)合成和氨基酸運輸?shù)耐緩剑瑸楦咂焚|(zhì)小麥的改良提出了目標。冰凍切片和石蠟切片是顯微切割組織的主要制片方法，但二者的核酸回收率和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保持性在不同的植物種類和組織間具有很大差異［7］。將包埋材料由石蠟換為更低熔點的Steedman’s wax時得到的切片組織完整性和RNA質(zhì)量更高［8］。如何建立一種高效、經(jīng)濟的基于激光顯微切割技術(shù)切取特異組織或細胞，并從中提取到足夠數(shù)量和完整性的RNAs是將此技術(shù)廣泛應用于研究的難點［7］。該研究以激光顯微切割菊花花原基進行后續(xù)測序等分子生物學研究為目的，比較了樣品固定液、制片方法、切割過程中的保護措施等對收集的花原基提取RNA質(zhì)量的影響，以期探尋一種獲取高質(zhì)量RNA適于下游分子生物學相關(guān)研究的植物顯微切割樣品制備方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 顯微切割制樣方法部分以南京農(nóng)業(yè)大學菊花品種“泰白”為材料，基因表達部分以“泰白”“神馬”“金松月”3個菊花品種為材料，取4～6 mm花蕾。2種固定液分別為無水乙醇/冰醋酸（3∶1，V/V）和丙酮。

冰凍切片機采用德國Leica品牌，型號CM3050S；全自動激光顯微切割系統(tǒng)采用德國Leica品牌，型號LMD7000；生物分析儀系統(tǒng)采用美國Agilent品牌，型號2100；熒光定量儀采用瑞士羅氏品牌，型號LightCycler 96。

1.2 試驗方法

1.2.1 石蠟制片樣品的準備。

1.2.1.1 固定。

將組織樣品切成3 mm×3 mm×3 mm的正方體塊，分別投入4 ℃預冷的2種固定液中，抽真空20 min，隨后更換新鮮的固定液，４ ℃搖床上振蕩過夜。

1.2.1.2 脫水。

利用由低到高的乙醇梯度對樣品進行脫水，每個梯度180 min，這一過程是將脫色搖床置于4 ℃冰箱內(nèi)進行。乙醇梯度依次為50%乙醇＋10% 8.5% NaCl+40%焦碳酸二乙酯（DEPC）水、70%乙醇＋10% 8.5% NaCl+20% DEPC水、85%乙醇＋10% 8.5% NaCl+5% DEPC水、95%乙醇、100%乙醇，最后再更換新鮮的100%乙醇于４ ℃搖床上過夜。

更換新鮮的無水乙醇在室溫下置搖床上處理2.5 h，隨后將樣品放入無水乙醇∶二甲苯（1∶1）溶液中振蕩處理1.5 h，連續(xù)更換4次二甲苯，每次振蕩處理1.5 h，最后一次更換時加入約1/4體積的固體石蠟片，室溫下振蕩過夜。同時在60 ℃烘箱中融化固體石蠟片，制備液體石蠟以備后用。

1.2.1.3 包埋、切片。

將樣品轉(zhuǎn)移至42 ℃烘箱中，待石蠟片全部融化后更換已制備好的新鮮液體石蠟，并于60 ℃烘箱過夜。連續(xù)3 d每天早晚將樣品換入新鮮的純液體石蠟中，第4天早晨更換純蠟后至少等待4 h再進行包埋。從包埋盒中取出蠟塊，用加熱的解剖刀將蠟塊分割為若干小蠟塊，每個小蠟塊包含一個完整的組織。將小蠟塊修整成正方體或者長方體后粘在小木塊上，使用石蠟切片機進行切片，切片厚度為8 μm。用毛筆挑取石蠟片，放在攤片機上用37 ℃ DEPC水展片，待蠟片充分展平后，用PET膜在水中撈取石蠟切片，吸水紙吸干多余水分。將PET膜置于37 ℃烤片機上烤片1.5～2.0 h后放入4 ℃冰箱保存或進行下一步試驗。這一過程中特別要注意的是，從水中撈取石蠟片后一定要將多余水分充分吸干，以免產(chǎn)生氣泡影響制片的效果。

1.2.1.4 脫蠟。

脫蠟前準備好7個染缸，將染缸裝滿所需試劑，按以下流程操作：二甲苯7 min/缸，共3次； 100%乙醇30 s；100%乙醇30 s；95%乙醇2×30 s（第一次30 s結(jié)束后拎起來再放回去30 s）；70%乙醇60 s。最后把片子晾干，但不能太干，容易起靜電。

1.2.2 冰凍切片樣品制片。

1.2.2.1 包埋和固定。

包埋和固定全程冰上操作。將組織樣品切成3 mm×3 mm×3 mm的正方體塊，放入50 mL離心管中，加入提前預冷的5倍以上體積的2種固定劑，抽真空15 min后換新鮮固定液4 ℃搖床過夜。倒掉固定液，加入-20 ℃冰箱中預冷的10%蔗糖溶液（150 g蔗糖溶解在800 mL DEPC水中，加入100 mL 10×PBS緩沖液，最后用DEPC水定容至1 L），抽真空15 min。換新的15%蔗糖溶液，置于低轉(zhuǎn)速的4 ℃搖床，待樣品完全下沉，倒掉15%蔗糖溶液，加入30%蔗糖溶液（300 g蔗糖溶解在800 mL DEPC水中，加入100 mL 10×PBS緩沖液，最后用DEPC水定容至1 L），抽真空15 min，4 ℃搖床最慢速搖至樣品完全沉到底。倒掉蔗糖溶液，將樣品倒入透明可見的培養(yǎng)皿中，吸干殘留的蔗糖溶液，加入少許OCT包埋劑，用小藥匙拌勻2 min。將拌勻后的樣品放入OCT的磨具中，再將磨具放入在液氮中提前預冷的鋁盒中，等待10 s，待樣品凍住后，-80 ℃保存。

1.2.2.2 冰凍切片。整個冰凍切片過程中使用的所有器具均需提前用DEPC水處理，保持環(huán)境干凈整潔。切割前將PET載玻片提前放入冰凍切片機中-20 ℃預冷1 h，切片厚度設(shè)10～16 μm，切割角度為10°，切割后等待幾秒鐘防止條帶卷曲，隨后用細鉗子取出放至載玻片上，將手指置于玻片下，利用手溫融化玻片上方膜上的OCT包埋劑，使樣品黏貼在膜上。重復以上切割步驟，直至條帶覆蓋整個薄膜，做好的切片存于-20 ℃冰箱，若在當天進行激光切割，則應在固定前將玻片放至低溫恒溫器中干燥幾分鐘以防條帶分離。

1.2.2.3 玻片固定和脫水。

將PET載玻片浸入70%乙醇中至少1 min，之后放入100%乙醇溶液中浸沒并重復4～5次，最后將載玻片拿出在空氣中晾干，直至所有乙醇揮發(fā)后（約2 min）馬上切割。此過程中使用的乙醇試劑均需提前在-20 ℃冰箱中預冷。

1.2.3 激光切割。

利用全自動激光顯微切割系統(tǒng)進行切割并收集最外兩輪小花原基， 每個0.5 mL 離心管管蓋收集3張切片的切割量，約10 000個細胞。每個樣品分別采取3種方式收集目標組織：顯微切割時管蓋內(nèi)各自加入RNA提取緩沖液、RNA保護劑或不加任何試劑。

切割完成后，小心取下收集管，將管身倒扣入管蓋并用封口膜封好，放入提前預熱好的42 ℃水浴鍋中溫浴30 min，隨后在3 000 r/min下離心2 min。離心后的樣品可放-80 ℃保存?zhèn)溆没蜻M行下一步試驗。

1.2.4 RNA提取及基因表達。

用美國ABI公司的PicoPure RNA提取試劑盒，按說明步驟提取樣品RNA，利用生物分析儀系統(tǒng)對RNA提取質(zhì)量進行分析。反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用美國NuGEN公司的Ovation RNA-Seq System V2試劑盒進行擴增。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計花發(fā)育相關(guān)基因的熒光定量引物（表1），以CmEF1α基因為內(nèi)參，各基因的引物序列見表1。反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μL、 Forward primer （10 μmol/L）0.4 μL、Reverse primer （10 μmol/L）0.4 μL、cDNA 0.5 μL、ddH2O 8.7 μL，反應總體積為20.0 μL。反應程序：95 ℃/2 min；95 ℃/10 s，60 ℃/10 s，72 ℃/20 s，40個循環(huán)。每個樣品3個生物學重復和3個技術(shù)重復，采用2-ΔΔCT法對基因的表達量進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微鏡下2種制片的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)

由圖1可見，該研究中石蠟和OCT包埋獲得的2種切片均能較好地保持花蕾組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，顯微鏡下花蕾組織結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)完整。通過激光顯微切割，可收集花原基用于后續(xù)研究。

2.2 不同固定方法對石蠟切片顯微切割樣品RNA提取質(zhì)量的影響 生物分析儀檢測結(jié)果（表2、圖2）顯示，與丙酮固定的樣品比較，乙醇冰醋酸固定的石蠟切割樣品RNA提取質(zhì)量更高，18S、25S峰清晰可見，且25S/18S rRNA比率更高，RNA降解較少，RNA完整數(shù)量（RIN）達到了4.6，而同等條件下丙酮固定樣品的提取RNA降解明顯，RIN僅為2.4。表明采用乙醇冰醋酸方法固定的石蠟切片樣品通過激光顯微切割獲得的RNA質(zhì)量更高。

2.3 不同固定方法對冰凍切片顯微切割樣品RNA提取質(zhì)量的影響

冰凍切片時乙醇冰醋酸固定和丙酮固定樣品均可見清晰的18S、25S峰（圖3），采用乙醇冰醋酸固定樣品獲得的RNA總量、RNA濃度及RNA完整數(shù)量（RIN）均略高于丙酮固定樣品（表3），但2種樣品固定方法間RNA提取質(zhì)量無明顯差異。

2.4 新鮮組織樣品與固定、包埋后顯微切割樣品的RNA提取質(zhì)量比較 與新鮮完整組織樣品相比，顯微切割樣品的

RNA降解嚴重。由圖4可見，新鮮完整組織中提取的RNA

質(zhì)量很好，18S、25S峰形銳利，RIN值達到了7.8，濃度104 ng/μL，而經(jīng)歷丙酮或乙醇冰醋酸固定、冰凍切片、顯微切割后樣品RNA降解嚴重。

2.5 收集管蓋中加入保護劑緩解RNA降解的效果

由表3和表4可見，切割時，在收集管中加入保護劑有利于緩解切割樣品的RNA降解，提高RNA的完整性。其中以在收集管中直接加入提取緩沖液的保護效果最佳，加入RNA保護劑的效果次之，乙醇冰醋酸固定的石蠟包埋樣品較不加保護劑

的對照樣品RIN值提高了1.5倍（表4），而丙酮固定樣品的RIN值也較對照提高了95%（表5）。

2.6 不同品種菊花花原基與花發(fā)育有關(guān)的基因表達

激光顯微切割收集獲得的菊花花原基提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和擴

增后可用于熒光定量分析，由圖5可見，石蠟切片顯微切割

收集獲得的不同品種菊花花原基與花發(fā)育有關(guān)的基因表達水平存在差異，說明顯微切割獲取目標組織或細胞后提取RNA并進行后續(xù)的分子方面研究如熒光定量PCR或轉(zhuǎn)錄組測序具有可行性。

3 討論與結(jié)論

激光顯微切割技術(shù)是在不破壞組織結(jié)構(gòu)并且保存要捕獲的細胞及其周圍組織形態(tài)完整的前提下，直接從冰凍或石蠟包埋組織切片中精確獲取目標細胞，進行后續(xù)的分子生物學、轉(zhuǎn)錄組等分析的一種手段［8］。激光顯微切割前的樣品處理方法直接關(guān)系到切割收集的組織、細胞總RNA質(zhì)量和數(shù)量，決定著通過激光顯微切割獲得的RNA能否被用于下一步芯片試驗的分析［9］。該研究中，顯微切割樣品的RNA質(zhì)量明顯低于完整新鮮組織樣品，說明制樣過程中RNA降解嚴重。因此，探尋在制備激光顯微切割樣品過程中避免RNA降解的方法，如何在激光顯微切割操作下盡可能得到量多且質(zhì)高的RNA具有重要意義。

已報道應用于激光切割樣品的固定方法既有無水乙醇/冰醋酸（3∶1）溶液［10-11］，也有丙酮［12］、甲醇［13］、FAA固定。賀莉萍等［14］研究發(fā)現(xiàn)，沉淀脫水類固定劑如甲醇、乙醇、丙酮對病毒組織RNA完整性的保存明顯優(yōu)于醛類固定劑。Nakazono等［15］研究發(fā)現(xiàn)用75%乙醇和25%冰醋酸固定的樣品較FAA固定樣品提取的RNA量更多，且前者固定的組織通過激光顯微切割獲得的RNA有反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而FAA固定組織激光顯微切割后沒有反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這些研究說明固定方法的選擇將影響最終獲得的切割目標組織或細胞的RNA質(zhì)量。該研究中，采用石蠟制片方法時，無水乙醇/冰醋酸（3∶1）溶液固定的樣品切割后獲得的RNA降解更少，RIN值明顯高于丙酮固定樣品；但采用冰凍切片時丙酮和乙醇冰醋酸2種固定方法獲得的切割材料RIN值無明顯差異。該研究中石蠟包埋的切割樣品RNA濃度及完整度均低于OCT包埋的冰凍切片，這可能是石蠟包埋過程中高溫導致RNA降解所致。Hua等［16］研究發(fā)現(xiàn)采用低熔點蠟，包埋時熔蠟溫度保持57 ℃不超過60 ℃，展片時所用的DEPC水溫度保持50～54 ℃均有利于降低切割樣品的RNA降解風險。

激光顯微切割

技術(shù)應用于植物細胞上鮮見報道，最大的原因可能是他們的細胞較小，細胞間存在間隙和堅硬的細胞壁。低溫下植物組織和細胞間隙會形成大的冰晶，危害細胞形態(tài)［17］。為解決這些技術(shù)難題，在冰凍和連續(xù)包埋切片前樣本需要被固定，并在真空條件下用冷凍保護劑進行處理［18］。OCT包埋的樣品通過冰凍切片機在-20 ℃下制片，而植物細胞含有大的液泡用于水分儲存，且細胞間存在間隙，樣品在冰凍切片過程中快速冷凍可能形成冰晶，從而導致細胞結(jié)構(gòu)的破壞。合適的蔗糖濃度作為冰凍保護劑在切片的RNA穩(wěn)定性和保持形態(tài)結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用，較高濃度的蔗糖處理降低了RNA降解的風險，而較長時間的孵育有助于維持組織切片的形態(tài)結(jié)構(gòu)［18］。陳丹等［19］研究發(fā)現(xiàn)制作冷凍切片時煙草花器官不同部位適合的保護劑蔗糖濃度不同，其中子房為2%～4%，柱頭為18%～20%，花柱為4%～6%。該研究中菊花花蕾初步固定后用冰冷的10%、15%、30%的蔗糖逐步滲透組織，然后再進行OCT包埋冰凍切片，既很好地保護了切割樣品的組織結(jié)構(gòu)，又降低了RNA降解。因此，針對含水量不同的其他樣品，此蔗糖濃度可能還需進行適當調(diào)整。

切割草莓花藥和雌蕊組織時，收集管蓋中含RNA提取緩沖液的提取質(zhì)量優(yōu)于不含緩沖液的樣品［18］。Gotté等［20］在切割擬南芥根系分化區(qū)、伸長區(qū)等組織時直接將切割樣品收集進含裂解緩沖液的收集管中亦顯著降低了RNA損傷的風險。該研究發(fā)現(xiàn)收集管中添加提取緩沖液和RNA保護劑均有利于保護切割樣品的RNA，其中以直接添加提取緩沖液的保護效果最佳。

激光顯微切割技術(shù)作為一種組織純化手段，可有效地解決細胞組織樣品異質(zhì)性的問題，切割快速且精確。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)、測序技術(shù)等的發(fā)展，在生命科學研究中得到了越來越廣泛的應用。該研究中菊花花蕾顯微切割得到的花原基與開花有關(guān)的基因表達水平在不同品種間存在差異，表明顯微切割獲得的組織或細胞是可用于后續(xù)研究的。但與新鮮組織提取的RNA質(zhì)量相比，經(jīng)固定、石蠟或OCT包埋后進行切割的樣品RNA降解嚴重。因此還需圍繞樣品制備過程中降低污染，減少RNA降解，制片過程中組織細胞形態(tài)維持，切割材料的保存，適合于激光顯微切割微量細胞的RNA提取擴增試劑盒選擇等方面進行進一步探索，這些問題的解決和優(yōu)化將加大激光顯微切割技術(shù)在生命科學研究中應用的廣度和深度。

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