摘 要：【目的】灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides 為我國南方地區(qū)大宗道地中藥材和重要經(jīng)濟植物，綠原酸和木犀草苷等藥效物質(zhì)在器官衰老過程中積累且受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)ERF 基因家族廣泛參與植物的衰老、脅迫響應(yīng)和次生代謝。鑒定灰氈毛忍冬ERF 家族成員并探究其表達模式，可為該類基因調(diào)控次生代謝的功能研究提供參考?！痉椒ā炕谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定灰氈毛忍冬ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族，通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析其進化關(guān)系，利用MEME 在線網(wǎng)站分析序列的結(jié)構(gòu)基序。QRT-PCR 分析LmERFs 基因在不同器官衰老過程以及冷脅迫和乙烯處理后的表達模式?！窘Y(jié)果】在灰氈毛忍冬中共鑒定出65 個具AP2 保守結(jié)構(gòu)域的LmERFs 基因，可將其分為3 個亞組。利用RNA-Seq 技術(shù)篩選了在幼嫩和衰老葉片之間差異表達的20 個LmERFs。進一步qRT-PCR 分析顯示，分別有18 個、13 個和11 個LmERFs 基因在葉片、莖和花的衰老過程顯著差異表達，其中LmERF2、LmERF9、LmERF16、LmERF17 和LmERF19 基因表達在不同器官衰老過程中均具顯著差異。冷脅迫后，葉和莖中7 個LmERFs（LmERF1、LmERF2、LmERF6、LmERF7、LmERF8、LmERF11 和LmERF12） 顯著上調(diào)，LmERF3、LmERF9、LmERF16 和LmERF19 顯著下調(diào)；而乙烯處理誘導(dǎo)了LmERF1、LmERF8 和LmERF12基因的表達，抑制了LmERF2、LmERF4、LmERF9、LmERF10、LmERF14、LmERF15、LmERF16、LmERF17、LmERF18 和LmERF19 基因的表達?！窘Y(jié)論】8 個LmERFs（LmERF1、LmERF2、LmERF6、LmERF9、LmERF10、LmERF15、LmERF16 和LmERF19）響應(yīng)了器官發(fā)育、冷脅迫和乙烯誘導(dǎo)的衰老過程，這為后續(xù)挖掘高效調(diào)控灰氈毛忍冬次生代謝的靶點LmERFs 提供了數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：灰氈毛忍冬；ERF 基因家族；器官衰老；乙烯；冷害脅迫

中圖分類號：S567.79 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）02—0013—16

灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand-Mazz又名大金銀花，忍冬科忍冬屬植物，為我國西南地區(qū)大宗道地中藥材和特色經(jīng)濟植物，其次生代謝產(chǎn)物如綠原酸和木犀草苷等核心藥效成分具有抗病毒、抗氧化、增強免疫力等多種功能[1]。目前，灰氈毛忍冬已被廣泛應(yīng)用于制藥、保健品及化妝品等行業(yè)，市場巨大[2]。然而，灰氈毛忍冬存在品種混雜、藥效成分含量參差不齊等問題，已成為制藥、提取、加工等下游產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，挖掘調(diào)控次生代謝產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵因子是解決這一難題的重要途徑。

研究表明，植物通過產(chǎn)生次生代謝物響應(yīng)衰老信號、適應(yīng)環(huán)境壓力[3]。擬南芥葉片衰老過程中，花青素和吲哚衍生的甲基葡萄糖苷顯著增加；而黃酮醇苷和芥子酸共軛物持續(xù)減少。隨著器官的發(fā)育和衰老，灰氈毛忍冬綠原酸、綠原酸前體及異構(gòu)體等苯丙烷類物質(zhì)和木犀草苷等黃酮類物質(zhì)含量發(fā)生顯著變化[1，4]。Rezaie 等[5] 發(fā)現(xiàn)，冷脅迫顯著影響了羅勒中苯丙素類化合物的含量。糖和次生代謝在柑橘類植株響應(yīng)冷脅迫中發(fā)揮著重要作用[6-7]。乙烯可促進植物次生代謝物的產(chǎn)生，如長春花中酚酸、黃酮醇、萜類和吲哚類生物堿、烏龍茶中兒茶素和甜橙中瓦倫西亞橘烯[8]。由此可知，植物發(fā)育、激素或脅迫信號顯著影響次生代謝物合成，探究灰氈毛忍冬響應(yīng)衰老和脅迫機制有助于挖掘次生代謝物合成的關(guān)鍵基因，為利用基因工程手段培育新品種提供理論依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄因子通過介導(dǎo)次生代謝物合成參與生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)[9]。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，成員含有1 個或2 個由60 ～ 70 個氨基酸構(gòu)成的AP2 保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)結(jié)構(gòu)域數(shù)量和識別序列的不同可將其分為AP2、ERF、DREB、RAV 和Soloist5 個亞家族[10]，廣泛參與植物生長發(fā)育、初生和次生代謝調(diào)控、生物或非生物脅迫響應(yīng)[11] 以及乙烯等植物激素信號傳導(dǎo)途徑[12-13]。其中ERF（ethylene response factor） 轉(zhuǎn)錄因子亞家族是乙烯信號通路下游的關(guān)鍵調(diào)控因子[14-15]，只含有一個AP2 結(jié)構(gòu)域，第14 位和第19 位氨基酸分別是丙氨酸和天冬氨酸，區(qū)別于其他亞家族成員。ERF 亞家族成員可特異性結(jié)合基因啟動子區(qū)的GCC-box 元件（AGCCGCC），從而參與調(diào)控乙烯應(yīng)答、生物及非生物脅迫和次生代謝[13，16]。胡俊東等[17] 研究表明，PheERF5 基因參與毛竹抗生物和非生物脅迫過程；小麥TaERF1基因在擬南芥中過表達可提高轉(zhuǎn)基因植株對高鹽和低溫的耐受性[18]；ERF- Ⅵ亞族成員CRF 具有正向調(diào)節(jié)植物滲透脅迫耐受性和抗凍性作用[18-19]。Lyu 等[20] 發(fā)現(xiàn)樺木中BpERF13 過表達可通過結(jié)合并上調(diào)冷脅迫關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子CBF 的基因表達來增強耐寒性。擬南芥ERF 亞族轉(zhuǎn)錄因子ORA59基因受茉莉酸和乙烯的協(xié)同誘導(dǎo)，通過正向調(diào)控PDF1.2 的表達增加植物灰霉抗性，在茉莉酸與乙烯信號的交叉對話中起了重要的調(diào)控作用[21-22]。煙草中過表達NtERF19 可顯著增加生物堿，特別是新煙堿的含量[23]。目前，鮮見忍冬屬藥用植物ERF 轉(zhuǎn)錄因子的研究，在灰氈毛忍冬中尚未見ERF 參與脅迫響應(yīng)的研究報道。