摘要：運用多種生物信息技術(shù)對非洲豬瘟病毒（ASFV）Georgia 2007/1株p10蛋白和p49蛋白的理化性質(zhì)、二級及三級空間結(jié)構(gòu)、抗原性、抗原決定簇進行初步分析，并預(yù)測其B、T淋巴細胞優(yōu)勢表位。結(jié)果表明，p10是親水性蛋白，含有2個抗原決定簇，該蛋白α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈的比例為32.05%、11.54%、52.56%和3.85%；p49同樣是親水性蛋白，含有17個抗原決定簇，其α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈的比例依次為29.91%、7.53%、55.94%和6.62%?；谝陨戏治觯琾10不適合用于ASF疫苗制備的候選蛋白；而p49作為親水性衣殼蛋白，具有一定免疫原性，有望成為疫苗研制的備選蛋白，為ASFV蛋白研究和疫苗研發(fā)提供一定參考。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟；生物信息學；表位預(yù)測

中圖分類號：S855.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0195-08

收稿日期：2023-09-05

基金項目：國家自然科學基金（編號：32002292），河南省重大科技專項（編號：221100110600）。

作者簡介：孫卓雅（1999—），女，碩士研究生，研究方向為分子免疫和亞單位疫苗等，E-mail：792474123@qq.com；共同第一作者：王夢翔（1998—），男，碩士研究生，研究方向為亞單位疫苗和蛋白質(zhì)譜分析等，E-mail：1834768483@qq.com。

通信作者：吳亞楠，博士，副教授，研究方向為動物免疫分子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能解析，E-mail：wlyananjiayou@yeah.net；張改平，中國工程院院士，博士，教授，研究方向為動物病毒分子致病機制和食品安全檢測，E-mail：zhanggaip@126.com。

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染豬而引起的一種急性接觸性、廣泛出血性、烈性傳染病，各年齡段的豬均易感。ASF的臨診癥狀很難和豬瘟區(qū)別，根據(jù)毒力和感染途徑不同ASF可表現(xiàn)為最急性型（強毒株）、急性型（中等毒力毒株）、亞急性型和慢性型（弱毒株）；死亡率分別為100%、90%～100%、30%～70%和<30%。有研究測算，2018年8月至2019年7月中國非洲豬瘟疫情總經(jīng)濟損失約占2019年中國GDP的0.78%，ASF疫情不僅直接沖擊養(yǎng)豬業(yè)，且通過產(chǎn)業(yè)關(guān)聯(lián)，幾乎波及到所有經(jīng)濟部門［1］，對我國經(jīng)濟危害極大。

ASFV基因組大小為170～190 kb，編碼超過200種蛋白質(zhì)，其中，超過50種為結(jié)構(gòu)蛋白，其中，p10蛋白是由K78R基因編碼的一個親核結(jié)構(gòu)蛋白，位于ASFV最內(nèi)側(cè)的擬核內(nèi)，具有核定位信號。已有研究表明，p10能與單鏈或雙鏈DNA結(jié)合，推測其可能在含DNA類核的組裝中發(fā)揮作用。同時，有體外試驗證明當ASFV感染細胞時，p10在宿主細胞核中聚集，即p10具有穿過核孔的能力［2］。p49蛋白是由B438L編碼的衣殼蛋白，在感染后晚期表達，是病毒粒子感染必需結(jié)構(gòu)蛋白，當缺乏p49時病毒所形成的病毒顆粒雖具有管狀結(jié)構(gòu)，但二十面體對稱性喪失，通過免疫電鏡對完整的病毒體或病毒顆粒進行觀察，發(fā)現(xiàn)p49位于衣殼頂點附近，表明該蛋白在構(gòu)建或穩(wěn)定病毒顆粒二十面體頂點過程中起重要作用［3］。鑒于上述重要性，有必要對此2種蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行解析，但目前國內(nèi)外對ASFV蛋白和抗原表位的研究主要集中在p30［4］、p72［5］、p54［6］、CD2v［7］、K205R［8］等，對p10蛋白和p49蛋白的相關(guān)研究較少。本研究選擇了2種研究相對較少但功能很重要的結(jié)構(gòu)蛋白p10和p49作為分析對象，通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，由圖1、圖2可知，p10和p49在不同毒株中均十分保守，按照我國流行病學中心的相關(guān)監(jiān)測，目前國內(nèi)流行的非洲豬瘟病毒屬基因Ⅱ型，所以選擇了同源性約為99.95% Georgia 2007/1株（GenBank No.MK128995）［9］。傳統(tǒng)抗原表位篩選工作量大、成本費用高，生物信息學技術(shù)可很好地避免這些問題，并已被廣泛使用。本研究利用生物信息學技術(shù)對p10和p49蛋白進行了相關(guān)分析并預(yù)測了優(yōu)勢表位，以期為此2種蛋白結(jié)構(gòu)與功能的深入研究、ASFV相關(guān)診斷及疫苗產(chǎn)品的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索Georgia/2007株p10和p49蛋白的氨基酸序列。

1.2 方法

1.2.1 理化性質(zhì)分析

ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）用于蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)分析，包括：氨基酸數(shù)量、氨基酸組成、原子組成、分子式、分子量、理論等電點、消光系數(shù)、估計半衰期、不穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪族指數(shù)和親水性均值等。蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性指數(shù)間接表明了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，如果計算得到的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)<40，則認為是穩(wěn)定蛋白，>40則認為是不穩(wěn)定蛋白。

使用Expasy（https：//web.expasy.org/protscale/）中的protscale工具預(yù)測p10和p49的親水性［10］。

1.2.2 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html）［11］和DNASTAR軟件預(yù)測p10和p49蛋白的二級結(jié)構(gòu)［12］。

1.2.3 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用Phyre 2服務(wù)器（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）［13］預(yù)測p10和p49蛋白的三級結(jié)構(gòu)，該服務(wù)器通過使用多模板建模和簡化的從頭折疊模擬生成蛋白質(zhì)序列的全長3D模型。

1.2.4 抗原性分析

為分析p10和p49蛋白的潛在抗原性，本試驗使用在線預(yù)測服務(wù)器VaxiJen v2.0（http：//www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）來預(yù)測蛋白的抗原性［14］。根據(jù)服務(wù)器應(yīng)用參數(shù)的標識，對抗原保護性預(yù)測結(jié)果≥0.4為可能潛在的保護性抗原（病毒模式的閾值為0.4）。

1.2.5 抗原決定簇預(yù)測

使用Predicting antigenic peptides（http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）預(yù)測p10和p49蛋白潛在的抗原決定簇［13］。

1.2.6 優(yōu)勢B細胞線性表位的預(yù)測

利用ABCpred（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html）服務(wù)器來預(yù)測p10和p49蛋白的B細胞線性表位。ABCpred服務(wù)器基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）［15］進行預(yù)測，本研究將2種蛋白的氨基酸序列提交到服務(wù)器，從得分>0.5的多肽序列中，挑選出具有免疫原性的候選表位。

1.2.7 細胞毒性T淋巴細胞（CTL）表位的預(yù)測 CTL表位需要經(jīng)抗原呈遞細胞處理，與MHC Ⅰ類

分子結(jié)合后才能遞呈給T細胞進行識別［16］。使用NetMHCpan4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHCpan-4.1/）服務(wù)器預(yù)測多肽與MHCⅠ類分子之間的結(jié)合能力。根據(jù)綜合評分和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，篩選出p10和p49蛋白中可能結(jié)合特定MHC-Ⅰ類分子的多肽序列［17］。

1.2.8 輔助性T淋巴細胞（HTL）表位的預(yù)測

使用NetMHCpan 4.1服務(wù)器預(yù)測能與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合的多肽表位，根據(jù)抗原表位的%Rank_EL分數(shù)及干擾素-γ（IFN-γ）的釋放來選擇多肽序列，其中%Rank_EL預(yù)測結(jié)合評分的等級［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)分析

由ProtParam軟件分析結(jié)果（表1）可知，p10共有78個氨基酸，分子量為8.43 ku，理論等電點為10.98，共有3個帶負電的殘基，18個帶正電的殘基。蛋白由1 195個原子組成，化學成分為 C354H608N116O113S4。計算的不穩(wěn)定系數(shù)為53.66，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。體外半衰期預(yù)測為30 h，在體內(nèi)、酵母和大腸桿菌的半衰期預(yù)測分別大于 20 h 和 10 h。蛋白的脂肪指數(shù)為43.85，蛋白結(jié)構(gòu)的親水性平均系數(shù)為-1.086。由Expasy中protscale工具預(yù)測結(jié)果（圖3）可知，該蛋白具有親水性。

由表2可知，p49蛋白共有438個氨基酸，分子量為49.4 ku，理論等電點為9.22，共有39個帶負電殘基，51個帶正電殘基。蛋白由6 889個原子組成，化學成分為C2 193H3 402N620O663S11。計算的不穩(wěn)定系數(shù)為54.25，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。體外半衰期預(yù)測為30 h，在體內(nèi)、酵母和大腸桿菌的半衰期預(yù)測分別大于20 h和10 h。蛋白的脂肪指數(shù)為69.47，蛋白結(jié)構(gòu)的親水性平均系數(shù)為-0.749。由Expasy中protscale工具預(yù)測結(jié)果（圖4）可知，該結(jié)構(gòu)具有親水性。

2.2 p10和p49蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

由圖5可知，SOPMA分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，p10蛋白中25個氨基酸組成α-螺旋，占總氨基酸的32.05%，3個氨基酸構(gòu)成延長鏈，占總氨基酸的3.85%，9個氨基酸構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角，占總氨基酸的

11.54%，41個氨基酸構(gòu)成無規(guī)則卷曲，占總氨基酸的52.56%。由圖6可知，p49蛋白中131個氨基酸組成α-螺旋，占總氨基酸的29.91%，29個氨基酸構(gòu)成延長鏈，占總氨基酸的6.62%，33個氨基酸構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角，占總氨基酸的7.53%，245個氨基酸構(gòu)成無規(guī)則卷曲，占總氨基酸的55.94%。

DNASTAR分析使用了Gramier-Robson、Chou-Fasman、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schulz、Jameson-wolf和Emini方法預(yù)測結(jié)果。由圖7可知，p10蛋白的β-折疊分布在第3～9、16～19、20～26、27～32、33～37、49～52、55～58、60～62、68～74位氨基酸片段，無規(guī)則卷曲在第5～37、52～55、60～76位氨基酸片段。由圖8可知，p49蛋白的β-折疊分布在第6～18、32～42、72～78、163～172、179～194、235～250、342～352、390～405、418～427位氨基酸片段，無規(guī)則卷曲在第15～30、51～63、87～100、128～133、138～173、179～203、240～260、267～280、320～326、356～367、373～382、387～410和415～427位氨基酸片段。

2.3 p10和p49蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過Phyre 2預(yù)測，由圖9、圖10可知p10和p49的三級結(jié)構(gòu)。

2.4 p10和p49蛋白的抗原性分析

VaxiJenV預(yù)測p10蛋白的抗原指數(shù)為0.323 9，閾值為0.4，說明p10蛋白抗原性不強；p49的抗原指數(shù)為0.452 4，指示p49蛋白有一定的抗原性。

2.5 p10和p49抗原決定簇預(yù)測

Predicting antigenic peptides預(yù)測結(jié)果顯示，p10蛋白的平均抗原傾向是0.972 6，具有較好的抗原性，具有2個抗原決定簇，所在區(qū)域分別位于第 44～50、52～61位氨基酸；p49蛋白的平均抗原傾向是1.019 7，具有良好的抗原性，具有17個抗原決定簇，分別位于第4～12、45～51、62～68、90～96、121～127、132～139、143～156、174～183、205～230、238～246、249～255、258～271、287～331、338～348、350～359、407～414、426～434位氨基酸。

2.6 p10和p49蛋白優(yōu)勢B淋巴細胞表位預(yù)測

線性B細胞表位的預(yù)測是基于ABCpred服務(wù)器，此服務(wù)器鑒定的B細胞表位預(yù)測值范圍為 0.51～1.00 多肽序列的分值越高 其是B細胞抗

原決定簇的可能性越大，預(yù)測結(jié)果顯示，p10蛋白B細胞抗原表位共有6個，分別為第2～19、52～67、38～53、46～61、29～44、20～35、61～76、11～26位氨基酸；p49蛋白有26個，分別為第41～56、273～288、19～34、415～430、397～412、355～350、231～246、252～267、206～221位氨基酸等。根據(jù)抗原決定簇位點的預(yù)測結(jié)果和二級結(jié)構(gòu)β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲為參考，由表3可知優(yōu)勢B淋巴細胞表位。

2.7 p10和p49蛋白優(yōu)勢細胞毒性T淋巴細胞（CTL）表位的預(yù)測

T細胞表位是由NetMHCpan 4.1服務(wù)器進行預(yù)測，結(jié)果綜合評分及抗原決定簇位點預(yù)測結(jié)果和蛋白二級結(jié)構(gòu)的β-螺旋和無規(guī)卷曲，篩選出優(yōu)勢CTL細胞表位。由表4可知，共得到p10有3條優(yōu)勢表位，p49有5條優(yōu)勢表位。

2.8 p10和p49蛋白的輔助性T淋巴細胞（HTL）表位的預(yù)測

HTL（13位氨基酸）表位則是先由NetMHCpan 4.1服務(wù)器預(yù)測，初步得到序列，然后將這些序列輸入至IFNepitope服務(wù)器中，最終選出IFN-γ陽性誘導(dǎo)的序列。由表5可知，共得到3條p10優(yōu)勢表位，6條p49優(yōu)勢表位。

3 討論與結(jié)論

自2018年8月我國首次出現(xiàn)ASF以來，疫情快速蔓延至內(nèi)陸各省份。鑒于我國野豬和軟蜱的分布廣泛，更易形成ASF的自然疫源地［19］；加之目前我國的生豬養(yǎng)殖方式多樣化、養(yǎng)殖密度高、從業(yè)人員生物安全意識淡薄，導(dǎo)致我國ASF防控形勢十分嚴峻［20］。由于ASFV的復(fù)雜性，且目前對于ASFV與宿主相互作用的研究還存在一定局限性，所以疫苗的研發(fā)仍處于初始階段。當前，防控和根除ASF的方法僅限于早期診斷、檢疫和消滅疫點疫區(qū)內(nèi)易感動物，因此對高效、安全且可廣泛使用的疫苗需求非常急迫。所以深入了解ASFV的生命周期，預(yù)測各個蛋白的結(jié)構(gòu)，將會增加疫苗開發(fā)的成功率，有助于有效預(yù)防ASFV的感染。本研究通過在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)且篩選出優(yōu)勢B細胞抗原表位和優(yōu)勢T細胞抗原表位，可用作靶向藥物、表位疫苗研制的篩選對象［21］。有學者運用生物信息學方法，設(shè)計出了一種可治療牛結(jié)節(jié)疹的亞單位疫苗［22］；俱雄等通過生物信息學軟件對大腸桿菌外膜蛋白OmpC進行結(jié)構(gòu)和表位分析，重組拼接獲得OmpC蛋白表位多肽［23］，這些研究均表明生物信息學目前已廣泛運用于各種表位疫苗的設(shè)計。

本研究運用多種生物信息學方法，對Georgia 2007/1株p10蛋白和p49蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、抗原性、抗原表位進行預(yù)測。預(yù)測發(fā)現(xiàn)，p10蛋白為親水不穩(wěn)定蛋白，含有2個抗原決定簇，預(yù)測出的抗原指數(shù)為0.323 9，閾值為0.4，說明p10的抗原性不強，氨基酸中占比重較多的是無規(guī)卷曲和α-螺旋；p49蛋白的預(yù)測結(jié)果為親水不穩(wěn)定蛋白，含有17個抗原決定簇，預(yù)測出的抗原指數(shù)為0.452 4，說明p49蛋白具有一定的抗原性，二級結(jié)構(gòu)中占總氨基酸比重較多的是β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲能夠突出于蛋白的表面，表面可及性較強，容易形成抗原表位［11］，以上說明p49蛋白具有免疫原性，且極有可能存在潛在優(yōu)勢抗原表位，可以作為ASFV疫苗研發(fā)的候選蛋白。

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