摘要：分離篩選出對(duì)葡萄致腐菌灰葡萄孢有較強(qiáng)拮抗作用的拮抗菌，豐富葡萄采后保鮮拮抗菌資源，以期為葡萄灰霉病的生物防治提供理論依據(jù)和奠定應(yīng)用基礎(chǔ)。利用組織塊分離法在腐爛的葡萄果實(shí)中分離得到灰葡萄孢，梯度稀釋法從葡萄園土壤中分離得到潛力拮抗菌，通過(guò)平板對(duì)峙及瓊脂擴(kuò)散法篩選出拮抗作用較強(qiáng)的生防菌，并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定、生物學(xué)鑒定確定其種屬。通過(guò)對(duì)拮抗菌進(jìn)行溶血性測(cè)定初步探索其是否對(duì)人體有溶血作用。分離得到的葡萄致腐菌通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，病原菌PH-23菌絲初期呈灰白色，繼續(xù)培養(yǎng)會(huì)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈那嗷液稚?，菌絲繁盛，孢子眾多。對(duì)病原菌PH-23 進(jìn)行ITS、β-tub序列分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定其為灰葡萄孢。致病力測(cè)定結(jié)果表明，PH-23接種后葡萄癥狀與葡萄灰霉病癥狀相符，腐爛嚴(yán)重。篩選得到對(duì)葡萄致腐菌PH-23拮抗作用較強(qiáng)的生防菌TP-1，抑菌圈直徑為22.49 mm。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，菌體為桿狀，芽孢呈橢圓形，大小為0.62 μm×2.35 μm。TP-1革蘭氏染色陽(yáng)性。生理生化鑒定結(jié)果初步認(rèn)為T(mén)P-1為芽孢桿菌?；?6S rDNA基因、rpoB基因、gyrB基因序列分析確定其為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。拮抗菌TP-1的溶血性測(cè)定顯示其對(duì)人體無(wú)溶血作用。拮抗菌TP-1對(duì)灰葡萄孢有較強(qiáng)的拮抗作用，在葡萄采后貯藏及生物保鮮中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：葡萄灰霉病；灰葡萄孢；生物防治；生理生化鑒定；拮抗菌

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.631.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）15-0144-09

收稿日期：2023-09-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金（編號(hào)：31860024）；新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（編號(hào)：2021B02004、2022B02053-2、2022A02005）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2022YFD1400304）。

作者簡(jiǎn)介：劉 萍（1995—），女，河南信陽(yáng)人，碩士研究生，從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：1105898118@qq.com。

通信作者：史應(yīng)武，博士，研究員，從事微生物生態(tài)與植物健康研究。E-mail：syw1973@126.com。

葡萄是我國(guó)重要的水果，營(yíng)養(yǎng)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值頗高，果實(shí)汁多味美，且含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生物活性物質(zhì)［1］。我國(guó)生產(chǎn)的葡萄主要以鮮食為主，相比其他生產(chǎn)大國(guó)20％的鮮食率，我國(guó)基本上有70％用于鮮食［2］。早在2002年我國(guó)鮮食葡萄的產(chǎn)量就突破200萬(wàn)t，一躍成為世界第一的鮮食葡萄生產(chǎn)大國(guó)。但葡萄由于具有鮮嫩柔軟，皮薄肉厚，美味多汁，含水量、含糖量較高的特點(diǎn)，在采收及貯運(yùn)銷(xiāo)售過(guò)程中非常容易遭受病原菌侵染引起腐爛［3］。其中，由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是葡萄會(huì)面臨的嚴(yán)重病害，因?yàn)榕c其他致腐菌相比，Botrytis cinerea不僅具備適應(yīng)性強(qiáng)、增殖速度快以及遺傳變異大的特點(diǎn)，還擁有低溫致病與潛伏侵染的優(yōu)勢(shì)［4］。Botrytis cinerea在-5 ℃的低溫下仍可存活生長(zhǎng)，并產(chǎn)生較多的分生孢子，傳播、繁殖，因此在適宜貯藏果實(shí)的溫度0 ℃中葡萄依然存在因Botrytis cinerea而腐爛變質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，葡萄一旦被Botrytis cinerea感染，通過(guò)分生孢子的傳播，腐爛會(huì)迅速擴(kuò)散，難以控制，進(jìn)而導(dǎo)致葡萄產(chǎn)量損失嚴(yán)重［2］。

目前，主要是以農(nóng)業(yè)和化學(xué)防治的辦法來(lái)預(yù)防控制葡萄灰霉病，但這些辦法都存在一些缺陷。而利用拮抗菌進(jìn)行生物防治，能夠大大降低化學(xué)農(nóng)藥的使用率，治理農(nóng)藥殘留的問(wèn)題，與此同時(shí)還可預(yù)防病菌形成耐藥性。尤其對(duì)已形成抗藥性的病菌進(jìn)行拮抗菌防治，不失為是一種有效解決抗藥性的辦法［5］。因此，從玫瑰香葡萄腐爛的果實(shí)中分離得到致腐菌灰葡萄孢，并在從葡萄園土壤中分離得到的細(xì)菌中，利用平板對(duì)峙法篩選出對(duì)灰葡萄孢具有較好拮抗作用的拮抗菌，對(duì)其通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定、生物學(xué)鑒定進(jìn)行菌種鑒定，以期豐富葡萄灰霉病優(yōu)良拮抗菌資源，為今后的菌劑研發(fā)提供選擇，擴(kuò)大葡萄灰霉病的防治途徑。

1 材料與方法

1.1 試供材料

1.1.1 試供葡萄

玫瑰香葡萄，購(gòu)自烏魯木齊市沙依巴克區(qū)北園春水果市場(chǎng)。

1.1.2 試供土樣

選擇新疆石河子、昌吉、五家渠、博樂(lè)、庫(kù)爾勒、哈密為采樣點(diǎn)。于各采樣點(diǎn)的葡萄園中使用5點(diǎn)取樣法，用鏟子將表層土移開(kāi)，于距土壤表面5～20 cm處采樣，將同一地區(qū)采集的土樣混勻，裝入采樣袋帶回。

將采集的土樣分別過(guò)直徑2 mm的篩網(wǎng)去除石塊與雜根，將過(guò)篩后的各土樣裝入密封袋，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：氯化鈉1.5 g，牛肉浸粉0.9 g，蛋白胨3.0 g，瓊脂4.5 g，pH值為7.3±0.1（25 ℃），蒸餾水溶解，加熱玻璃棒攪拌以便充分溶解，終體積為300 mL，121 ℃滅菌15 min，備用。

NB培養(yǎng)基：氯化鈉1.5 g，牛肉浸粉0.9 g，蛋白胨3 g，pH值為7.2±0.2（25 ℃），蒸餾水溶解，加熱玻璃棒攪拌以便充分溶解，終體積為300 mL，121 ℃ 滅菌15 min，備用。

PDB培養(yǎng)基：葡萄糖6.0 g，馬鈴薯浸粉1.8 g，蒸餾水溶解，加熱玻璃棒攪拌以便充分溶解，終體積為300 mL，121 ℃滅菌20 min，備用。

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖6.0 g，馬鈴薯浸粉1.8 g，瓊脂6.0 g，pH值為5.6±0.2（25 ℃），蒸餾水溶解，加熱玻璃棒攪拌以便充分溶解，終體積為300 mL，121 ℃滅菌20 min，備用。

1.1.4 其他材料

Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、0.22 μm有機(jī)濾膜、直徑6 mm打孔器、玻璃珠、接種環(huán)、竹簽。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離純化

將玫瑰香葡萄置于溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為85%的恒溫氣候箱中，自然發(fā)病。粗篩：采用組織塊分離法。用75%乙醇對(duì)腐爛變質(zhì)的葡萄處理30 s進(jìn)行表面消毒。消毒后無(wú)菌水沖洗去除乙醇?xì)埩簦瑹o(wú)菌濾紙吸除表面水分。使用無(wú)菌鑷子及刀片將葡萄果皮與果肉分離，分別取0.5 cm2果皮與果肉置于PDA平板中，24 ℃恒溫培養(yǎng)2～5 d。純化培養(yǎng)：無(wú)菌接種環(huán)取少量粗篩單菌落菌絲以無(wú)菌水稀釋?zhuān)∠♂屢和坎加赑DA平板，24 ℃恒溫培養(yǎng)2～5 d，重復(fù)以上操作至每PDA平板均為形態(tài)一致的單菌落。

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察及致病力測(cè)定

用6 mm無(wú)菌打孔器于病原菌平板中選取單菌落打孔，獲得病原菌菌餅，將菌餅倒置（培養(yǎng)基在上方）緊貼于PDA平板中央，24 ℃恒溫培養(yǎng)2～5 d。觀察病原菌的形態(tài)特征。

對(duì)新鮮玫瑰香葡萄果實(shí)進(jìn)行表面消毒，75%乙醇處理1 min，2%次氯酸鈉處理30 s，自然晾干。將分離得到的病原菌返接到葡萄果實(shí)上，觀察發(fā)病癥狀。

1.2.3 病原菌基因組DNA提取及分子生物學(xué)鑒定

病原菌基因組DNA的提?。河脽o(wú)菌打孔器（6 mm）對(duì)病原菌平板進(jìn)行打孔，得到病原菌菌餅，取15個(gè)病原菌菌餅接種于PDB培養(yǎng)基中，容量為500 mL、裝液量為100 mL，25 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，此為病原菌種子液。取病原菌種子液1 mL，轉(zhuǎn)接于PDB培養(yǎng)基中，容量為500 mL、裝液量為200 mL，25 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，此為病原菌菌液。取病原菌菌液于50 mL離心管中，9 000 r/min 室溫離心20 min，收集病原菌菌體。將菌體用無(wú)菌濾紙充分吸除水分，利用液氮將病原菌菌體快速研磨至細(xì)膩均一的粉末狀，取適量于1.5 mL無(wú)菌離心管中。按照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒的指示說(shuō)明提取DNA，-20 ℃保存。

對(duì)病原菌的ITS基因片段進(jìn)行擴(kuò)增：引物序列為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，病原菌DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，48 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存［6］。

對(duì)病原菌的β-tub基因片段進(jìn)行擴(kuò)增：引物序列為β-tub-F1（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCvTTTC-3′）、β-tub-R1（5′-ACCCTCCGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，病原菌DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存［7］。

擴(kuò)增片段的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，觀察擴(kuò)增片段大小。所用瓊脂糖凝膠濃度為1.5%，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 5 μL，以等量ddH2O為空白對(duì)照，Maker E為參照標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定電壓90 V。電泳結(jié)束后于EB染料中染色15 min，自來(lái)水淋去染料殘留，凝膠成像分析儀觀察擴(kuò)增片段大小。將產(chǎn)生明顯條帶的PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。利用SepMan軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行序列拼接，然后在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，再利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 拮抗菌的分離純化及篩選

將采集的土樣以無(wú)菌水稀釋至合適梯度，取100 μL涂布于NA平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)14～24 h。純化培養(yǎng)：無(wú)菌接種環(huán)取單菌落以無(wú)菌水稀釋后，取稀釋液涂布于NA平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)14～24 h，純化至每NA平板均為形態(tài)一致的單菌落。

采用平板對(duì)峙法進(jìn)行拮抗菌的初篩。用無(wú)菌接種環(huán)取少量灰葡萄孢菌絲以無(wú)菌水稀釋?zhuān)∠♂屢和坎加赑DA平板。待充分吸收后，十字交叉選取4點(diǎn)，均距平板中央2.5 cm，將純化的單菌落點(diǎn)接于4點(diǎn)，24 ℃恒溫培養(yǎng)，選出可產(chǎn)生明顯抑菌圈的拮抗菌。

采用瓊脂擴(kuò)散法復(fù)篩拮抗菌。將初篩的拮抗菌接種于100 mL NB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng) 14～20 h，取菌液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min 室溫離心10 min，上清液用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，即獲得拮抗菌的無(wú)菌濾液。無(wú)菌接種環(huán)取少量病原菌以無(wú)菌水稀釋?zhuān)∠♂屢和坎加赑DA平板。待稀釋液充分吸收后，十字交叉選取4點(diǎn)，均距平板中央2.5 cm處用6 mm無(wú)菌打孔器打孔，取 80 μL 拮抗菌無(wú)菌濾液注入孔中，24 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察拮抗菌對(duì)病原菌的拮抗作用。

1.2.5 拮抗菌形態(tài)學(xué)觀察及生理生化測(cè)定 形態(tài)學(xué)觀察：用無(wú)菌接種環(huán)取單菌落以無(wú)菌水稀釋?zhuān)∠♂屢和坎加贜A平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)14～24 h，觀察其形態(tài)特征。革蘭氏染色，顯微鏡下查看其菌體形態(tài)特征。

生理生化測(cè)定：參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行［8］。鑒定項(xiàng)目有：氧化酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、苯丙氨酸、酪蛋白水解、接觸酶試驗(yàn)、酪氨酸、D-甘露糖、淀粉水解、D-阿拉伯糖、D-甘露醇、H2S產(chǎn)氣試驗(yàn)、明膠液化、檸檬酸鹽、甲基紅反應(yīng)、L-阿拉伯糖、吲哚試驗(yàn)、D-木糖、硝酸鹽還原、葡萄糖等。

1.2.6 拮抗菌基因組DNA提取及分子生物學(xué)鑒定

拮抗菌基因組DNA的提取：用無(wú)菌接種環(huán)取拮抗菌單菌落，接種于100 mL NB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)14～20 h，獲得拮抗菌菌液。取1 mL菌液于1.5 mL離心管中，按照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒的指示說(shuō)明提取DNA，-20 ℃保存。

對(duì)拮抗菌的16S rDNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增：引物序列為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，拮抗菌DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存［9］。

對(duì)拮抗菌的rpoB基因片段進(jìn)行擴(kuò)增：引物序列為rpoB-f（5′-AGGTCAACTAGTTCAGTATGGAC-3′），rpoB-r（5′-AAGAACCGTAACCGGCAACTT-3′）。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存［10］。

對(duì)拮抗菌的gyrB基因片段進(jìn)行擴(kuò)增：引物序列為gyrB UP-1（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′），gyrB UP-2r（5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′）。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，拮抗菌DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存［11］。擴(kuò)增片段的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建同“1.2.3”節(jié)。

1.2.7 拮抗菌溶血性測(cè)定

將拮抗菌與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）用無(wú)菌接種環(huán)同時(shí)于血平板上劃線，34 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。觀察拮抗菌與金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)情況，以此判斷拮抗菌是否具有溶血性：菌落周?chē)霈F(xiàn)透明溶血圈為β溶血，對(duì)人體有強(qiáng)致病力；菌落周?chē)霈F(xiàn)綠色暈圈為α溶血，對(duì)人體致病力弱；若菌株正常生長(zhǎng)無(wú)反應(yīng)，則為γ溶血，無(wú)溶血性。金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照菌株，對(duì)人體有強(qiáng)致病力，菌落周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)透明溶血圈。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)特征及致病力測(cè)定

由圖1可知，在PDA平板中，病原菌菌絲初期呈灰白色，繼續(xù)培養(yǎng)會(huì)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈那嗷液稚?，菌絲繁盛，孢子眾多?；颐共∈瞧咸奄A藏期間易發(fā)且危害嚴(yán)重的腐爛病害，初步篩選出與灰葡萄孢相似的病原菌，將其命名為PH-23。

將PH-23接種到健康玫瑰香葡萄后，葡萄表皮出現(xiàn)白色絲絨狀菌絲，后期菌絲轉(zhuǎn)變?yōu)橥粱疑?，孢子豐富易振落，果實(shí)皺縮凹陷，散發(fā)出土腥味。癥狀與葡萄灰霉病癥狀相符。

2.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定

病原菌ITS片段鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2的Ⅰ-a與 Ⅰ-b，測(cè)序片段經(jīng)比對(duì)后確定其ITS片段大小為517 bp，與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜保持一致，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果可靠?；贗TS基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中病原菌PH-23與Botrytis cinerea CLR15 （MK370693）相似性為100%。病原菌β-tub片段鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2的Ⅱ-a與Ⅱ-b，測(cè)序片段經(jīng)比對(duì)后確定其β-tub片段大小為477 bp，與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜保持一致，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果可靠?；讦?tub基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中病原菌PH-23與Botrytis cinerea ASF-Bc8 （MH208281）相似性為100%。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果最終將病原菌鑒定為灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。

2.3 拮抗菌的分離篩選

采用稀釋涂布平板法與平板對(duì)峙法結(jié)合篩選出對(duì)PH-23有拮抗作用的菌株81株，瓊脂擴(kuò)散法復(fù)篩得到拮抗菌46株。由表1可知，據(jù)抑菌圈直徑大小將拮抗菌劃分為5個(gè)等級(jí)，其中抑菌圈直徑 0～5 mm 表示拮抗效果很弱，共19株；6～10 mm表示拮抗效果弱，共6株；11～15 mm表示拮抗效果中等，共10株；16～20 mm表示拮抗效果強(qiáng)，共9株；21～25 mm表示拮抗效果很強(qiáng)，共2株。其中，拮抗效果很弱的菌株最多，占總菌株的41.3%，拮抗效果很強(qiáng)的菌株僅占總菌株的4.3%。

將拮抗效果很強(qiáng)的2株拮抗菌命名為T(mén)P-1、TP-2，選用拮抗能力最強(qiáng)的TP-1開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3，TP-1對(duì)PH-23拮抗作用明顯，抑菌圈直徑為22.49 mm。

2.4 拮抗菌的形態(tài)學(xué)特征及生理生化特征

由圖4可知，TP-1在NA平板中菌落近圓形，表面自中間向四周呈花瓣?duì)?，光滑干燥，整體乳白色，不透明；其菌體為桿狀，芽孢呈橢圓形，大小為0.62 μm×2.35 μm；革蘭氏染色陽(yáng)性。拮抗菌TP-1及模式菌株生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2，通過(guò)和枯草芽孢桿菌對(duì)比，初步認(rèn)為T(mén)P-1為芽孢桿菌。

2.5 拮抗菌分子生物學(xué)鑒定

拮抗菌16S rDNA基因片段序列分析結(jié)果見(jiàn)圖5的Ⅲ-a與Ⅲ-b，擴(kuò)增片段經(jīng)比對(duì)后大小為 1 442 bp，與凝膠電泳圖譜保持一致，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果可靠?；?6S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中拮抗菌與Bacillus velezensis PgBe186（MH211277）相似性為99.93%。拮抗菌rpoB基因片段序列分析結(jié)果見(jiàn)圖5的Ⅳ-a與Ⅳ-b，擴(kuò)增片段經(jīng)比對(duì)后大小為1 195 bp，與凝膠電泳圖譜保持一致，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果可靠?；趓poB基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中拮抗菌與Bacillus velezensis WLYS23 （CP055160） 相似性為99.93%。拮抗菌gyrB基因片段序列分析結(jié)果見(jiàn)圖5的Ⅴ-a與Ⅴ-b，擴(kuò)增片段經(jīng)比對(duì)后大小為1 148 bp，與凝膠電泳圖譜保持一致，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果可靠?；趃yrB基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中拮抗菌與Bacillus velezensis NN05 （MT119758）相似性為98.25%。綜上，基于16S rDNA基因、rpoB基因、gyrB基因序列分析確定拮抗菌為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

2.6 拮抗菌溶血性測(cè)定

由圖6可知，在相同條件與時(shí)間培養(yǎng)下，金黃色葡萄球菌周?chē)霈F(xiàn)明顯溶血圈，為β溶血，與金黃色葡萄球菌性質(zhì)一致。而拮抗菌周?chē)鸁o(wú)變化，為γ溶血，說(shuō)明拮抗菌對(duì)人體無(wú)溶血作用。

3 討論與結(jié)論

葡萄在運(yùn)輸和銷(xiāo)售過(guò)程中由于自身特性，極易受到外界的機(jī)械損傷及致腐菌感染帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此采后做好葡萄的防腐保鮮工作是必不可少的。葡萄灰霉病是葡萄最為常見(jiàn)且危害極大的采后病害之一，病原菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）不僅能夠感染葡萄，還同樣能夠作用于菜品、樹(shù)類(lèi)以及花草［12-13］，危害極大?；移咸焰吣軌蛐纬删伺c分生孢子 使其傳播迅速且可在作物殘留物中長(zhǎng)時(shí)間存活，加之可低溫生存使其有效防治變得困難［14］。當(dāng)前人們常用的化學(xué)試劑防控葡萄灰霉病雖然有效，但長(zhǎng)期使用化學(xué)試劑所帶來(lái)的的農(nóng)藥殘留、農(nóng)藥抗性以及環(huán)境的污染問(wèn)題不容忽視［15］。因此采用生物防治的辦法“以菌治菌”備受人們的青睞，相較于以往的化學(xué)農(nóng)藥，生物防治從大自然甚至植物本身分離出拮抗菌，不僅具有對(duì)人與環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗性、來(lái)源廣泛、毒性低、有助于保護(hù)生物多樣性等多種優(yōu)點(diǎn)，且可靶向性防治，高效安全［16-18］。因此，積極擴(kuò)充拮抗菌資源對(duì)高效的生物防治菌劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用有重要的基礎(chǔ)意義。

本研究從貯藏腐爛的玫瑰香葡萄中以組織塊分離法得到致腐真菌，將其命名為PH-23，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察與致病力測(cè)定初步確認(rèn)其為灰葡萄孢，而后通過(guò)ITS、β-tub基因片段進(jìn)行序列分析將其鑒定為灰葡萄孢（Botrytis cinerea），ITS序列在種內(nèi)不同菌株之間會(huì)高度保守，但是在種間則會(huì)表現(xiàn)出較大差異，因此ITS序列對(duì)于屬內(nèi)種間的系統(tǒng)學(xué)研究有較大的應(yīng)用價(jià)值。β-tub則是一種重要的管家基因，常被用作種系發(fā)育的深層分析標(biāo)記［19］。從不同葡萄園土壤中以稀釋涂布平板法與瓊脂擴(kuò)散法結(jié)合分離篩選出對(duì)PH-23有明顯拮抗作用的一株拮抗菌，抑菌圈直徑為22.49 mm，并將其命名為 TP-1。通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特性初步認(rèn)定其為芽孢桿菌，再通過(guò)16S rDNA、rpoB和gyrB等3個(gè)基因的序列結(jié)合分析將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。16S rDNA基因是細(xì)菌分離鑒定常用的通用型引物，可在所有細(xì)菌中穩(wěn)定表達(dá)，具有高度保守性。但也存在一定不足，對(duì)于親緣關(guān)系較近細(xì)菌之間的鑒定，16S rDNA分辨率不高，可能會(huì)出現(xiàn)不精確的鑒定結(jié)果［20-24］。將16S rDNA基因序列分析手段與其他核酸分析技術(shù)結(jié)合使用可更精準(zhǔn)地鑒別菌株，現(xiàn)今常用蛋白編碼基因輔助芽孢桿菌屬的分類(lèi)鑒定，如gyrB是促旋酶（gyrase）的β亞單位基因，是管家基因，在細(xì)菌的近緣物種區(qū)分鑒定方面，比16S rDNA更有分辨率，常用于細(xì)菌種水平的鑒定［25-28］。王天力等將16S rRNA基因序列與gyrB基因序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示屬于枯草芽孢桿菌群的各種、亞種的gyrB基因相似性為 75%～95%，區(qū)分效果要比16S rRNA更好［29］。而rpoB基因是編碼RNA聚合酶的β亞基，負(fù)責(zé)RNA的合成。2009年，Ki等分離得到20個(gè)芽孢桿菌，分別來(lái)自不同的海洋環(huán)境，利用16S rDNA與rpoB基因分析鑒定其多樣性，分析結(jié)果顯示以rpoB基因分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)比16S rDNA基因分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)大4.5倍［30］，說(shuō)明rpoB基因可以很好地區(qū)分鑒定芽孢桿菌菌種。

本研究分離篩選所得的TP-1對(duì)PH-23有較好的拮抗作用，抑菌圈直徑為22.49 mm，溶血性試驗(yàn)表明對(duì)人體無(wú)溶血作用，說(shuō)明TP-1具有發(fā)展為高效防治葡萄灰霉病生物菌劑的潛力。前人的研究表明，芽孢桿菌屬是極具研究開(kāi)發(fā)潛力的生防菌，主要是由于該屬可以產(chǎn)生多種抑制植物病原菌的抗生素和形成抗藥性強(qiáng)的內(nèi)生孢子［31］。貝萊斯芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物中就包含多種抗菌物質(zhì)，如淀粉環(huán)素、桿菌素、蜂毒素、表面蛋白活性劑等物質(zhì)，可抑制多種病原菌生長(zhǎng)，拮抗作用明顯，具有較大的研究?jī)r(jià)值［32］。如孫平平等研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌L-1對(duì)梨灰霉及青霉病菌有較好的抑制作用［33］；楊勝清研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌S6對(duì)番茄早疫病原菌和灰霉病原菌有明顯的拮抗作用且對(duì)常見(jiàn)病原菌有較廣的抑制作用［34］。前人的研究充分展現(xiàn)了貝萊斯芽孢桿菌的生防潛力，而本研究?jī)H僅開(kāi)始了第1步，TP-1對(duì)PH-23詳細(xì)的拮抗機(jī)理及其防治效果尚未開(kāi)展研究，有待進(jìn)一步試驗(yàn)，積極探索安全、有效、可持續(xù)的葡萄灰霉病生物防治之路。

綜上所述，本研究從貯藏腐爛的葡萄果實(shí)中分離得到致腐真菌PH-23，通過(guò)觀察形態(tài)特征及ITS、β-tub基因序列分析將其鑒定為灰葡萄孢。從21份葡萄園土壤中分離篩選出對(duì)PH-23有明顯拮抗作用的拮抗菌TP-1，通過(guò)觀察形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA、rpoB、gyrB基因序列分析將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。溶血性試驗(yàn)表明拮抗菌TP-1不具備溶血作用，在葡萄采后貯藏及生物保鮮中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

［1］宋開(kāi)艷，阿米尼古麗·再那吉，馮宏祖，等. 南疆葡萄采后致病菌分離鑒定及拮抗菌的篩選［J］. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，48（5）：871-876.

［2］李 靜. 伯克霍爾德氏菌Burkholderia contaminans B-1對(duì)玫瑰香葡萄采后病害生防潛力研究［D］. 太原：山西大學(xué)，2016.

［3］秦 丹，石雪暉，胡亞平，等. 葡萄采后貯藏保鮮研究進(jìn)展［J］. 保鮮與加工，2006（1）：9-12.

［4］李麗梅. 果蔬保鮮生物拮抗菌的篩選及劑型研究［D］. 天津：天津科技大學(xué)，2018.

［5］韓 君，范懷峰，王海娜，等. 防治灰霉病藥劑的開(kāi)發(fā)進(jìn)展［Ｊ］. 農(nóng)藥研究與應(yīng)用，2011，15（3）：5-10.

［6］徐云飛，祁依佳，溫思思，等. 浙貝母黑斑病致病菌的分離鑒定及分子檢測(cè)［J］. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，44（2）：111-118.

［7］白飛榮，姚 粟，凌 空，等. 黃曲霉和米曲霉的多相鑒定方法［J］. 微生物學(xué)通報(bào)，2018，45（1）：215-226.

［8］東秀珠，蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］. 北京：科學(xué)出版社，2001.

［9］楊 迪，杜嬋娟，張 晉，等. 香蕉枯萎病拮抗菌貝萊斯芽孢桿菌的篩選鑒定及其生物學(xué)特性［J］. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2021，37（1）：165-171.

［10］Qiu Z C，Lu X M，Li N Y，et al. Characterization of garlic endophytes isolated from the black garlic processing［J］. MicrobiologyOpen，2018，7（1）：e00547.

［11］Nochi Z，Sahebekhtiari N，Kharaziha P，et al. Comparison of 16S rRNA，23S rRNA and gyrB genes sequences in phylogenetic relationships of Shigella isolates from Iran［J］. Annals of Microbiology，2009，59（3）：615-622.

［12］Williamson B，Tudzynski B，Tudzynski P，et al. Botrytis cinerea：the cause of grey mould disease［J］. Molecular Plant Pathology，2007，8（5）：561-580.

［13］Shlezinger N，Goldfinger N，Sharon A. Apoptotic-like programed cell death in fungi：the benefits in filamentous species［J］. Frontiers in Oncology，2012，2：97.

［14］Wedge D E，Smith B J，Quebedeaux J P，et al. Fungicide management strategies for control of strawberry fruit rot diseases in Louisiana and Mississippi［J］. Crop Protection，2007，26（9）：1449-1458.

［15］黃 曦，許蘭蘭，黃榮韶，等. 枯草芽孢桿菌在抑制植物病原菌中的研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2010（1）：24-29.

［16］郭 榮. 我國(guó)生物農(nóng)藥的推廣應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展策略［J］. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2011，27（1）：124-127.

［17］朱昌雄，蔣細(xì)良，姬軍紅，等. 我國(guó)生物農(nóng)藥的研究進(jìn)展及對(duì)未來(lái)發(fā)展建議［J］. 現(xiàn)代化工，2003，23（7）：1-4.

［18］黃運(yùn)霞. 生物農(nóng)藥的研究與應(yīng)用概述［J］. 農(nóng)藥市場(chǎng)信息，2000（3）：14-15.

［19］張俊楠. 兩株鹽生海蘆筍內(nèi)生真菌分離鑒定及其次級(jí)代謝產(chǎn)物研究［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

［20］劉朝軍，沈定霞. 16S rDNA序列測(cè)定在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用［J］. 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32（7）：774-776，779.

［21］Hall L，Doerr K A，Wohlfiel S L，et al. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory［J］. Journal of Clinical Microbiology，2003，41（4）：1447-1453.

［22］Olsen G J，Larsen N，Woese C R.The ribosomal RNA database project［J］. Nucleic Acids Research，1991，19 （S1）：2017-2018.

［23］安 然，易圖永，肖啟明，等. gyrB基因在細(xì)菌分類(lèi)和檢測(cè)中的應(yīng)用［J］. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22（4）：18-20，24.

［24］Kumar A，Asthana M，Gupta P，et al. 16SrRNA sequencing of dye decolorizing bacteria isolated from soil［J］. Bioinformation，2015，11（1）：1-5.

［25］朱碧春，顧 麗，李 正，等. 南極土壤芽孢桿菌的分離鑒定及其防治玉米細(xì)菌性褐腐病的研究［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40（4）：641-648.

［26］郝云婕，韓素貞. gyrB基因在細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2008（2）：39-41.

［27］Kasai H，Watanabe K，Gasteiger E，et al. Construction of the gyrB database for the identification and classification of bacteria［J］. Genome Informatics Workshop on Genome Informatics，1998，9：13-21.

［28］侯曉麗，曹清毅，潘勁草，等. 霍亂弧菌和副溶血弧菌分離株的gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育分析［J］. 微生物學(xué)報(bào)，2006，46（6）：884-889.

［29］Wang L T，Lee F L，Tai C J，et al. Reclassification of Bacillus axarquiensis Ruiz-Garcia et al. 2005 and Bacillus malacitensis Ruiz-Garcia et al. 2005 as later heterotypic synonyms of Bacillus mojavensis Roberts et Al.1994［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007，57（Pt 7）：1663-1667.

［30］Ki J S，Zhang W，Qian P Y. Discovery of marine Bacillus species by 16S rRNA and rpoB comparisons and their usefulness for species identification［J］. Journal of Microbiological Methods，2009，77（1）：48-57.

［31］Cavaglieri L，Orlando J，Etcheverry M. In vitro influence of bacterial mixtures on Fusarium verticillioides growth and fumonisin B1 production：effect of seeds treatment on maize root colonization［J］. Letters in Applied Microbiology，2005，41（5）：390-396.

［32］Palazzini J M，Dunlap C A，Bowman M J，et al. Bacillus velezensis RC 218 as a biocontrol agent to reduce Fusarium head blight and deoxynivalenol accumulation：genome sequencing and secondary metabolite cluster profiles［J］. Microbiological Research，2016，192：30-36.

［33］孫平平，崔建潮，賈曉輝，等. 貝萊斯芽孢桿菌L-1對(duì)梨灰霉和青霉病菌的抑制作用評(píng)價(jià)及全基因組分析［J］. 微生物學(xué)報(bào)，2018，58（9）：1637-1646.

［34］楊勝清. 貝萊斯芽孢桿菌S6的鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及其生防作用研究［D］. 長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.