摘要：以紅光、藍(lán)光處理下的馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，以白光為對照，各篩選出1 206條、691條特異表達(dá)基因。通過CodonW、CUSP對篩選出的基因編碼序列（CDS）進(jìn)行密碼子使用偏好性分析。結(jié)果表明，在紅光、藍(lán)光處理下，馬鈴薯對基因密碼子的使用偏好性都較弱，都偏好使用A或T（U）結(jié)尾的密碼子。在2種光質(zhì)處理下，特異表達(dá)基因序列密碼子的GC總量都與同義密碼子在第3位的胞嘧啶和鳥嘌呤含量（GC3s）有極顯著相關(guān)性。在2種光質(zhì)處理下，高頻密碼子[相對同義密碼子使用度（RSCU）>1.00]均為30個，且高頻密碼子類型完全一致。從ENc-plot、PR2-plot和中性繪圖結(jié)果可以看出，2種光質(zhì)處理下的特異表達(dá)基因主要受到自然選擇的影響。本研究還分別從藍(lán)光、紅光處理的特異表達(dá)基因中篩選26個、28個最優(yōu)密碼子。從馬鈴薯在不同光質(zhì)處理下特異表達(dá)基因與其他生物密碼子使用頻率的比值及聚類分析結(jié)果可以看出，番茄、煙草均可作為紅光、藍(lán)光處理下馬鈴薯特異表達(dá)基因的異源表達(dá)受體。

關(guān)鍵詞：紅藍(lán)光；馬鈴薯；轉(zhuǎn)錄組；特異表達(dá)基因；密碼子；偏好性

中圖分類號：S532.01文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2024）07-1199-13Analysis of codon usage bias in potato transcriptionally specific expressed genes under red and blue light treatmentsXU Jianmin1，CHENG Liuyang2，QIU Xuewen2

（1.Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry， Jurong 212400， China;2.Agricultural Technology Extension Center of Dongtai City， Dongtai 224200， China;3.Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330000， China）Abstract：In this study， 1 206 and 691 specifically expressed genes were screened based on the transcriptome data of potato under red light treatment and blue light treatment， with white light as control， respectively. The coding sequences （CDS） of the selected genes were analyzed by CodonW and CUSP for codon usage bias. The results showed that the codon usage bias of potato genes under both red and blue light treatments was weak， with both preferring codons ending in A or T （U）. The total number of sequence codons GC under two light treatments was highly significantly correlated with GC3s. Codons with relative synonymous codon usage （RSCU） greater than 1.00 were high-frequency codons. The number of high-frequency codons under two light treatments was 30， and the types of high-frequency codons were identical. Based on the results of ENc-plot， PR2-plot and neutral plots， it was found that the specifically expressed genes under two light treatments were mainly affected by natural selection. In this study， the 26 and 28 best codons were also screened from genes specifically expressed under blue and red light treatments， respectively. The ratio of codon usage frequency of specifically expressed genes under different light treatments in potato to that in other organisms and the clustering analysis showed that both tomato and tobacco could be used as receptors for heterologous expression of potato specifically expressed genes under red and blue light treatments.

Key words：red and blue light;potato;transcriptome;specifically expressed genes;codon;preference

在自然界中，生物體內(nèi)的基因表達(dá)主要通過轉(zhuǎn)錄和翻譯2個步驟實現(xiàn)，其中轉(zhuǎn)錄是將DNA信息轉(zhuǎn)變?yōu)镽NA信息，翻譯則是將RNA信息轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)[1]，上述過程離不開密碼子的參與。在生物體內(nèi)有20種氨基酸參與蛋白質(zhì)的組成，其中部分氨基酸只對應(yīng)1個密碼子，但是大多數(shù)氨基酸對應(yīng)多個密碼子，這種1個氨基酸對應(yīng)的多個密碼子稱為同義密碼子[2]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，生物體在生存和繁衍的過程中，如果密碼子的使用是完全隨機的，則表明該生物的基因未受到任何偏倚或選擇壓力[3]。冉然等[4]研究認(rèn)為，對某一生物或某個基因組而言，若某個密碼子頻繁出現(xiàn)，則可稱該密碼子為優(yōu)化密碼子或最優(yōu)密碼子；如果某個密碼子極少出現(xiàn)或幾乎不出現(xiàn)，則可稱其為非優(yōu)化密碼子或稀有密碼子。這種密碼子出現(xiàn)頻率存在明顯使用偏好性的現(xiàn)象稱為密碼子偏好性[5]。

馬鈴薯（Solanum tuberosum）屬于茄科、茄屬多年生雙子葉植物。光質(zhì)是馬鈴薯生長環(huán)節(jié)中必不可缺的環(huán)境因素。目前有很多研究發(fā)現(xiàn)，不同光質(zhì)對馬鈴薯生長發(fā)育有極顯著的影響，例如林佳婷等[6]研究發(fā)現(xiàn)，按不同比例搭配的紅藍(lán)光質(zhì)可以顯著影響馬鈴薯塊莖的形成與淀粉的積累；楊夢平[7]研究發(fā)現(xiàn)，純藍(lán)光和紅藍(lán)光的1∶1組合可以有效促進(jìn)馬鈴薯組培苗光合色素的合成；韓逸飛等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在紅藍(lán)光照射下的馬鈴薯對不同礦質(zhì)元素的吸收與積累也存在顯著差異。目前關(guān)于大多數(shù)紅藍(lán)光處理對馬鈴薯生長發(fā)育的影響的研究集中在生理與基因功能驗證層面[9-10]。本研究擬以馬鈴薯品種轉(zhuǎn)心烏在不同光質(zhì)處理下的葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選出在紅藍(lán)光處理下的特異表達(dá)基因，并對原始序列進(jìn)行密碼子偏好性分析，將它們與其他物種進(jìn)行比較，以期為后續(xù)馬鈴薯的基因功能驗證及異源表達(dá)提供一定理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料與處理

試驗所用馬鈴薯品種為轉(zhuǎn)心烏，用MS培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)。試驗在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院進(jìn)行。從離體馬鈴薯植株中無菌采集莖段（長10～15 mm，單葉）后垂直置于MS培養(yǎng)基中，在MS培養(yǎng)基中加入30 g/L蔗糖和7.5 g/L瓊脂。在白光熒光燈下預(yù)培養(yǎng)3 d后，將各處理組置于藍(lán)燈、紅燈下培養(yǎng)30 d。用光譜輻射計（SPIC-200， Everfine Co.，杭州）檢測發(fā)光二極管（LED）燈的不同光譜特性（藍(lán)光峰值為440 nm，紅光峰值為630 nm）。每種光的光合光子通量密度保持在（50±5） μmol/（m2·s）左右，光處理在溫度（25±2） ℃、相對濕度75%、光-暗周期12 h-12 h的孵育室中進(jìn)行。每個處理用10瓶苗，每瓶裝10株苗，每個試驗設(shè)3個重復(fù)。采集2個光處理組、1個對照組的所有樣品后，立即在液氮中冷凍，保存在-80 ℃。

1.2序列處理

對采集后的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組檢測。參照劉財國等[11]、Mortazavi等[12]的方法[通過每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)（FPKM）計算基因相對表達(dá)量]，將結(jié)果中FPKM≥1的基因定義為高表達(dá)基因，而FPKM＜1的基因定為低表達(dá)或不表達(dá)基因。提取出高表達(dá)基因的編碼序列（CDS）并進(jìn)行篩選，剔除序列長度小于300 bp的基因、重復(fù)基因、不以ATG作為起始密碼子的基因、不以TAA/TAG/TGA作為終止密碼子的基因、在序列中間存在終止密碼子的基因等。

1.3密碼子使用偏好性參數(shù)分析

整理篩選好的序列后，分別用CodonW、CUSP進(jìn)行分析，獲得在不同光質(zhì)處理下表達(dá)基因序列的相對同義密碼子使用度（RSCU）、同義密碼子在第3位的胸腺嘧啶含量（T3s，%）、同義密碼子在第3位的胞嘧啶含量（C3s，%）、同義密碼子在第3位的腺嘌呤含量（A3s，%）、同義密碼子在第3位的鳥嘌呤含量（G3s，%）、同義密碼子在第3位的胞嘧啶和鳥嘌呤含量（GC3s，%）、密碼子在不同位置上的胞嘧啶與鳥嘌呤含量（GC，%）、同義氨基酸數(shù)（Lsym）、氨基酸序列的長度（Laa）、平均親水性值（Gravy值）、芳香族氨基酸頻率（Aromo值）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）、密碼子偏好指數(shù)（CBI）、最優(yōu)密碼子使用頻率（Fop）、有效密碼子數(shù)（ENc）、同義密碼子的相對使用頻率（RFSC）等參數(shù)。用SPSS對上述參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，用R語言繪制相關(guān)性分析結(jié)果圖。

1.4密碼子的ENc-plot分析、PR2-plot分析及中性繪圖分析以ENc為縱坐標(biāo)、密碼子在第3位的胞嘧啶和鳥嘌呤含量（GC3）為橫坐標(biāo)繪制散點圖，得到ENc-plot圖。理論ENc采用如下公式計算：ENc=2+GC3+29/[GC32+ （1-GC3）2]，以理論ENc為縱坐標(biāo)、GC3為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對各密碼子第3位的A、T、C、G進(jìn)行定量分析，再以G3/（G3+C3）為橫坐標(biāo)、A3/（A3+T3）為縱坐標(biāo)（G3、C3、A3、T3分別為密碼子第3位的鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶的含量）繪制散點圖，得到PR2-plot圖。再繪制X=0.5、Y=0.5 2條參考線，用于分析各密碼子堿基的使用差異。以GC12為縱坐標(biāo)、GC3為橫坐標(biāo)繪制散點圖，得到中性圖。再繪制Y=x函數(shù)曲線，作為參考線，用于后續(xù)分析。用Excel對相關(guān)點進(jìn)行擬合，得到相關(guān)系數(shù)、回歸系數(shù)與擬合函數(shù)。作圖均用Origin。

1.5最優(yōu)密碼子的確定

最優(yōu)密碼子的確定采用Wright[13]的方法。首先以ENc為依據(jù)，由高到低進(jìn)行排序，分別取兩端10%的基因建立高低表達(dá)基因庫。再以RSCU>1.00為條件，在高表達(dá)基因庫中篩選高頻密碼子，并用高表達(dá)基因庫密碼子的RSCU減去低表達(dá)基因庫密碼子的RSCU，計算出△RSCU，再以△RSCU≥0.08為條件，篩選出最優(yōu)密碼子。

1.6其他物種密碼子使用頻率的對比

將用方法1.2處理后的序列上傳至cusp網(wǎng)站（http：//emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp），計算出不同光質(zhì)處理下馬鈴薯特異表達(dá)基因的相對使用頻率（RFSC），再在Kazusa DNA研究所網(wǎng)站下載模式物種擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大腸桿菌（Escherichia coli ）、水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanum lycopersicum）、煙草（Nicotiana tabacum）及酵母（Saccharomyces cerevisiae）的密碼子相對使用頻率，并對這些物種密碼子的相對使用頻率與馬鈴薯進(jìn)行比較及聚類分析，從而進(jìn)一步分析不同光質(zhì)處理下馬鈴薯基因密碼子的使用偏好性模式。

2結(jié)果與分析

2.1序列篩選及密碼子使用偏好性參數(shù)的分析

對測序公司提供的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，在藍(lán)光處理下，在馬鈴薯中特異表達(dá)的基因有1 206條，而在紅光處理下，在馬鈴薯中特異表達(dá)的基因有691條。對這些基因序列進(jìn)行密碼子使用偏好性參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)在紅光、藍(lán)光處理下C3s、CAI、CBI、Fop、GC、Aromo值這6項參數(shù)的平均值相等，且藍(lán)光處理下T3s、A3s的平均值大于紅光處理下T3s、A3s的平均值（表1），表明在藍(lán)光處理下，馬鈴薯更偏向于使用以T、A結(jié)尾的同義密碼子。由表1可以看出，在藍(lán)光處理下，T3s、G3s、Fop、ENc、GC3s、GC、Gravy值等參數(shù)的最小值小于紅光處理下的最小值，C3s、Laa、Aromo值等參數(shù)的最小值與紅光處理下的最小值相等，其余參數(shù)的最小值均大于紅光處理下的最小值。此外，在藍(lán)光處理下，ENc、Aromo值的最大值與紅光處理下的最大值相等，其余參數(shù)的最大值均大于紅光處理下的最大值。通過對變異系數(shù)的分析可以看出數(shù)據(jù)的離散程度。由表1還可以看出，在紅光處理下，除CAI、CBI、ENc、GC3s、Gravy值外，其余參數(shù)的離散程度均略大于藍(lán)光處理下的離散程度。在密碼子使用方面，2種光質(zhì)處理下的馬鈴薯特異表達(dá)基因的GC堿基使用總量較為接近，密碼子第3位GC堿基的使用總量也均小于35%，表明2種光質(zhì)都偏向使用以A、T結(jié)尾的密碼子。

2.2不同光質(zhì)處理下馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組密碼子使用偏好性參數(shù)相關(guān)性分析對紅光、藍(lán)光處理下馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組中特異表達(dá)基因的密碼子使用偏好性相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析。如圖1所示，在2種光質(zhì)處理下，T3s與GC1間均無顯著相關(guān)性，與CAI呈極顯著正相關(guān)，與其他參數(shù)間均表現(xiàn)為極顯著負(fù)相關(guān)；在藍(lán)光處理下，C3s與G3s有顯著正相關(guān)性，與GC1無顯著相關(guān)性；在紅光處理下，C3s與G3s無顯著相關(guān)性，與GC1呈顯著正相關(guān)；在2種光質(zhì)處理下，A3s與CAI、G3s、CBI、Fop、ENc、GC1、GC2、GC3等參數(shù)之間的相關(guān)性趨勢相同，均呈極顯著負(fù)相關(guān)；在藍(lán)光處理下，CAI與GC2呈極顯著正相關(guān)，而在紅光處理下的CAI與GC2則無顯著相關(guān)性。

2.3不同光質(zhì)處理下馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組密碼子相對使用度分析對不同光質(zhì)處理下馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組特異表達(dá)基因的同義密碼子相對使用度進(jìn)行分析。如表2所示，在藍(lán)光處理下，RSCU值大于1.00的密碼子有30個，而在紅光處理下，RSCU值大于1.00的密碼子同樣有30個，且在藍(lán)光、紅光處理下RSCU值大于1.00的密碼子種類完全相同。在上述30個密碼子中，沒有以C結(jié)尾的密碼子，以A結(jié)尾的密碼子有12個，占比為40%，以G結(jié)尾的密碼子有3個，占比為10%，以U結(jié)尾的密碼子有15個，占比為50%。上述研究結(jié)果表明，在藍(lán)光、紅光2種光質(zhì)處理下，在馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組中特異表達(dá)的基因均偏好使用以A或U（T）結(jié)尾的密碼子。

2.4中性繪圖分析

對篩選出來的序列進(jìn)行分析后，進(jìn)行中性繪圖。如圖2、圖3所示，在藍(lán)光處理下，GC12的取值范圍為0.236～0.723，GC3的取值范圍為0.086～0.789；在紅光處理下，GC12的取值范圍為0.252～0.600，GC3的取值范圍為0.131～0.633。從圖2還可以看出，藍(lán)光處理下的馬鈴薯特異表達(dá)基因密碼子大多數(shù)落在對角線的上方，少部分基因密碼子落在對角線下方，表明在不同位置上，G、C的使用主要受到自然選擇的影響，GC12與GC3之間的相關(guān)系數(shù)為0.272 93，相關(guān)性不顯著，數(shù)據(jù)擬合后的回歸系數(shù)為0.175 46，也說明在藍(lán)光處理下的密碼子GC12與GC3主要受到自然選擇的影響。從圖3還可以看出，紅光處理下的馬鈴薯特異表達(dá)基因密碼子大多數(shù)落在對角線的上方，同樣各個位置的堿基使用受到自然選擇的影響，但在對角線下方的基因密碼子數(shù)量占比有所提升。進(jìn)行線性擬合后發(fā)現(xiàn)，GC12與GC3之間的相關(guān)系數(shù)為0.368 12，相關(guān)性不顯著，回歸系數(shù)為0.235 55，同樣表明紅光處理下的密碼子GC12與GC3主要受到自然選擇的影響。

2.5ENc-plot分析

對篩選出來的基因進(jìn)行ENc-plot分析，根據(jù)各基因與ENc標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對位置，可以判斷影響第3位堿基的因素。從圖4可以看出，大多數(shù)基因密碼子落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的下方，表明這些基因密碼子的使用選擇主要受到自然選擇的影響，而少部分基因密碼子落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的上方，表明這部分基因主要受到基因突變的影響。在圖5中，同樣也是大多數(shù)基因密碼子落在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，部分基因密碼子在標(biāo)準(zhǔn)曲線的上方，表明紅光處理下的馬鈴薯特異表達(dá)基因密碼子堿基選擇同樣主要受到自然選擇的影響。

2.6PR2-plot分析

從圖6、圖7可以看出，在藍(lán)光、紅光處理下，馬鈴薯特異表達(dá)基因密碼子主要集中在PR2-plot圖的右下角區(qū)域，表明在2種光處理下，密碼子第3位堿基對堿基A的使用頻率低于對堿基T的使用頻率，對堿基C的使用頻率低于對堿基G的使用頻率。此外，在靠近中心位置也有部分基因分布，表明這部分基因的密碼子組成不僅受到自然選擇的影響，同時也受到基因突變的影響。

2.7最優(yōu)密碼子分析

最優(yōu)密碼子的定義是同時具備高頻率、高表達(dá)特征的密碼子[14]。從表3可以看出，藍(lán)光處理下的最優(yōu)密碼子有26個，紅光處理下的最優(yōu)密碼子有28個。紅光、藍(lán)光處理下共有的最優(yōu)密碼子有25個，其中AGG為藍(lán)光處理下特有的最優(yōu)密碼子，UUG、CUU、AUU為紅光處理下特有的最優(yōu)密碼子。從密碼子組成來看，藍(lán)光處理下的最優(yōu)密碼子中，有13個以A結(jié)尾，1個以G結(jié)尾，12個以U結(jié)尾；在紅光處理下的最優(yōu)密碼子中，有13個以A結(jié)尾，1個以G結(jié)尾，14個以U結(jié)尾。在2種處理下的最優(yōu)密碼子中，均無以C結(jié)尾的密碼子，均只有1個以G結(jié)尾的密碼子，表明在2種光質(zhì)處理下，馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組中特異表達(dá)基因的最優(yōu)密碼子都偏好以A或U（T）結(jié)尾。

2.8馬鈴薯與其他物種密碼子使用偏好性的比較

同義密碼子的相對使用頻率也可作為衡量密碼子使用偏好性的一個重要指標(biāo)。當(dāng)2個物種的密碼子相對使用頻率比值為0.50～2.00時，說明這2個物種對該密碼子的使用特性較為一致；當(dāng)2個物種的密碼子相對使用頻率比值≥2.00或≤0.50時，則認(rèn)為這2個物種的密碼子使用特性差異較大[15]。由圖8可以看出，在藍(lán)光處理下，馬鈴薯中特異表達(dá)基因的密碼子相對使用頻率與擬南芥、煙草、番茄相比無較大差異，而與大腸桿菌、酵母、水稻和大豆相比，分別有16個、5個、19個和1個相對使用頻率差異較大的密碼子。由圖9可以看出，在紅光處理下，馬鈴薯中特異表達(dá)基因的密碼子相對使用頻率與擬南芥、煙草、番茄相比也無較大差異，而與大腸桿菌、酵母、水稻和大豆相比，分別有16個、6個、19個和1個相對使用頻率差異較大的密碼子。上述結(jié)果表明，在2種光質(zhì)處理下的馬鈴薯特異表達(dá)基因在受體選擇方面具有一定的同質(zhì)性，均可優(yōu)先選擇擬南芥、煙草和番茄。

對不同光質(zhì)處理下在馬鈴薯中特異表達(dá)基因的密碼子使用頻率與8種其他生物的密碼子使用頻率進(jìn)行聚類分析。如圖10所示，在藍(lán)光處理下，當(dāng)對馬鈴薯中特異表達(dá)基因進(jìn)行異源表達(dá)試驗受體選擇時，可以優(yōu)先選擇煙草、番茄，之后可依次選擇擬南芥、大豆和酵母等，這與通過比值計算得出的結(jié)果基本吻合。如圖11所示，在紅光處理下，馬鈴薯中特異表達(dá)基因在進(jìn)行異源表達(dá)試驗受體選擇時，同樣可以優(yōu)先選擇煙草、番茄，其次是擬南芥、大豆。在2種光質(zhì)處理下，馬鈴薯中特異表達(dá)基因在進(jìn)行異源表達(dá)試驗受體選擇時，均不推薦選擇水稻、大腸桿菌，這與通過比值計算得出的結(jié)果基本吻合。圖8藍(lán)光處理下馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組基因與其他生物密碼子使用偏好性（相對使用頻率比值）的比較

3討論

密碼子在基因表達(dá)過程中起著重要作用[16-20]，研究生物體內(nèi)密碼子的使用模式與使用特性對于揭示植物基因的轉(zhuǎn)錄翻譯效率及相對應(yīng)的功能表達(dá)具有極其重要的意義[21]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，不同物種在密碼子的使用過程中存在偏好性現(xiàn)象[22]。生物體在使用密碼子時，通常會受到多種因素的影響，主要包括在進(jìn)化過程中的自然選擇及受環(huán)境影響導(dǎo)致的基因突變壓力，繼而導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)、功能表達(dá)發(fā)生相應(yīng)改變[13]。

在本研究中，藍(lán)光處理下的馬鈴薯特異表達(dá)基因數(shù)量為1 206條，約為紅光處理下的1.7倍。馮琛等[23]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光處理下的草莓轉(zhuǎn)錄組特異表達(dá)基因數(shù)量明顯多于紅光處理，約為紅光處理的2倍，這與本研究結(jié)果基本一致;但是，草莓在紅光、藍(lán)光處理下的特異表達(dá)基因數(shù)量分別為56條、114條，與本研究結(jié)果差異較大，這或許與物種不同或其他生長環(huán)境因子不同有關(guān)。對紅光、藍(lán)光處理下的馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組基因密碼子使用偏好性參數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者都偏好使用以A或T（U）結(jié)尾的密碼子，這與對白刺[24]、橄欖[25]等的研究結(jié)果類似，且在2種光質(zhì)處理下，密碼子的總C+G含量約為30%，均明顯小于50%，這些現(xiàn)象也符合大多數(shù)雙子葉植物對密碼子使用偏好性的特征[26]。從密碼子使用偏好性參數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果可以看出，在藍(lán)光處理下，馬鈴薯中特異表達(dá)drj7wK+4vDckNR9rWc43yKEQqh1zS6kEnvK2iw6vitY=基因密碼子第3位堿基G與C之間有顯著相關(guān)性，而在紅光處理下則無顯著相關(guān)性。本研究還發(fā)現(xiàn)，在藍(lán)光處理下，G3s與C3s的變異系數(shù)均小于紅光處理，表明藍(lán)光處理下的特異表達(dá)基因數(shù)量多且穩(wěn)定。除此以外，在2種光質(zhì)處理下的特異表達(dá)基因的第3位堿基的占比與其他偏好性參數(shù)呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，這或許是由于對于密碼子堿基的選擇而言，通常第3位堿基較為保守，自然選擇對其造成的影響較小[27]，這與劉洋等[28]對向日葵的研究結(jié)果基本一致。

同義密碼子相對使用度（RSCU值）是衡量密碼子使用偏好性最重要、最廣泛的參數(shù)[29]。通過分析RSCU值的大小，可以判斷相應(yīng)密碼子的實際使用頻率與期望使用頻率之間的比值，從而分析該密碼子的使用偏好性[30]。在本研究中，紅光、藍(lán)光處理下的馬鈴薯特異表達(dá)基因的高頻密碼子種類完全一致，都偏好使用以A或T（U）結(jié)尾的密碼子，這或許與馬鈴薯屬于雙子葉植物有關(guān)，這與前人的相關(guān)研究結(jié)果[31-32]基本一致。對最優(yōu)密碼子進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在紅光、藍(lán)光處理下，共有25個相同的最優(yōu)密碼子，藍(lán)光處理下的最優(yōu)密碼子略少于紅光處理下的最優(yōu)密碼子，前人在紅光、藍(lán)光處理下草莓密碼子的使用偏好性研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[23]，認(rèn)為該現(xiàn)象與2種處理下特異表達(dá)基因的數(shù)量差距較大有關(guān)。從最優(yōu)密碼子的選擇性上也可以看出，在紅光、藍(lán)光處理下，馬鈴薯中的特異表達(dá)基因均偏好以A或T（U）結(jié)尾。

從ENC-plot分析結(jié)果可知，在2種光質(zhì)處理下，馬鈴薯特異表達(dá)基因只有少數(shù)分布于標(biāo)準(zhǔn)曲線上方，表明這部分基因在密碼子使用中主要受到堿基突變的影響；大部分基因在標(biāo)準(zhǔn)曲線的下方，表明這部分基因在密碼子使用中主要受到自然選擇的影響。在藍(lán)光處理下受到堿基突變影響的基因數(shù)量略多于紅光處理下的基因數(shù)量，這或許是由于在藍(lán)光處理下的特異表達(dá)基因多于紅光處理下的特異表達(dá)基因，在馮琛等[23]的研究中也發(fā)現(xiàn)了相關(guān)現(xiàn)象。但是從占比來看，在紅光處理下，密碼子使用受堿基突變影響的基因占比略大于藍(lán)光處理下的相應(yīng)占比。從PR2-plot分析結(jié)果可以看出，密碼子第3位堿基存在明顯的偏好性，在2種光質(zhì)處理下，T的使用頻率明顯大于A，G的使用頻率明顯大于C?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，如果密碼子使用偏好性完全由堿基突變決定，則A和T、C和G的使用頻率應(yīng)該相等[33]，而在本研究中，密碼子的使用呈現(xiàn)了明顯的偏好性，表明在2種光質(zhì)處理下的馬鈴薯特異表達(dá)基因密碼子選擇主要受到自然選擇的影響，部分密碼子受堿基突變的影響，與紅光處理相比，藍(lán)光處理下的基因更多集中在坐標(biāo)（0.5，0.5）附近，表明藍(lán)光處理下受堿基突變影響的密碼子數(shù)量略多于紅光處理。從中性繪圖結(jié)果也可以看出，在2種光質(zhì)處理下，馬鈴薯中特異表達(dá)基因的密碼子使用主要受到自然選擇的影響，少部分受到堿基突變的影響，藍(lán)光處理下受到堿基突變影響的基因數(shù)量略多于紅光處理下的。比較兩者的回歸系數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，自然選擇對藍(lán)光處理下密碼子堿基的選擇要強于紅光處理下的，這也進(jìn)一步驗證了以上猜想。

有部分研究者認(rèn)為，不同物種的密碼子相對使用頻率比值可以為目標(biāo)基因的異源生物轉(zhuǎn)化與表達(dá)提供參考[34]。晁岳恩等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在目的基因進(jìn)行異源表達(dá)時，通常要研究受體生物的密碼子使用偏好性，進(jìn)而對目的基因進(jìn)行改造與修飾，從而提高目的基因在受體中的表達(dá)效率與成功率。在本研究中，藍(lán)光處理下的馬鈴薯特異表達(dá)基因可優(yōu)先考慮以番茄、煙草作為基因表達(dá)受體，在紅光處理下則同樣可以優(yōu)先考慮以番茄、煙草作為基因異源表達(dá)的首要選擇，這或許與番茄、煙草、馬鈴薯同為茄科作物有關(guān)。何柳等[36]在進(jìn)行金銀花基因的異源表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，擬南芥比大腸桿菌、酵母更適合作為基因異源表達(dá)的底盤細(xì)胞。在本研究中，對擬南芥、酵母和大腸桿菌進(jìn)行密碼子使用頻率比較研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行受體選擇時，擬南芥優(yōu)于酵母，酵母又優(yōu)于大腸桿菌，這與前人的研究結(jié)果基本一致，這或許是由于擬南芥、馬鈴薯同屬于雙子葉植物，酵母、馬鈴薯同屬于真核生物，而大腸桿菌屬于原核生物。水稻最不適合作為馬鈴薯異源表達(dá)的受體，這或許與水稻屬于單子葉植物而馬鈴薯屬于雙子葉植物有關(guān)。本研究結(jié)果可為馬鈴薯特異表達(dá)基因的異源表達(dá)提供一定的理論基礎(chǔ)，但具體表達(dá)效率還受其他因素影響[37]，需深入研究。

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