摘要：低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DES）作為一種綠色環(huán)保、高效無毒溶劑而被廣泛應用在生物提取和化學制備領(lǐng)域。本研究擬采用DES提取綠茶中多酚類物質(zhì)，首先合成5種不同類型的DES，進行傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）與黏度值的物理表征，并與以傳統(tǒng)水溶液、70%甲醇作為溶劑所得茶多酚提取率進行比較，獲得最佳DES類型。然后，通過單因素試驗、響應面Box-Behnken設計試驗優(yōu)化用DES提取綠茶中茶多酚的工藝，并對提取前后的綠茶粉進行結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，在提取過程中，當氯化膽堿與乳酸（DES-2）的含水率為30%、提取溫度為75 ℃、提取時間29 min、料液比為1 g∶35 mL時，茶多酚提取率達25.16%，與模型預測結(jié)果相符。掃描電子顯微鏡（SEM）和X射線衍射（XRD）結(jié)果顯示，在提取過程中茶粉的晶體結(jié)構(gòu)無明顯變化，但DES使茶粉表面形貌發(fā)生改變，使褶皺面增多，從而使茶粉與溶劑有更多接觸面積，有利于多酚類物質(zhì)的溶出。此外，將DES提取法與常用的超聲波乙醇提取法、微波水提取法、熱回流水提取法的結(jié)果進行比較發(fā)現(xiàn)，DES提取法在茶多酚提取率、部分兒茶素組分提取率上均具有顯著優(yōu)勢（P<0.05）。用不同提取方法所得茶多酚提取液進行體外還原能力、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除活性試驗，發(fā)現(xiàn)不同方法所得茶多酚提取液均表現(xiàn)出抗氧化活性并且其抗氧化活性呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，以DES法獲得的茶多酚提取液的抗氧化性最強，研究結(jié)果可為茶多酚提取及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：低共熔溶劑；茶多酚；提取工藝；響應面法；抗氧化活性

中圖分類號：S571.1文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）07-1330-13Process optimization of tea polyphenols extraction from green tea by deep eutectic solvents and analysis of antioxidant activityGAO Ziwen，JIA Zhitong，WANG Lihui，LIU Yuyan，XIE Zijing，LIU Yang，TENG Jie

（School of Agricultural Sciences， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China）

Abstract：Deep eutectic solvents （DES） are widely used in biological and chemical fields as green， environmentally friendly， non-toxic and highly efficient solvents. In this study， deep eutectic solvents were used to extract polyphenols from green tea. Firstly， five different types of natural deep eutectic solvents were synthesized， and physical properties such as Fourier transform infrared spectroscopy （FT-IR） and viscosity values were characterized. Compared with extraction rates of tea polyphenols obtaining by using traditional water solution and 70% methanol organic solvent， the best DES type was acquired. Then， the single factor test and response surface Box-Behnken design test were used to optimize the extraction of green tea polyphenols based on DES， and the structure of green tea powder before and after extraction was analyzed. The results showed that when the moisture content of choline chloride and lactic acid （DES-2） was 30%， extraction temperature was 75 ℃， extraction time was 29 min， and solid-liquid ratio was 1∶35 （g/mL）， the extraction rate of tea polyphenols was 25.16%， which was consistent with the prediction of the model. The results of scanning electron microscopy （SEM） and X-ray diffraction （XRD） showed that the crystal structure of tea powder did not change significantly during the extraction process， but WC9IeqOsw1EQVT1x9L7MIDQToGL996BbCBvGrMHrwlw=the surface morphology of tea powder was changed greatly by DES， and more folds were formed on the surface of the tea powder， so that the tea powder had a larger contact area with the solvent， which was conducive to the dissolution of polyphenols. In addition， the DES extraction method was compared with the commonly used ultrasonic ethanol extraction method， microwave water extraction method， and hot reflux water extraction method. It was found that the DES extraction method had significant advantages in the extraction rates of tea polyphenols and some catechin components （P<0.05）. The tea polyphenol extracts obtained by different extraction methods were tested for in vitro reducing power and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） free radical scavenging activity. It was found that the tea polyphenol extracts obtained by different methods showed antioxidant activity and the antioxidant activity was dose-dependent. The tea polyphenol extract obtained by DES method had the strongest antioxidant activity. The results of this study can provide a theoretical basis for the extraction and development of tea polyphenols.

Key words：deep eutectic solvents （DES）;tea polyphenols;extraction technology;response surface methodology；antioxidant activity

綠茶中富含茶多酚、茶氨酸、黃酮類、生物堿等活性成分及其他微量元素，其中茶多酚是一種天然的抗氧化劑，具有抗氧化、抗輻射、抗菌、清除自由基等多種生物活性[1-2]，可用于果蔬保鮮[3]、調(diào)節(jié)人體腸道菌群、抑制肥胖[4]、消炎[5]、抗腫瘤[6]、干預阿爾茲海默病的發(fā)生[7]等。兒茶素類化合物（Catechins）作為茶多酚的主體成分，占其總量的50%～70%，包括兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素（GC）、兒茶素沒食子酸酯（CG）、表沒食子兒茶素（EGC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）等，但是不同兒茶素組分之間的生物活性存在差異[8]。將茶多酚運用到食品添加、醫(yī)療保健、日化用品等領(lǐng)域是當前解決茶葉資源利用率低的問題及提高茶葉附加價值的重要方式之一。

目前，茶多酚的提取方法主要是有機溶劑提取法、離子沉淀法、超聲波提取法等。溶劑提取法主要利用茶多酚易溶于水和醇類、酚類、酮類及酯類等的特性，可分為水浸提法和有機溶劑萃取法[9]。離子沉淀法主要利用茶多酚能夠與無機堿、鹽中的離子形成沉淀的特性[10]。超聲波提取法利用的是機械效應、空化效應及熱效應，通過提高細胞內(nèi)物質(zhì)的釋放量、擴散速度及溶解性，從而高效提取綠茶中的多酚類物質(zhì)[11]。

低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DES）是由糖類、有機酸、氨基酸和膽堿衍生物等天然化合物按一定摩爾配比后在特定條件下形成的低熔點液態(tài)混合物[12]，具有低毒、提取目標性明確、極性范圍廣、環(huán)境友好等特點，可作為許多天然活性成分的綠色萃取溶劑[13-14]。例如，王曉藝等[15]使用氯化膽堿-乳酸作為DES試劑，采用超聲輔助低共熔溶劑法提取玫瑰中的多酚，結(jié)果顯示，最佳多酚提取量為（136.20±1.23） mg/g，與乙醇提取法相比，多酚提取率提高了24%。古麗菲熱·伊力哈木等[16]采用氯化膽堿-蘋果酸提取新疆大果沙棗中的多酚類化合物，提取率為63.378 mg/g；倪玉嬌等[17]用氯化膽堿-草酸提取沙棘籽中的多酚類物質(zhì)，提取率為3.310%±0.008%；汪濤等[18]用氯化膽堿-草酸提取核桃青皮多酚，提取量為50.87 mg/g，比水溶液提取法、乙醇溶液提取法的效果好。在現(xiàn)階段低端茶尤其是綠茶產(chǎn)量相對過剩的情況下，為推動茶葉深加工及茶多酚的開發(fā)利用、減少資源浪費，本研究擬利用DES替代傳統(tǒng)方法提取綠茶中的茶多酚，以獲得較佳提取工藝，同時擬通過比較常用茶多酚提取方法的提取率及兒茶素的穩(wěn)定性，為茶多酚的開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

本研究所用綠茶于2022年6月產(chǎn)自江西省婺源縣正稀茗茶有限公司，原料為一芽二葉。

福林酚、沒食子酸、氯化膽堿、甜菜堿、乙二醇、L-（+）-乳酸、甘油、檸檬酸、甲醇、三氯化鐵、鐵氰化鉀等，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），購自上海麥克林生化科技有限公司；8個兒茶素組分原料（>99%），購自上海源葉生物科技有限公司。

Nicolet iS50型傅里葉變換紅外光譜儀，購自美國Thermo公司；SmartLab型X射線衍射儀（XRD），購自日本Rigaku公司；JSM-6010LA掃描電子顯微鏡，購自日本電子株式會社；LC-16高效液相色譜儀，購自日本島津公司；UV1901PCS紫外可見分光光度計，購自上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1DES體系的制備在DES體系中，氫鍵的受體、供體組合如下：氯化膽堿（ChCl）為氫鍵受體，乙二醇、乳酸、甘油為氫鍵供體；甜菜堿（Bet）為氫鍵受體，檸檬酸、乳酸為氫鍵供體。按照上述組合合成5種體系的DES。將經(jīng)過真空干燥的各組分按照氫鍵受體∶氫鍵供體=1∶2的摩爾比混合，在加熱條件下用磁力攪拌至形成均勻的混合液，將混合液在干燥器中儲存?zhèn)溆?，具體配制體系及常溫下的熔融狀態(tài)見表1。

1.2.2DES的表征（1）傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）的測定。將 DES 用少許無水乙醇稀釋，然后滴加適量稀釋液于溴化鉀壓片上，干燥后用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm-1 范圍內(nèi)進行掃描，以溴化鉀作為空白對照。

（2）黏度的測定。用黏度計測定黏度，首先選擇合適的轉(zhuǎn)子，將待測低共熔溶劑在不同溫度（80 ℃、70 ℃、60 ℃、50 ℃、40 ℃、30 ℃）的水浴鍋中放置10 min后，趁熱倒入樣品器中，確保溶劑完全浸沒轉(zhuǎn)子后進行測試并讀取數(shù)值，測量重復3次。

1.2.3DES類型的篩選稱取0.5 g綠茶粉置于試管中，分別加入15 mL制備的5種含水率為30%的低共熔溶劑，混勻后置于水浴鍋中進行提取。提取條件如下：溫度70 ℃，時間60 min，料液比1 g∶30 mL，將提取液于4 500 r/min離心10 min后取上清液。

1.2.4單因素試驗稱取0.25 g綠茶粉加入方法1.2.3篩選到的最佳類型DES中，分別考察單因素試驗的含水率（10%、20%、30%、40%、50%）、提取溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）、提取時間（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min）、料液比（1 g∶20 mL、1 g∶30 mL、1 g∶40 mL、1 g∶50 mL）對綠茶中茶多酚提取率的影響。

1.2.5響應面優(yōu)化茶多酚提取工藝以單因素試驗為基礎，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，選取影響較大的提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）為響應因子，用Design-Expert 8.0軟件進行擬合，以優(yōu)化綠茶中茶多酚的提取工藝，因素和水平的設計見表2。

1.2.6不同茶多酚提取方法的比較參照綠茶中茶多酚的不同提取方法，使用微波水浸提法[19]、超聲波乙醇提取法[20]和熱回流水提取法[21]中的最佳提取工藝參數(shù)，比較綠茶粉中茶多酚、兒茶素的組分含量。

1.2.7茶多酚、兒茶素組分含量的測定方法茶多酚含量的測定使用福林酚比色法，以沒食子酸作為標準品[22]。兒茶素組分含量使用高效液相色譜法（HPLC）測定，流動相A為含0.5%三氟乙酸的水溶液，B相為甲醇。采用梯度洗脫，B相參數(shù)：8.00%，0～8.00 min；8.01%～13.00%，8.01～20.00 min；13.01%～34.99%，20.01～40.00 min；35.00%，40.01～45.00 min。柱溫為35 ℃，上樣量為10 μL，于278 nm進行檢測。根據(jù)保留時間、標準品的峰面積計算各兒茶素組分的含量。

1.2.8茶多酚提取液抗氧化活性的測定

1.2.8.1還原能力的測定配制10～120 μg/mL系列質(zhì)量濃度的茶多酚提取物，分別用0.1 mL pH值為6.5、濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液和0.1 mL 1％ K3Fe（CN）6。將反應液于50 ℃孵育20 min后加入0.1 mL三氯乙酸中，于4 500 r/min離心10 min。取0.1 mL上清液，用0.1 mL純水稀釋，再向稀釋液中添加25 μL 0.1% FeCl3。以維生素C溶液作為陽性對照，記錄700 nm處的吸光度[23]。

1.2.8.2清除DPPH自由基活性的測定配制10～120 μg/mL系列質(zhì)量濃度的茶多酚提取溶液，分別添加到2.9 mL DPPH自由基溶液中。將反應混合物于室溫避光孵育30 min后在517 nm處測定吸光度。以等質(zhì)量濃度的維生素C溶液作為陽性對照，按照如下公式計算茶多酚提取溶液對DPPH自由基的清除活性[24]：

DPPH自由基清除率=（1-A）／A×100% （1）

式中：A表示DPPH自由基溶液在乙醇中的吸光度；A表示DPPH自由基溶液在測試樣品中的吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1低共熔溶劑（DES）的表征

2.1.1傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析如圖1a所示，氯化膽堿、乙二醇分別在FT-IR圖譜的3 249 cm^-1、3 297 cm-1處有吸收谷，這些吸收谷主要是由羥基振動產(chǎn)生的，DES-1中由O-H振動產(chǎn)生的吸收谷移動至3 300 cm-1處，表明氯化膽堿與乙二醇之間形成了O-H…O（羥基…氧離子）、O-H…Cl（羥基…氯離子）等氫鍵結(jié)構(gòu)。如圖1b所示，乳酸在3 403 cm^-1處出現(xiàn)較弱的O-H 伸縮振動吸收帶，在1 719 cm^-1處出現(xiàn)C=O（羰基）的伸縮振動吸收谷，在DES-2中上述吸收谷分別紅移至3 302 cm-1、1 731 cm-1處，說明ChCl和乳酸之間有氫鍵締合作用。如圖1c所示，甘油在3 285 cm^-1處存在由O-H振動產(chǎn)生的吸收谷，在DES-3中此峰移至3 309 cm^-1處，說明在DES-3中氯化膽堿與甘油之間存在氫鍵締合作用。如圖1d所示，甜菜堿、檸檬酸分別在3 368 cm^-1、3 495 cm^-1處存在O-H伸縮振動吸收帶，檸檬酸在1 696 cm-1處有1個較強烈的羰基伸縮振動區(qū)；此外，檸檬酸在3 294 cm^-1、2 560 cm^-1處各有1個較寬的吸收谷，可能由于檸檬酸形成二聚體后，羥基的伸縮振動向低波數(shù)方向位移；在DES-4中，O-H的伸縮振動吸收帶紅移至2 954 cm-1處，且吸收谷變?nèi)酰驶炜s振動帶紅移至1 713 cm^-1處，表明在DES-4中甜菜堿與檸檬酸之間有氫鍵締合作用。如圖1e所示，乳酸在3 403 cm-1附近有較弱的O-H 伸縮振動吸收帶，在1 719 cm-1處有C=O（羰基）的伸縮振動吸收谷，而在DES-5中上述吸收區(qū)及吸收谷分別紅移至3 358 cm^-1、1 723 cm^-1處，說明甜菜堿和乳酸之間形成了氫鍵。上述結(jié)果表明，本試驗選取的5種DES均制備成功。

2.1.2黏度DES具有很高黏度，主要由于DES體系中各組分間存在較大的氫鍵作用力、范德華力及靜電作用力，因此其流動性差，黏度較高[25]。DES的黏度與溫度、含水量有很大關(guān)系，一般離子液體黏度與溫度間存在指數(shù)關(guān)系，即黏度隨著溫度的升高呈指數(shù)性下降趨勢[26]。由于本研究已在單因素試驗中討論了含水率對DES提取綠茶粉中茶多酚效果的影響，因此本試驗僅在不同溫度下測定各低共熔溶劑的黏度。如圖 2所示，DES的黏度隨溫度的增高而下降，除DES-4外的所有類型DES的黏度均在250 mPa·s以下，且黏度隨溫度的變化較平緩、均勻。不同黏度值的排序為DES-2>DES-3>DES-1>DES-5，且DES-2與DES-3的黏度隨溫度下降的曲線相對于DES-1、DES-5的黏度隨溫度下降的曲線更陡峭，表明DES-2與DES-3的黏度受溫度影響較大。DES-4具有高黏度，其黏度與溫度間存在明顯的指數(shù)關(guān)系；在接近30 ℃的條件下，其黏度達到6 500 mPa·s，似黏稠膠水狀；當溫度為40 ℃時，其黏度急劇下降至1 757 mPa·s，隨后隨著溫度的升高，其黏度的變化趨于平緩。盡管如此，在80 ℃條件下，DES-4的黏度也高達253 mPa·s，超過30 ℃時其他4種類型溶劑的黏度。

另外，DES溶劑的黏度隨溫度的變化符合Arrhenius方程：

lnη=lnη-E／RT （2）

式中，η為黏度（mPa·s），η為指前因子（mPa·s），E為活化能（kJ/mol），R為摩爾氣體常量，T為熱力學溫度（K）。

由公式（2）可以得到如圖3所示溫度的倒數(shù)與黏度的擬合曲線。由圖3、表3可以看出，lnη與1/T呈明顯的線性相關(guān)，DES的黏度符合阿倫尼烏斯方程，且5種DES對溫度的依賴程度排序為DES-4>DES-2>DES-3>DES-1>DES-5。

2.2DES溶劑的篩選

以茶多酚提取率為指標，篩選出對綠茶粉中茶多酚提取效果最好的DES。在相同提取條件（提取溫度為70 ℃，提取時間為60 min，料液比為1 g∶30 mL，含水率為30%）下，5種DES對綠茶粉中茶多酚的提取效果均優(yōu)于純水；DES-2、DES-5對綠茶粉中茶多酚的提取效果均優(yōu)于70%甲醇溶液且具有顯著差異（P<0.05），其中DES-2（氯化膽堿與乳酸構(gòu)成的低共熔溶劑體系）對綠茶粉中茶多酚的提取率最高，為25.70%，DES-2、DES-5體系對綠茶粉中茶多酚的提取率無顯著差異（圖4）?？紤]到經(jīng)濟效益，氯化膽堿較甜菜堿的價格更具優(yōu)勢，且在常溫下就可儲藏，因此在后續(xù)試驗中選擇氯化膽堿-乳酸體系（DES-2）作為提取綠茶粉中茶多酚的溶劑。

2.3單因素試驗結(jié)果

2.3.1DES-2含水率的影響由圖5可以看出，隨著DES-2含水率的提高，綠茶粉中茶多酚的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當DES-2含水率為30%時，綠茶粉中茶多酚的提取率為26.67%；當DES-2含水率分別為20%、40%時，綠茶粉中茶多酚的提取率分別為25.34%、25.24%，上述3個茶多酚提取率之間無顯著差異（P>0.05）。當DES-2含水率為10%、50%時，綠茶粉中的茶多酚提取率無顯著差異（P>0.05），且DES-2含水率為10%、50%時的茶多酚提取率與DES-2含水率為30%時的茶多酚提取率之間無顯著差異（P>0.05）。當DES-2含水率超過30%并上升至50%時，綠茶粉中茶多酚的提取率反而下降，可能由于水中的H+、OH-離子氫鍵過多，使得低共熔溶劑間的氫鍵作用逐漸減弱甚至完全消失[27]，從而導致綠茶粉中茶多酚從固體到液體之間的傳質(zhì)速率降低。上述結(jié)果表明，當DES-2含水率為30%時，用于提取綠茶粉中茶多酚的效果最佳。

不同處理間標有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3.2提取溫度的影響如圖6所示，當提取溫度為50～70 ℃時，綠茶粉中茶多酚的提取率隨提取溫度的升高而上升；隨著提取溫度繼續(xù)升高至80 ℃，綠茶粉中茶多酚的提取率下降，可能由于當提取溫度過高時，使多酚類物質(zhì)的氧化加劇。當提取溫度為70 ℃時，綠茶粉中茶多酚提取率最高（25.95%），并與其他提取溫度所得茶多酚提取率之間存在顯著差異（P<0.05）；當提取溫度為40～50 ℃時，綠茶粉中茶多酚提取率隨溫度的變化不顯著（P>0.05）；當提取溫度為80 ℃時，綠茶粉中茶多酚的提取率下降至21.80%，但仍高于提取溫度為60 ℃時的20.30%提取率（P<0.05）。綜上，以70 ℃作為DES提取綠茶粉中茶多酚的最適溫度。

不同處理間標有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3.3提取時間的影響如圖7所示，隨著提取時間的增加，綠茶粉中茶多酚的提取率呈現(xiàn)先顯著升高后緩慢降低的趨勢。當提取時間為40 min時，綠茶粉中的茶多酚提取率達到最高值26.10%；當提取時間為20 min時，綠茶粉中茶多酚的提取率最低，為21.58%，但是當提取時間延長至80 min、100 min時，綠茶粉中茶多酚的提取率與提取時間為20 min相比并無顯著變化（P>0.05）。上述結(jié)果表明，延長提取時間對提高綠茶粉中茶多酚的提取率并不能起到顯著的促進作用，綜合比較后選擇40 min作為綠茶粉中茶多酚的最適提取時間。

不同處理間標有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3.4料液比的影響由圖8可知，當料液比為1 g∶30 mL時，綠茶粉中茶多酚的提取率最高，達26.57%（P<0.05）；隨著料液比由1 g∶30 mL減小至1 g∶40 mL，提取率顯著下降；當料液比為1 g∶50 mL時，綠茶粉中的茶多酚提取率最低（23.17%），但與料液比為1 g∶20 mL、1 g∶40 mL時的提取率相比無顯著差異，可能由于當料液比減小時，綠茶粉未得到完全浸提，但當料液比較高時，綠茶粉中的茶多酚提取率較低是由于DES對綠茶粉中茶多酚的提取達到飽和狀態(tài)，繼續(xù)提高料液比會導致從綠茶粉中提取的茶多酚從DES中凝聚到待提取物中[28]。綜上，料液比1 g∶30 mL最合適。不同處理間標有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.4響應面模型的建立與分析

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合原理研究提取溫度、提取時間、料液比等獨立變量對綠茶粉中茶多酚提取率的影響。為了驗證試驗結(jié)果的準確性，對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。完整的試驗設計由17個試驗點組成，包括5組中心點的驗證，并按隨機順序?qū)λ性O計點進行3次重復試驗后取均值。綠茶粉中的茶多酚提取率用二階多項式表達如下：

Y=β+ΣβX+ΣβX²+ΣΣβXX （3）

式中：Y為綠茶粉中茶多酚提取率的預測值；β為常數(shù)；β為線性系數(shù)；β為二次系數(shù)；β為交互式術(shù)語系數(shù)；X、X表示2個獨立變量。試驗運行結(jié)果如表4所示。

對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到綠茶粉中茶多酚提取率與各試驗因子編碼值的回歸模型方程為：

Y=25.50+0.46A-0.84B+0.49C-0.26AB-0.01AC+0.27BC-0.63A²-1.29B²-0.49C² （4）

式中：Y為茶多酚提取率；A為提取溫度編碼值；B為提取時間編碼值；C為料液比編碼值。方差分析結(jié)果見表5。

如表5所示，該試驗模型的P<0.000 1，具有極顯著影響；失擬項的P=0.681 1>0.050 0，影響不顯著，說明該模型具有很高的可信度[29]。所有響應變量的模型的決定系數(shù)（R2）均超過0.900 0，表明模型的擬合性良好[30]。本試驗中選擇的3個因子對綠茶粉中茶多酚提取率的影響程度排序為：B（提取時間）>C（料液比）>A（提取溫度）。一次項（A、B、C）在統(tǒng)計學上表現(xiàn)出極顯著影響；二次項（A2、B2、C2）也表現(xiàn)出極顯著影響；交互項AB、BC之間呈顯著影響。決定系數(shù)（R2）為0.987 3，表明響應值的變化98.73%來源于所選取的變量。校正后的決定系數(shù)（R2adj）為0.970 9，表明97.09%的響應值變化可以用該模型解釋；變異系數(shù)為0.79>0.05，表明本試驗設計無顯著性差異，其精確性、重復性均較好。上述結(jié)論均表明，本試驗模型的擬合程度高，可用于分析并預測DES-2提取綠茶粉中茶多酚的提取率。

2.5響應面圖分析與回歸模型的驗證

2.5.1響應面圖分析響應面的等高線形狀能顯示2個交互因素之間的相互作用情況。若等高線呈橢圓形或馬鞍形，說明2個因素間的交互作用明顯；若等高線呈圓形，說明2個因素之間的交互作用不明顯[31]。由圖9a可知，提取溫度、提取時間對綠茶粉中茶多酚提取率影響的響應面表現(xiàn)為曲度陡峭度大，且等高線呈橢圓形，說明二者間交互作用明顯，提取溫度的曲面陡峭度比提取時間的曲面陡峭度大，說明提取溫度對綠茶粉中茶多酚提取率的影響更大。由圖9b可知，提取溫度與料液比間的等高線近似圓形，表明二者之間的交互作用并不明顯。由圖9c可知，提取時間、料液比對綠茶粉中茶多酚提取率影響的響應面表現(xiàn)為曲面陡峭度大，且等高線呈橢圓形，說明二者的交互作用明顯，并且料液比曲面更陡峭，表明料液比對綠茶粉中茶多酚提取率的影響較提取時間明顯。

2.5.2回歸模型的驗證通過Box-Behnken響應面優(yōu)化試驗得到DES提取綠茶粉中茶多酚的最佳工藝參數(shù)如下：提取溫度74.64 ℃，提取時間 28.775 min，料液比1 g∶34.85 mL。在最佳工藝參數(shù)條件下，綠茶粉中茶多酚的提取率為25.498%。為了便于實際操作，優(yōu)化后的工藝技術(shù)參數(shù)如下：提取溫度75.00 ℃，提取時間29.000 min，料液比1 g∶35.00 mL，在此參數(shù)下進行3次重復驗證，得到綠茶粉中茶多酚的平均提取率為25.160%，與理論值接近，表明基于Box-Behnken響應面優(yōu)化低共熔溶劑提取綠茶粉中茶多酚的工藝可靠。

2.6用DES提取茶多酚前后綠茶粉樣品的結(jié)構(gòu)分析2.6.1XRD分析如圖10所示，用70%甲醇溶液、DES-2處理綠茶粉后，各晶體的XRD結(jié)構(gòu)與原茶粉基本相同，表明在提取過程中綠茶粉的晶體結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化。但是研究發(fā)現(xiàn)，用70%甲醇溶液、DES-2處理后，綠茶粉的結(jié)晶度略高于未處理的綠茶粉，且用DES-2處理的綠茶粉的結(jié)晶度高于用70%甲醇溶液處理的綠茶粉的結(jié)晶度，原因可能是DES對綠茶粉有一定的凝結(jié)作用[32]。

2.6.2SEM分析用SEM對用70%甲醇溶液及用DES-2提取后的綠茶粉樣品進行表征分析，觀察提取前后綠茶粉外形結(jié)構(gòu)的變化。如圖11所示，在未經(jīng)處理的條件下，綠茶粉呈現(xiàn)團粒結(jié)構(gòu)且表面光滑；用70%甲醇溶液處理后，綠茶粉的團聚程度降低，表面松散粘連；用DES-2處理后，綠茶粉的團粒結(jié)構(gòu)幾乎消失且顆粒表面有類似腸壁的褶皺，該結(jié)構(gòu)可增加茶樣與DES間的接觸面積，有利于綠茶粉中茶多酚被浸提溶出。

2.7不同提取方法所得綠茶粉中茶多酚、兒茶素組分提取率在DES提取法與其他提取方法均采用最佳參數(shù)的條件下，用相同綠茶原料進行試驗并對試驗結(jié)果進行比較。如圖12所示，不同提取方法所得綠茶粉中茶多酚提取率的整體排序如下：氯化膽堿+乳酸（DES-2）提取法>超聲波乙醇提取法>微波水提取法>熱回流水提取法。用DES-2提取法所得綠茶粉中茶多酚的提取率最高，為25.16％，而用熱回流水提取法所得綠茶粉中茶多酚的提取率最低，為18.74％。在各提取方法中，以DES-2提取法對有效成分兒茶素的提取量最多，可為有效成分的溶出提供良好的溶劑體系。此外研究發(fā)現(xiàn)，在高溫長時間提取條件下，茶多酚尤其是兒茶素類容易被氧化，并可能產(chǎn)生咖啡因和蛋白質(zhì)的絡合物，從而降低茶多酚的得率、生物活性。

2.8綠茶中茶多酚的抗氧化活性

2.8.1相對還原能力如圖13a所示，各提取方法所得綠茶中茶多酚提取液和維生素C的相對還原力（OD700）與測試質(zhì)量濃度之間遵循劑量依賴關(guān)系，且相對還原能力隨著綠茶中茶多酚提取物質(zhì)量濃度的增加而遞增，但以DES提取方法所得綠茶中茶多酚的相對還原能力最強，接近對照（維生素C）的相對還原能力。

同一類物質(zhì)的不同處理間標有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。EC：表兒茶素；EGC：表沒食子兒茶素；ECG：表兒茶素沒食子酸酯；EGCG：表沒食子兒茶素沒食子酸酯；GCG：沒食子兒茶素沒食子酸酯；CG：兒茶素沒食子酸酯；C：兒茶素；GC：沒食子兒茶素。

2.8.2對DPPH自由基的清除活性如圖13b所示，茶多酚對DPPH自由基的清除率先隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增大，隨后趨于平衡。茶多酚質(zhì)量濃度與對DPPH自由基的清除率間呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。當茶多酚質(zhì)量濃度為120 μg/mL時，DES提取液、超聲波乙醇提取液、微波水提取液和熱回流水提取液對DPPH自由基的清除活性分別為94.03%、79.63%、73.66%、63.58%。IC50 值表示對DPPH自由基的清除率達到一半時抗氧化劑的質(zhì)量濃度，其值越小，表明其抗氧化能力越強，在本研究中，IC50 值的排序如下：維生素C<DES<超聲波乙醇提取法<微波水提取法<熱回流水提取法，可見以DES提取法得到的綠茶中茶多酚提取液的活性最強。

3討論

目前，常用的茶多酚提取方法有溶劑提取法、超聲波提取法、離子沉淀法等，其中溶劑提取法工藝簡便、成本低廉，但茶多酚的萃取率較低。盡管利用有機溶劑萃取可以提高茶多酚的提取率，但提純程度不高，需要進行多次分離，且步驟較繁瑣，存在一定的安全隱患[9]。離子沉淀法具有操作簡便、成本低廉等優(yōu)點，但在生產(chǎn)過程中容易殘留金屬離子，提取出的茶多酚制成品易造成安全隱患[10]。超聲波提取法具有快速、高效等優(yōu)點，但多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)容易在浸提過程中被破壞[11]。相比于傳統(tǒng)的有機溶劑，DES可與酚類物質(zhì)形成氫鍵，從而獲得更高提取量，并能保持酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性[33]。

DES含水率對提取效果影響的原理主要是離子水之間可以形成氫鍵，從而降低溶劑的黏度，進而提高茶多酚從茶樣中到低共熔溶液中的傳質(zhì)速率[34]。此外，多酚類物質(zhì)具有多個羥基，屬于極性物質(zhì)，水可增加DES的極性，從而促進生物資源中極性化合物的溶解[16]。提取條件對提取率的影響也很大，提高提取溫度可以促進物質(zhì)的熱運動，使多酚類物質(zhì)更快、更多地析出，但是溫度過高會使茶多酚的提取率下降，因為高溫會使多酚類物質(zhì)氧化加劇，從而使其失去活性。料液比也對提取率有影響，合適的料液比不僅能夠提高茶多酚的有效提取率，還能促進溶劑的最大化利用。XRD分析、SEM分析結(jié)果均表明，DES-2對茶粉表面結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響，使綠茶粉更易與溶劑接觸，從而使其有效成分能夠更好地浸提析出。此外，在抗氧化活性方面，利用DES提取所得茶多酚的還原能力較好且對DPPH自由基的清除活性也很高，具有Qk6+dsalZvmb75SWKuRL5g==很強的抗氧化性，原因是由于DES內(nèi)產(chǎn)生的氫鍵對茶多酚具有保護作用，使其在提取過程中不被氧化破壞，從而保持較高的生物活性。

4結(jié)論

本研究建立了一種從綠茶中高效提取茶多酚的工藝方法。制備的5種DES經(jīng)過FT-IR分析證實被成功合成。通過比較用純水、70%甲醇溶液和不同DES提取綠茶中茶多酚的提取率發(fā)現(xiàn)，由ChCl-乳酸合成的DES的提取效果較好，在含水率為30%、提取溫度為75 ℃、提取時間為29 min、料液比為1 g∶35 mL的條件下，茶多酚的提取率為25.16%。提取前后綠茶粉的XRD圖、SEM圖結(jié)果表明，與傳統(tǒng)溶劑相比，DES作為溶劑提取綠茶中的多酚類化合物時，茶粉的晶體結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化，但表面形貌特征發(fā)生褶皺，表面積增大，從而有利于茶多酚類物質(zhì)的溶出，提高提取率。同時，與常用的超聲波提取法、微波提取法、熱回流提取法相比，DES提取法在茶多酚提取率、兒茶素組分穩(wěn)定性上均具有顯著優(yōu)勢，且該提取法獲得的茶多酚體外還原能力、對DPPH自由基的清除活性均較好。由研究結(jié)果可知，DES提取法避免了使用傳統(tǒng)有毒有害溶劑，且提取效果遠優(yōu)于常用提取方法，具有綠色、便捷、高效等優(yōu)點，可為DES代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機溶劑進行天然產(chǎn)物的提取研究提供可行性依據(jù)。

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