摘 要：為探究鹿源彭氏變形桿菌（Proteus penneri）致病及耐藥機(jī)制，利用二代測序技術(shù)對從云南野生動物園病死梅花鹿（Cervus nippon）肺組織中分離鑒定出的1株彭氏變形桿菌F2d株進(jìn)行基因組測序，將獲得的F2d株基因組序列注釋到毒力因子、耐藥基因和代謝通路等數(shù)據(jù)庫中。毒力因子數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示，菌株含黏附、營養(yǎng)代謝、運(yùn)動和免疫調(diào)節(jié)等類型毒力因子；耐藥基因數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示，F(xiàn)2d株對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、黏菌素類和磺胺類等多種抗生素耐藥，并且攜帶多種抗生素外排機(jī)制編碼基因；代謝通路數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示，注釋的基因富集在42個通路上，其中新陳代謝相關(guān)注釋的基因數(shù)量最多，共有2 250個基因分布在12個通路上。利用基因組測序技術(shù)分析鹿源彭氏桿菌F2d株致病性、耐藥情況及代謝特點(diǎn)，可為預(yù)防彭氏變形桿菌感染和相關(guān)藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：基因組測序；梅花鹿；彭氏變形桿菌；毒力與耐藥基因；功能分析

中圖分類號：S852. 61

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：2310 - 1490（2024）- 03 - 0513 - 08

DOI：10.12375/ysdwxb.20240307

彭氏變形桿菌（Proteus penneri）隸屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）變形桿菌屬（Proteus）［1］，是一種人獸共患條件性致病菌，侵染人可引起原發(fā)性或繼發(fā)性食管、呼吸道、腸道和尿路感染并引發(fā)敗血癥［2?3］。在動物上，Cao 等［4］首次在凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）中分離鑒定出1株高致病性彭氏變形桿菌。曾晨爔等［5］研究發(fā)現(xiàn)彭氏變形桿菌可引起暹羅鱷（Crocodylus siamensis）幼鱷食管結(jié)節(jié)和敗血癥，并造成部分幼鱷死亡，該菌對巴西龜（Trache?mys scripta）的致病力較強(qiáng)，與感染暹羅鱷幼鱷的結(jié)果一致。

2021年11月云南省野生動物園1頭6月齡梅花鹿（Cervus nippon）突然死亡，死前主要表現(xiàn)為抽搐和神經(jīng)癥狀。剖檢發(fā)現(xiàn)心包積液，肺臟淤血、充血和實(shí)化，肝和腎腫大、充血，其他器官無肉眼可見的病理變化。病死鹿的病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：肺泡毛細(xì)血管充血，肺泡壁增厚，肺泡內(nèi)有脫落的組織碎片，肺間質(zhì)水腫；肝毛細(xì)血管充血，明顯水腫，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)假小葉；腎小球毛細(xì)血管充血，腎小管上皮發(fā)生壞死、脫落。此后，對其肺、腎和肝等組織進(jìn)行病原菌分離，經(jīng)16S rDNA鑒定為彭氏變形桿菌。

細(xì)菌感染是影響梅花鹿保護(hù)和馴養(yǎng)的重要因素之一，現(xiàn)已報(bào)道的梅花鹿源致病菌有化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes）［6］、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）［7］、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multo?cida）［8］、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）［9］、布氏桿菌（Brucella sp.）［10］和大腸埃希氏菌（Esch?erichia coli）［11］等，但尚未有梅花鹿感染彭氏變形桿菌的報(bào)道。

目前，NCBI數(shù)據(jù)庫中共有12條彭氏變形桿菌基因組數(shù)據(jù)記錄，其來源包括人（Homo sapiens）、馬來穿山甲（Manis javanica）、紅原雞（Gallus gallus）和豬（Sus sp.）等，數(shù)據(jù)庫中有相應(yīng)基因組的注釋信息，但未搜索到相關(guān)基因組學(xué)文獻(xiàn)的報(bào)道。全基因組測序可有效整合利用細(xì)菌的全基因組信息，在研究細(xì)菌重要特性和變異進(jìn)化方面有很高的分辨率［12］。本研究利用全基因組測序技術(shù)，對云南野生動物園病死梅花鹿肺中分離鑒定的彭氏變形桿菌F2d株進(jìn)行基因組測序分析，以期獲得該菌株的完整基因組信息，確定其攜帶的毒力基因、耐藥基因等生物學(xué)特征，進(jìn)一步揭示致病機(jī)制、耐藥機(jī)制，為預(yù)防彭氏變形桿菌感染及相關(guān)藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 材料

彭氏變形桿菌分離自云南省野生動物園病死梅花鹿的肺臟組織，由西南林業(yè)大學(xué)動物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1. 2 菌種處理

在LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h得到彭氏變形桿菌F2d株菌懸液，經(jīng)4 ℃、6 000 r/min離心10 min獲得菌體，用于后期研究。

1. 3 菌株基因組測序、組裝和分析

將凍存樣品置于干冰中，送至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行全基因組測序，將獲得的原始測序數(shù)據(jù)過濾優(yōu)化［13］，采用A5-miseq［14］和SPAdes［15］對去除接頭序列的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼裝，構(gòu)建contig和scaffold。對得到的拼裝結(jié)果進(jìn)行評估和比較，并使用Pilon［16］軟件進(jìn)行堿基校正。

1. 4 功能元件預(yù)測

采用CRISPRCasFinder、GeneMarkS、tRNAscan-SE、Barrnap和Rfam對F2d株中的非編碼RNA、CRISPRs等功能元件進(jìn)行預(yù)測。

1. 5 細(xì)菌毒力因子及耐藥基因檢測

將F2d 株基因組序列與毒力基因數(shù)據(jù)庫（virulencefactor database，VFDB）和抗生素耐藥基因數(shù)據(jù)庫（the comprehensive antibiotic research database，CARD）進(jìn)行比對［17?18］，檢測基因組中存在的與毒力因子和抗生素抗性相關(guān)的基因。

1. 6 基因功能分析

將F2d 株基因組序列分別與CAZy、COG、KEGG、GO、TCDB和PHI等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，從而獲得預(yù)測基因的注釋信息。

2 結(jié)果

2. 1 基因測序與組裝

基于Illumina NovaSeq測序平臺，使用第二代測序技術(shù)對彭氏變形桿菌F2d進(jìn)行基因組測序，去除接頭及低質(zhì)量的reads后從頭拼裝，總共獲得226個scaffolds。F2d 株基因組序列總長為7 238 711 bp，N20、N50、N90長度依次為170 398、88 108、23 492 bp，最長序列和最短序列分別為259 928 、525 bp，GC值為47. 04%。

2. 2 功能元件分析

對獲得的F2d株基因組進(jìn)行功能元件分析，采用GeneMark. hmm建立相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)模型，對基因組中蛋白質(zhì)編碼基因預(yù)測，共獲得7 024個蛋白質(zhì)編碼基因，總大小為6 264 870 bp，占基因組總大小的86. 55%，平均大小為891. 92 bp。

對F2d株中主要的非編碼RNA類型進(jìn)行預(yù)測，其中rRNA 7 個（3 個5S rRNA，2 個16S rRNA，2 個23S rRNA），tRNA 104個，其他ncRNA 212個。

CRISPRs存在于原核生物基因組中，能夠給宿主提供某種獲得性免疫。本次預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2d株中共存在8條CRISPRs結(jié)構(gòu)。

2. 3 毒力因子及耐藥基因分析

將F2d株全基因組在毒力因子數(shù)據(jù)庫VFDB中進(jìn)行BLAST比對。從注釋結(jié)果可知，F(xiàn)2d株的毒力由多種類型的毒力因子介導(dǎo)，包括營養(yǎng)代謝、黏附、運(yùn)動和免疫調(diào)節(jié)等（表1）。

將F2d株基因組在耐藥基因數(shù)據(jù)庫CARD中進(jìn)行比對，檢索出多種抗生素耐藥基因，包括β-內(nèi)酰胺類（blaoxa-10、blaCTX-M-65、blaCMY-47）、四環(huán)素類（tetA、tetD、tetL、tetM、tet34）、黏菌素類（arnA、arnC、phoQ、phoP、eptA、ugd）、磺胺類（folP、sul1、sul3），以及多種外排泵編碼基因等（表2）。

2. 4 基因功能注釋

2. 4. 1 CAZy數(shù)據(jù)庫注釋

將F2d 株基因組序列與碳水化合物活性酶CAZy數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共檢測出209個CAZy 酶類基因，其中糖苷水解酶類基因有86個，糖基轉(zhuǎn)移酶類基因有60個，碳水化合物酯酶類基因有37個，輔助活性酶類基因有12個，多糖裂解酶類基因有4個，此外，還包含與碳水化合物結(jié)合相關(guān)的酶類基因10個。

2. 4. 2 COG數(shù)據(jù)庫注釋

將F2d株基因組序列與COG蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，預(yù)測與已知蛋白具有同源性的蛋白，結(jié)果顯示共有6 228個基因注釋到20組COG 的功能中（圖1），4 610個蛋白與已知蛋白或假設(shè)蛋白同源，1 627個蛋白功能未知，匹配數(shù)量大于400的基因有：碳水化合物運(yùn)輸與代謝相關(guān)蛋白535個，轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白460個，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝相關(guān)蛋白432個，復(fù)制、重組和修復(fù)相關(guān)蛋白421個，細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生相關(guān)蛋白405個。

2. 4. 3 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋

將F2d 株基因組序列與KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，預(yù)測基因編碼蛋白參與的生物通路。KEGG注釋結(jié)果顯示注釋的基因富集在六大分類的42個通路上。其中，細(xì)胞過程共有295個基因分布在4個通路上，環(huán)境信息處理共有589個基因分布在3個通路上，遺傳信息處理共有394個基因分布在4個通路上，人類疾病共有217個基因分布在11個通路上。新陳代謝注釋的基因數(shù)量最多，共有2 250個基因分布在12個通路上，遺傳信息處理方面共有81個基因分布在8個通路上。

2. 4. 4 GO數(shù)據(jù)庫注釋

將F2d株基因組序列與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共注釋出5 247個蛋白編碼基因。生物過程相關(guān)基因數(shù)量最多，為4 891個；其次是分子功能相關(guān)基因，共4 580個；最少的是細(xì)胞組分，為2 043個基因。

生物過程層面共有44種功能注釋，細(xì)胞氮化合物代謝過程、生物合成過程功能相關(guān)基因最多，分別為1 788、1 615個。細(xì)胞組分層面共有13種功能注釋，細(xì)胞組成及胞內(nèi)組分相關(guān)基因最多，分別為1 604、1 168個。分子功能層面共有26種功能注釋，離子結(jié)合和DNA結(jié)合相關(guān)基因最多，分別為1 540、828個。

2. 4. 5 TCDB注釋

將F2d株基因組序列與TCDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共有1 308個基因注釋到TCDB數(shù)據(jù)庫中，分別編碼通道與孔道（226個）、電化學(xué)勢驅(qū)動轉(zhuǎn)運(yùn)體（380個）、主要活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（576個）、轉(zhuǎn)錄組（142個）、跨膜電子載體（48個）、運(yùn)輸時涉及的附屬因素（54個）和不完全表征的運(yùn)輸系統(tǒng)（186個）。

2. 4. 6 PHI數(shù)據(jù)庫注釋

將F2d株基因組序列與PHI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共注釋到1 649個基因（圖2）。其中，970個基因突變后毒力減弱，416個突變后不受影響，118個基因突變后毒力增加，95個突變后喪失致病性，23個突變成效應(yīng)子，19個突變后致死。

3 討論

全基因組測序分析是揭示菌株的潛在功能及相關(guān)分子機(jī)制的重要手段［19］。盡管在當(dāng)前的NCBI數(shù)據(jù)庫中記錄了12 條彭氏變形桿菌的基因組數(shù)據(jù)（2 條完整），并有較詳細(xì)的基因組注釋，但基于PubMed 和ScienceDirect 未搜索到有關(guān)該菌基因組方面的文獻(xiàn)報(bào)道。基于基因組的注釋數(shù)據(jù)可分析F2d株基因組中的基因分布情況，進(jìn)而對分離株的毒力和耐藥表型作出相應(yīng)地推斷，故本研究利用二代測序技術(shù)，對鹿源彭氏變形桿菌進(jìn)行基因組測序，將得到的基因組序列與VFDB、CARD、CAZy、COG、KEGG、GO、TCDB和PHI等多個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對其參與的代謝過程進(jìn)行分析，重點(diǎn)對毒力因子和耐藥基因進(jìn)行了分析。

微生物的致病性主要由毒力因子決定，毒力因子是致病的重要因素［20］。由毒力因子VFDB數(shù)據(jù)庫比對的結(jié)果可知，F(xiàn)2d株包含多種毒力因子，包括侵襲因子、黏附因子、營養(yǎng)代謝和免疫調(diào)節(jié)等。Ⅰ型菌毛在F2d株黏附相關(guān)的毒力因子中占比最高，包括fimA、fimC、 fimD、 fimF、 fimG 和fimH 等，這些基因所編碼的Ⅰ型菌毛可增強(qiáng)變形桿菌的黏附、定殖能力。有報(bào)道顯示，Ⅰ型菌毛是多種細(xì)菌的黏附因子，通過侵襲引發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答以及促進(jìn)對宿主黏膜表面的黏附等途徑增強(qiáng)細(xì)菌的致病力，在病原菌侵襲宿主并引發(fā)感染的過程中起重要作用［21］。鐵離子是多種生化反應(yīng)及電子傳遞等生物過程的輔助因子，是生物體必需的金屬元素，在自然界中，鐵元素主要以不溶性的氫氧化物或氧化物形式存在，且生物體內(nèi)游離鐵的濃度較低，致病菌很難直接利用宿主體內(nèi)的鐵離子。在F2d株中檢測出多種與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的毒力因子，包括耶爾森桿菌素（Yersiniabactin）、腸桿菌素（Enterobactin）等，這類毒力基因編碼的YBT、ENT鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)與鐵的結(jié)合力較高，能夠從轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白中螯合鐵，在致病菌獲取鐵離子的過程中起重要作用［22］。

微生物的抗生素耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，是由多個生理生化過程共同協(xié)作形成，包括形成改變藥物作用靶位基因、細(xì)胞膜滲透性變化或孔蛋白孔徑變窄、滅活酶和外排泵排出抗生素等［23］。耐藥基因數(shù)據(jù)庫CARD 比對結(jié)果顯示，F(xiàn)2d 株可能擁有多種耐藥機(jī)制。F2d株中含有β-內(nèi)酰胺酶編碼基因，如頭孢菌素酶編碼基因blaCMY-47、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶編碼基因blaCTX-M-65等，破壞抗生素分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使抗生素降解從而產(chǎn)生耐藥性［24?25］。氨基糖苷類耐藥基因在F2d株中也有所表達(dá)，包括氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因APH（4）-Ⅰa 以及氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因aac（3）-Ⅰa、aac（3）-Ⅳ、aac（3'）-Ⅰ等。F2d株中含有多種多藥外排機(jī)制相關(guān)的編碼基因，其中，marR、acrR 基因不僅參與編碼RND外排泵，還改變抗生素靶點(diǎn)產(chǎn)生耐藥性，marA 編碼了RND外排泵蛋白的同時降低抗生素的通透性。soxR、tolC 基因編碼的蛋白與ABC、RND 和MFS 3 種外排泵功能有關(guān)；soxS 編碼蛋白不僅具有上述3種外排泵功能，同時還能改變抗生素靶點(diǎn)、降低抗生素通透性。多種耐藥基因共存會導(dǎo)致多重耐藥甚至泛耐藥的發(fā)生，降低獸用抗生素的治療效果，使細(xì)菌性感染更加難以治療，甚至在人與動物或環(huán)境接觸等途徑中傳播至人類，威脅人類的健康。

對彭氏變形桿菌F2d株基因功能分析，有助于預(yù)測該菌的生物學(xué)功能。微生物碳水化合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與CAZy的底物相結(jié)合后，可以提高CAZy催化底物的活性，加快反應(yīng)速率［26］。從CAZy數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果得知，在F2d株碳水化合物活性酶中，糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的數(shù)量最多，結(jié)構(gòu)多糖可以被特定的糖苷水解酶水解，而合成天然糖基結(jié)構(gòu)需要糖基轉(zhuǎn)移酶。高效的糖基轉(zhuǎn)移酶是天然產(chǎn)物糖基化的關(guān)鍵因素，為藥物的研發(fā)提供了可能性［27］。

將F2d株蛋白質(zhì)編碼基因序列與COG、KEGG和GO數(shù)據(jù)庫注釋分析發(fā)現(xiàn)，代謝過程的基因富集程度最高，3個數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果一致，這說明了代謝過程對于維持細(xì)菌的生命至關(guān)重要［28］。此外，COG注釋結(jié)果中發(fā)現(xiàn)F2d株有較多的與基因重組、轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，這提示毒力因子與抗性基因的整合會導(dǎo)致變異株的出現(xiàn)，進(jìn)一步加強(qiáng)菌株的毒力或耐藥性。因此，為了研發(fā)對應(yīng)藥物或提高疫苗的高效性，需要充分了解菌株的生物學(xué)信息［29］。

4 結(jié)論

本研究對云南野生動物園病死梅花鹿肺中分離的彭氏變形桿菌F2d株進(jìn)行了基因組測序與生物信息學(xué)分析，并分析基因組攜帶的毒力因子、耐藥元件和代謝通路，發(fā)現(xiàn)分離株基因組中攜帶大量的毒力基因和耐藥基因，這暗示分離株具有高致病性和強(qiáng)耐藥性，研究結(jié)果豐富了梅花鹿源分離菌的資料。彭氏變形桿菌作為一種人獸共患條件性致病菌，在人和動物上的病例均有報(bào)道，了解該菌株基因組的結(jié)構(gòu)和功能，分析與致病和耐藥機(jī)制中的相關(guān)基因，為預(yù)防和治療彭氏變形桿菌的感染提供理論基礎(chǔ)。

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