摘要急性腦梗死（Acute cerebral infarction， ACI）具有起病急、死亡率高的特點，快速判斷ACI 的發(fā)生發(fā)展對患者的診治和預后方案的制定具有關鍵作用。研究表明，人血清中觸珠蛋白（Haptoglobin， Hp）的含量水平與ACI 有關。本研究采用表面增強拉曼散射技術（Surface enhanced Raman scattering， SERS）結合免疫反應，建立了血清中Hp 的定量分析方法。首先，在硅片上制備銀納米粒子SERS 基底，以4-巰基苯甲酸（4-Mercaptobenzoic acid， MBA）為拉曼探針，通過形成Ag—S 鍵將其連接在納米粒子表面， MBA 的羧基與自制的高效價Hp 抗體的氨基通過酰胺鍵共價交聯(lián)連接到SERS 基底上，從而形成檢測Hp 的SERS 自組裝芯片（Ag/MBA/anti-Hp）。Hp 可以被Ag/MBA/anti-Hp 基底上的抗體特異性捕獲，從而引起MBA 的SERS 特征峰發(fā)生位移。結果表明， Hp 濃度的對數(shù)與MBA 的SERS 特征峰位移之間存在良好的線性關系，線性范圍為1～1000 ng/mL（R2=0.988）。采用本方法對90 例ACI 患者血清中的Hp 濃度進行了測定，測定結果與ELISA方法的結果一致，證明了本方法的實用性和準確性。本方法特異性強，簡易便捷，實現(xiàn)了對血清中Hp 的特異性識別及定量分析，有望成為臨床檢測血清中Hp 的有效手段，為ACI 患者的治療和預后方案的制定提供參考。

關鍵詞觸珠蛋白；急性腦梗死；表面增強拉曼散射；抗體

腦梗死（Cerebral infarction， CI）是由腦部血管閉塞或動脈狹窄引起，臨床上定義為由于特定區(qū)域的血液供應不足而引起的腦組織損傷[1]。急性腦梗死（Acute cerebral infarction， ACI）是指ACI 患者在1 周內(nèi)發(fā)病且診斷為輕型，或ACI 患者在1 個月內(nèi)發(fā)病且診斷為重型。近年來， ACI 已成為全球第三大死亡和致殘原因，而我國ACI 的發(fā)病率、死亡率以及患病風險均高于全球平均水平[2]。ACI 具有靜息狀態(tài)發(fā)病、起病迅速、可在幾小時或幾天內(nèi)達到病情高峰期的特點。因此， ACI 的早期診斷對于提高療效、減少潛在的后遺癥和死亡率至關重要。目前，臨床上主要利用頭顱計算機斷層掃描（CT）以及磁共振成像（MRI）等醫(yī)學影像技術對患者進行動脈造影從而確定病灶位置[3]。但是，早期ACI 患者的醫(yī)學影像并不典型，對圖像解釋不一致的情況時有發(fā)生[4]，使得ACI 的診斷效率和準確率大大降低。血液是臨床檢測中最容易獲取的樣本材料，隨著ACI 領域的研究深入[5]，研究者逐漸關注到尋找可用于ACI 的早期診斷和指導個體化治療的潛在ACI 血液標志物具有重要的臨床意義和應用價值。

ACI 致腦損傷是一系列復雜的神經(jīng)生理和神經(jīng)病理事件的結果，與興奮性毒性、氧化應激、神經(jīng)炎癥、細胞凋亡以及淀粉樣蛋白的產(chǎn)生等過程密切相關[6]。觸珠蛋白（Haptoglobin， Hp）是一種與免疫球蛋白分子結構相似的四聚體蛋白，在正常情況下，血液中Hp 濃度在300～2000 μg/mL 范圍內(nèi)（血紅蛋白結合法檢測）。當機體處于急性應激狀態(tài)時， Hp 水平顯著升高，提示機體發(fā)生了急性病理生理反應[7-8]。動物實驗研究表明，大鼠發(fā)生ACI 后， Hp 濃度顯著升高[9]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下，血清中Hp 水平高的人發(fā)生缺血性腦卒中的幾率比Hp 水平正常的人高2 倍，提示血清中Hp 水平有可能成為預測ACI發(fā)生的指標[10]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，首次發(fā)生急性ACI 的患者入院10 d 后，其血清中Hp 濃度顯著高于初入院時，提示血清中Hp 水平有可能作為ACI 病情發(fā)展的指標，并可用于判斷急性ACI 患者的預后情況[11]。研究者也對血清中Hp 水平與腦梗死發(fā)生發(fā)展的關系進行了研究，發(fā)現(xiàn)血清中Hp 水平與ACI 嚴重程度正相關[12]，并且是預后不良的危險因素[13-14]。綜上，血清中Hp 含量水平對ACI 患者的病情判斷、治療策略及預后均具有一定的參考價值。

表面增強拉曼散射（Surface enhanced Raman scattering， SERS）技術因具有選擇性高、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點而成為近年來生物分子標志物研究領域的熱點技術之一[15]，廣泛應用于臨床疾病診斷[16]和病毒檢測[17]等領域。SERS 檢測通常是以金、銀和石墨烯等物質(zhì)[18]為基底并與待檢測物質(zhì)相結合，使表面吸附分子的拉曼散射信號強度增加106～1014 倍[19]。近年來， SERS 已被大量應用于蛋白標志物的定性和定量分析[20-22]。目前，有關SERS 檢測Hp 的報道不多，并且多是基于SERS 特征峰的強度進行定量分析[23-24]，而基于強度的定量分析方法不可避免地會因基底不均勻而導致檢測結果不準確。與之相比，基于SERS 特征峰位移的定量分析方法具有更好的光譜重現(xiàn)性，已逐漸形成了位移定量分析法取代強度定量分析法的趨勢。

本研究采用可特異性識別Hp 的SERS 自組裝芯片對Hp 進行定量分析。以4-巰基苯甲酸（MBA）為拉曼探針，通過Ag—S 鍵將其連接到均勻的SERS 基底上，進一步通過其羧基與Hp 抗體的氨基形成酰胺鍵，將Hp 多克隆抗體固定在SERS 基底上?；贖p 抗體對Hp 的特異性識別能力， Hp 可被芯片識別捕獲，引起MBA 特征峰位移， Hp 濃度的對數(shù)與MBA 特征峰位移之間存在良好的線性關系，基于此實現(xiàn)Hp的定量分析。本研究制備的SERS 自組裝芯片具有特異性好及操作簡便等優(yōu)點，為Hp 的臨床檢測提供了新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LabRAM ARAMIS 拉曼光譜儀（法國Horiba Jobin-Yvo 公司）；JEM-2100F 透射電子顯微鏡和JSM-7800F 掃描電子顯微鏡（日本JEOL 公司）；Neofuge 15R 冷凍離心機（力康公司）；GL124-1SCN 電子分析天平（美國Sartorius 公司）；Synergy H1 酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

Hp 抗原標準品（Hp Ag）、AgNO3、牛血清蛋白（BSA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和丙酮（分析純，美國Sigma 公司）；HRP 標記的羊抗兔抗體（美國Signalway 公司）；1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、三乙胺（TEA）、H2O2（30%）、檸檬酸鈉（C6H5Na3O7，分析純）、H2SO4（98%）和氯仿（CHCl3）（分析純，北京化工廠）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，分析純，百靈威公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS， 0.01 mol/L KH2PO4-Na2HPO4， pH=7.2，含0.8%（m/V）NaCl，美國賽默飛公司）；MBA（C7H6O2S，上海凜恩科技發(fā)展有限公司）；乙醇和甘氨酸（國藥集團化學試劑有限公司）。實驗用水為Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。Hp檢測ELISA 試劑盒（武漢貝茵萊生物科技公司）；N 型100 單晶面硅片（中國電子科技集團公司第四十六研究所）。清潔級大耳白兔（億斯實驗動物技術公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 臨床樣本的采集。

本研究采用吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院2019 年12 月到2021 年1 月未經(jīng)治療的ACI 患者血清，所有患者皆為首次發(fā)病且發(fā)病時間均在72 h 內(nèi)，共計90 例。取患者在入院后24 h 內(nèi)進行生化指標檢測的血液樣本離心后，取上層血清500 μL 至微量離心管中，于?80 ℃儲存?zhèn)溆?。本研究已獲得吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會批準（批準文件編號：20201112），患者知情同意。

1.2.2 Hp多克隆抗體的制備

通過查詢蛋白數(shù)據(jù)庫UNIPROT 后獲得Hp 蛋白氨基酸序列，對Hp 的信號肽和跨膜結構進行分析，制定Hp 重組蛋白抗原的表達方案，表達純化測試后，選擇最佳的表達純化條件進行放大。將Hp 重組蛋白抗原作為免疫原免疫清潔級大耳白兔，免疫時間和劑量如電子版文后支持信息表S1 所示。大耳白兔用酒精消毒后，對其背后固定免疫點位進行6～8 點注射，對第3、第4 次免疫后的抗血清效價進行檢測（要求抗血清效價gt;32000）。第4 次免疫后，取大耳白兔心臟血液并離心收集血清，于?20 ℃儲存?zhèn)溆?。將Hp 重組蛋白抗原與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱，將所得抗血清與PBS 等量混合后緩慢上樣，待抗體結合后，用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，得到純化抗體，立即在PBS 中進行透析過夜。采用ELISA 法檢測抗體效價，將Hp 重組蛋白抗原濃度稀釋至5 μg/mL， 逐孔加入酶標板后（每孔100 μL），于4 ℃包被過夜。用5% BSA室溫封閉1 h，棄去BSA 后，用PBS 洗板3 次，按照10 倍梯度法對Hp 多克隆抗體進行系列梯度稀釋，并設置陰性對照孔和空白對照孔。依次加入Hp 多克隆抗體樣品后，用封板膜封板，于37 ℃溫育1 h， PBS 洗滌5 次，將HRP 標記的羊抗兔二抗IgG 按照最佳條件稀釋后加入孔內(nèi)，再次孵育1 h（37 ℃）。棄去封板膜和孔內(nèi)液體，甩干后每孔加滿PBS，靜置30 s 后棄去，重復洗滌5 次后，拍干孔板內(nèi)液體。每孔先加入顯色劑，輕輕振蕩混勻， 37 ℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL 終止反應。以空白孔調(diào)零，依次測量各孔在450 nm 處的吸光度（OD 值）。Hp 重組蛋白樣品經(jīng)十二烷基磺酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后在100 V下轉(zhuǎn)膜， BSA 封閉1 h 后，洗膜3 次，每次10 min。以本研究中所得到的Hp 多克隆抗體為一抗，與二抗結合顯色后觀察結果。

1.2.3 SERS自組裝芯片的制備

本研究采用銀納米粒子（AgNPs）作為芯片的增強基底。將0.036 g AgNO3 加入到250 mL 燒瓶中，加入200 mL 超純水，攪拌溶解并加熱煮沸，加入1%檸檬酸鈉溶液，當溶液顏色變?yōu)辄S色時，降溫至85 ℃，繼續(xù)加熱攪拌30 min，得到AgNPs[25]。采用本研究組前期建立的方法[26]制備SERS 自組裝芯片（圖1），其制備過程如下：（1）制備銀硅片基底。準備一塊3 mm×3 mm 的硅片，分別使用超純水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇和超純水依次超聲清洗，每次超聲5 min。清洗完畢后，對硅片進行羥基化處理，即將洗凈的硅片放在H2O2/濃H2SO4（3∶7， V/V）溶液中，加熱煮沸至有氣泡冒出，繼續(xù)加熱，直至氣泡消失，冷卻至室溫，用超純水洗凈。羥基化處理后，將硅片浸泡到聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA）溶液中孵育30 min，取出，反復沖洗后，將硅片置入制備好的AgNPs 溶液中，反應6 h。（2）將上述基底浸潤在100 μmol/L MBA 溶液中12 h， MBA 通過其巰基與Ag 形成Ag—S 鍵而連接到AgNPs 表面，然后再放入EDC-NHS（1∶2， n/n）溶液中2 h，進行羧基活化。（3）取10 μg/mL Hp 多克隆抗體與制備好的帶有探針的基底浸泡混合，孵育2 h，用BSA 溶液（0.1 mg/mL）封閉2 h。將制備好的芯片用超純水沖洗3 次后，用氮氣吹干，于4 ℃ 保存。

1.2.4 Hp的定量分析

將一定濃度的Hp 抗原標準品用0.01 mol/L PBS（pH 7.2）稀釋，得到不同濃度梯度（1、5、10、50、100、500 和1000 ng/ml）的標準溶液。將SERS 自組裝芯片浸泡在50 μL 不同濃度的Hp 標準品溶液中，37 ℃下孵育2 h， 用水沖洗3 次后，氮氣吹干，在激發(fā)光源633 nm、功率15 mW、掃描時間5 s 條件下進行拉曼光譜測試。以0.01 mol/L PBS（pH 7.2）作為對照，記錄MBA 探針分子在1070 cm–1 附近的SERS 特征峰位移。

用0.01 mol/L PBS（pH 7.2）將血清稀釋10 倍，將SERS 自組裝芯片浸泡在其中， 37 ℃反應2 h， 用水沖洗3 次后，氮氣吹干，在激發(fā)光源633 nm、功率15 mW、掃描時間5 s 條件下進行拉曼光譜測試，記錄MBA 探針分子在1070 cm–1 附近的SERS 特征峰位移。

2 結果與討論

2.1 Hp重組抗原的設計與合成

經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢后得到Hp 的抗原信息：

MSALGAVIALLLNGQLFAVDSGNDVTDIADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYQCKNYYKLRTEGDGVYTLNDKKQWINKAVGDKLPECEADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYOCKNYYKLRTEGDGVYTLNNEKOWINKAVGDKLPECEAVCGKPKNPANPVQRILGGHLDAKGSFPWQAKMVSHHNLTTGATLINEQWLLTTAKNLFLNHSENATAKDIAPTLTLYVGKKQLVEIEKVVLHPNYSQVDIGLIKLKOKVSVNERVMPICLPSKDYAEVGRVGYVSGWGRNANFKFTDHLKYVMLPVADQDQCIRHYEGSTVPEKKTPKSPVGVQPILNEHTFCAGMSKYQEDTCYGDAGSAFAVHDLEEDTWYATGILSFDKSCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKTIAEN

分析蛋白性質(zhì)后，采用大腸桿菌系統(tǒng)表達179-406aa 蛋白，載體采用pET28b， C 端添加GS linker 及6*His 標簽，酶切位點采用Nco1/Xho1，表達菌株為BL21（DE3），進行重組表達抗原制備。經(jīng)設計后，添加純化標簽的Hp 重組蛋白抗原信息：

MVSHHNLTTGATLINEQWLLTTAKNLFLNHSENATAKDIAPTLTLYVGKKQLVEIEKVVLHPNYSQVDIGLIKLKQKVSVNERVMPICLPSKDYAEVGRVGYVSGWGRNANFKFTDHLKYVMLPVADQDQCIRHYEGSTVPEKKTPKSPVGVQPILNEHTFCAGMSKYQEDTCYGDAGSAFAVHDLEEDTWYATGILSFDKSCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKTIAENHHHHHH

優(yōu)化后的Hp 重組蛋白抗原具有234 個氨基酸殘基，理論分子量為26.28 kDa， SDS-PAGE 結果如電子版文后支持信息圖S1 所示，在25 kDa 處Marker 上方可見1 條清晰條帶，實測蛋白分子量約為26 kDa，證實得到了純化的Hp。

2.2 Hp多克隆抗體的鑒定

采用純化的自制Hp 多克隆抗體包被酶標板，利用ELISA 檢測抗體效價（見電子版文后支持信息圖S2），結果表明， Hp 多克隆抗體效價最高可達1∶128000（OD=0.14）。采用Western Blot 實驗對其進行檢測， Hp 特異性條帶顯示在26 kDa 附近，證明Hp 多克隆抗體有效且特異性好。

2.3 SERS基底的制備

硅片經(jīng)羥基化處理后表面帶有負電荷， PDDA 溶液帶有正電荷，基于靜電作用將PDDA 結合到硅片表面。制備的AgNPs 表面帶有負電荷，可與硅片表面吸附的PDDA 結合，至此完成了SERS 基底的自組裝。采用透射電子顯微鏡（SEM）觀測，所制備的AgNPs 粒徑約為40～50 nm， 并且較均勻（圖2A）；AgNPs 與硅片表面吸附的PDDA 結合后，所制備的SERS 基底表面均勻（圖2B）。

2.4 Hp在制備的SERS自組裝芯片上的拉曼響應

2.4.1 SERS自組裝芯片與Hp的反應

0.1 mmol/L MBA 通過Ag—S 鍵吸附在SERS 基底上，吸附過程與隨后Hp 抗體的偶聯(lián)可以通過SERS光譜證實。圖3A 為自組裝芯片制備過程中的SERS 譜圖，圖3B 為1070 cm?1 附近區(qū)域的放大圖。未吸附MBA 時， SERS 基底幾乎沒有SERS 峰（圖3A，曲線a）；吸附MBA 后，出現(xiàn)了MBA 的譜峰（圖3A，曲線b），其中， 1073 cm?1 處的峰歸屬為MBA 的具有C—S 鍵拉伸的平面內(nèi)環(huán)呼吸模式。當將Hp 抗體偶聯(lián)在基底表面后，在1370 cm?1 處的SERS 峰消失。1370 cm?1 處的峰歸屬于MBA 的COO—拉伸模式[27]，當基底與生物大分子（如抗體和蛋白質(zhì)）結合時，此峰消失（圖3A 曲線c 和d），證明Hp 抗體成功通過其氨基與MBA 的羧基形成酰胺鍵，并連接到SERS 基底上。上述結果表明成功制備了SERS 自組裝芯片。

隨著Hp 蛋白加入，抗原抗體的結合誘導拉曼探針分子MBA 發(fā)生變形，即MBA 分子的極化率發(fā)生改變，這表現(xiàn)為SERS 特征峰位移變化[26]。如圖3所示，當在SERS 自組裝芯片上加入Hp 后，由于Hp 與芯片上的Hp 抗體結合， MBA 在1073 cm?1 處的特征峰發(fā)生了明顯位移至1076 cm?1（圖3B）。因此，可以利用SERS 特征峰的位移實現(xiàn)對Hp 的痕量檢測。

2.4.2 Hp孵育時間的影響

將SERS 自組裝芯片浸泡在50 ng/mL Hp 溶液中，在37 ℃記錄不同孵育時間下MBA 在1073 cm?1 處特征峰的位移。如圖4 所示，在120 min 之前， MBA 的SERS 位移隨著反應時間延長而增大；120 min 之后， SERS 位移基本不變。因此，本研究選擇SERS 自組裝芯片與Hp 的孵育時間為120 min。

2.4.3 SERS自組裝芯片對Hp的檢測性能

采用自制的SERS 自組裝芯片檢測不同濃度的Hp 標準品溶液， SERS 圖譜如圖5 所示，隨著Hp 濃度（1～1000 ng/mL）增大，在1073 cm?1 處MBA 特征峰的位移逐漸增大，特征峰的位移（y）與Hp 濃度（ng/mL）的對數(shù)值（x）呈線性關系，線性方程為y=0.743x+0.699（R2=0.988），檢出限為0.69 ng/mL（S/N=3）。

2.4.4 方法的特異性

采用本方法檢測前列腺特異性抗原（PSA）、胰島素自身抗體（IAA）和Hp，結果如圖6 所示。只有Hp 存在時， MBA 在1073 cm?1 處的SERS 特征峰才發(fā)生位移；10 倍濃度的PSA 和IAA 存在時，未發(fā)現(xiàn)明顯的SERS 位移。結果表明，制備的SERS 自組裝芯片具有良好的特異性，可特異性識別Hp。

2.4.5 血清中Hp的加標回收試驗

將一定濃度的Hp 抗原標準品溶液加入稀釋的人血清中，采用本方法進行檢測，結果如表1所示，回收率為91%～94%，相對標準偏差（RSD）低于3.2%，表明本方法檢測血清樣品中的Hp的準確性和實用性良好。

2.4.6 臨床樣本檢測

根據(jù)病人病情（輕、中、重）各抽取30 例血清（共90 例），采用本方法檢測血清中的Hp 含量，并與ELISA 試劑盒測得的Hp 濃度進行比較，結果表明，兩種方法的檢測結果具有較好的一致性（表2），因此，采用本方法可準確檢測血清中的Hp 濃度。檢測結果也表明，隨著病情進展， Hp 濃度逐漸升高，這與Hp濃度水平與ACI 嚴重程度呈正相關的研究報道[12]相符。

3 結論

Hp 參與ACI 的發(fā)生、發(fā)展及預后過程，其在血液中的含量與ACI 患者的病情嚴重程度密切相關。本研究構建了以Ag/MBA/anti-Hp 為基底的SERS 自組裝芯片，并通過測定MBA 的SERS 特征峰位移對Hp 進行定量分析。Hp 濃度在1～1000 ng/mL 范圍內(nèi)，其對數(shù)值與MBA 的SERS 特征峰位移之間具有良好的線性關系，基于此可特異性檢測臨床血液樣品中的Hp 含量。本研究為ACI 的診斷、療效觀察及預后提供了新的檢測方法。

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基于表面增強拉曼散射特征峰位移檢測觸珠蛋白

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