摘要：光照時間對烤煙的產(chǎn)質(zhì)量具有重要影響。通過盆栽試驗對烤煙進(jìn)行長日照（16 h光照/8 h黑暗）和短日照（8 h光照/16 h黑暗）培養(yǎng)，對各處理的煙葉進(jìn)行化學(xué)成分和代謝組學(xué)分析，從代謝組學(xué)水平上探討不同光照時間對烤煙生長和品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，長日照處理的煙葉褪黃較多，生長較快；短日照煙株的氮代謝延遲，成熟緩慢。長日照處理上、中部煙葉還原糖含量較短日照處理分別提升30.56%、33.82%，總氮含量分別降低11.50%、20.46%，化學(xué)成分協(xié)調(diào)性變好。代謝組學(xué)分析顯示，長日照和短日照煙株中共有92種差異代謝產(chǎn)物（短日照煙株相對長日照煙株4種上調(diào)和88種下調(diào)），包括氨基酸、有機(jī)酸、糖類和嘧啶；功能分析表明，這些產(chǎn)物在14條KEGG途徑中顯著富集，涉及代謝通路、嘧啶代謝、苯丙氨酸代謝和苯丙素類生物合成。因此，光照時間可能通過調(diào)節(jié)烤煙的代謝通路、苯丙素類生物合成、嘧啶代謝、氨基酸相關(guān)途徑和煙酸衍生生物堿合成，從而影響烤煙生長發(fā)育和品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：烤煙；光照時間；質(zhì)量；LC-MS；代謝組學(xué)

中圖分類號：S572.04" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）14-0094-07

收稿日期：2023-08-06

基金項目：廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司項目（編號：2021450000340021）。

作者簡介：王 政（1979—），男，碩士，高級農(nóng)藝師，主要從事優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)研究及管理。E-mail：16627843@qq.com。

通信作者：韋建玉，研究員，主要從事煙草栽培技術(shù)和煙葉質(zhì)量研究，E-mail：jtx_wjy@163.com；趙園園，講師，主要從事煙草栽培生理研究，E-mail：zhaoyy2019@henau.edu.cn。

煙草作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國各地廣泛種植。自然環(huán)境是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)烤煙的生態(tài)基礎(chǔ)，烤煙可以適應(yīng)多種生長條件，但對環(huán)境卻非常敏感［1］。煙草是一種喜光作物，光作為重要的生態(tài)因子之一，對煙草的生長發(fā)育、生理生化反應(yīng)和物質(zhì)代謝均有較大影響，在煙草質(zhì)量的形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［2-3］。光照條件不僅會影響植物光合速率、蒸騰速率等光合特性，也會影響光合產(chǎn)物的積累和分配［4-5］。因此，光照充足且溫度適宜會促進(jìn)烤煙干物質(zhì)的形成和積累；而光照不足時，煙葉生長緩慢，多出現(xiàn)不熟、假熟現(xiàn)象，從而影響煙葉的質(zhì)量［6］。

研究發(fā)現(xiàn)，隨著光照時間的延長，煙葉中的總氮和煙堿含量降低［7］；而隨著光照時間的縮短，烤煙葉片中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、鉀、煙堿和總氮的含量顯著增加，還原糖和總糖含量降低，不利于煙葉的正常落黃、成熟，還會降低烤煙的香氣品質(zhì)［8］，表明光照時間對烤煙的產(chǎn)質(zhì)量也有重要影響。但是，目前有關(guān)光照時間對烤煙質(zhì)量的潛在影響的系統(tǒng)研究較少。因此，本研究通過比較烤煙在長日照和短日照條件下的生長差異，從代謝組學(xué)水平探討不同光照時間對烤煙品質(zhì)的影響，揭示不同光照時間下影響烤煙葉片質(zhì)量的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，為我國煙草優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2022年5—8月，在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家煙草栽培生理生化研究基地氣候室設(shè)置盆栽試驗，氣候室的環(huán)境設(shè)置為：溫度22～28 ℃，光照度 800 μmoL/（m2·s），相對濕度85%，采用時間繼電器（DH48S-s）控制日照時間。

供試烤煙品種為K326，將種子在2%次氯酸鈉中消毒2次，每次 5 min，然后再播種至填充有基質(zhì)的200孔（2.5 cm×2.5 cm）播種盤（長67 cm×寬34 cm×高6 cm）中，將播種盤放置在塑料育苗箱（長70 cm×寬40 cm×高24 cm）中進(jìn)行漂浮育苗。當(dāng)幼苗生長到4～5張煙葉（約40 d）時，選擇健康且長勢均勻的幼苗，將其移植到裝滿基質(zhì)的花盆（1株/盆）中，共12盆。使用Hoagland營養(yǎng)液，硝態(tài)氮（NO-3-N） ∶銨態(tài)氮（NH+4-N）質(zhì)量比3 ∶1。在9葉1心階段，將12個花盆隨機(jī)分為2組：長日照處理（T1）、短日照處理（T2），每處理各6盆。T1和T2處理的日照時間分別為16 h光照/8 h黑暗和8 h光照/16 h黑暗。培養(yǎng)60 d后，采集煙草葉片樣品進(jìn)行樣品處理和分析測定，煙株生長狀態(tài)如圖1所示。

1.2 測試指標(biāo)與方法

1.2.1 煙葉質(zhì)體色素

培養(yǎng)60 d后，每個處理選取代表性的煙株，采集上部葉（B2F）和中部葉（C3F）并剔除其主脈和第一支脈，每個樣品取粉碎后的煙末0.2 g，采用分光光度法測定葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量［9］。每個處理3次重復(fù)。

1.2.2 煙葉常規(guī)化學(xué)成分

利用AAⅢ型連續(xù)流動化學(xué)分析儀（德國布朗盧比公司），按照YC/Z 240—2008《煙草及煙草制品標(biāo)準(zhǔn)體系》［10］測定各樣品的還原糖、煙堿、總氮、蛋白質(zhì)、淀粉、鉀含量。每個處理3次重復(fù)。

1.2.3 代謝物的提取

葉片樣本送往上海源茲生物科技有限公司進(jìn)行代謝組學(xué)分析。使用液氮研磨葉片樣品，將150 mg樣品添加到1 mL提取溶液中（V甲醇 ∶V乙腈 ∶V水=2 ∶2 ∶1）。渦流混合后，將混合物在4 ℃超聲30 min，然后在-20 ℃下放置 1 h。在4 ℃、13 000 r/min條件下離心15 min后，收集上清液，隨之進(jìn)行真空干燥濃縮。將干燥粉末用 100 μL 乙腈水溶液（V乙腈 ∶V水=1 ∶1）重新溶解，在4 ℃、14 000 r/min條件下離心15 min后，取上清液用于液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析。

1.2.4 LC-MS

用安捷倫1290 Infinity LC超高效液相色譜（UHPLC）系統(tǒng)進(jìn)行色譜分析，該系統(tǒng)配備ACQUITY UPLCHSS T3柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm，沃特氏公司）。LC-MS過程在4 ℃進(jìn)行，注射體積10 μL，柱溫25 ℃，流速0.3 mL/min。流動相A是25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氫氧化銨，流動相B是乙腈。洗脫梯度設(shè)定如下：0～0.5 min，95%B；0.5～7 min，65%B；7～9 min，40%B；9～10 min，40%B；10～11.1 min，95%B；11.1～16 min，95%B。將質(zhì)量控制（QC）樣本插入樣本隊列，以測試和評估系統(tǒng)的穩(wěn)定性和試驗的可靠性。

通過LC分離后，使用Triple TOF 5600質(zhì)譜儀（AB SCIEX）對樣品進(jìn)行MS分析。電噴霧電離（ESI）的條件為：源溫度，600 ℃，離子噴射電壓±5 000 V（正負(fù)離子模式）；TOF MS掃描質(zhì)荷比（m/z）范圍，60～1 200 u；產(chǎn)品離子掃描m/z范圍，25～1 200 u；TOF MS掃描光譜累計時間，0.15 s/個；產(chǎn)物離子掃描光譜累計時間，0.03 s/個。通過信息相關(guān)采集獲得二次質(zhì)譜，并使用高靈敏度模型［解聚電位±60 V（正負(fù)離子模式），碰撞能量 30 eV］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2011進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，通過SPSS 17.0用多重比較法（LSD）進(jìn)行差異顯著性檢驗（α=0.05）。使用Proteo Wizard軟件（版本3.0.8789）將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML格式的文件，然后采用XCMS程序進(jìn)行峰的識別、過濾和排列，生成由質(zhì)荷比（m/z）、保留時間（RT）和峰值強(qiáng)度組成的數(shù)據(jù)矩陣，通過R語言進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）。根據(jù)Plt;0.05、|log2FC|gt;1和VIPgt;1的標(biāo)準(zhǔn)（FC表示差異倍數(shù)，VIP表示變量投影重要度），結(jié)合t檢驗、單變量分析和多變量統(tǒng)計方法，確定差異代謝物。使用MBROLE 2.0對鑒定的差異代謝物進(jìn)行代謝途徑富集分析，該分析基于京都基因和基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫，其中P＜0.05的值為顯著富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照時間對煙葉質(zhì)體色素含量的影響

如表1所示，長日照處理上部葉的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量較短日照處理分別降低12.26%、34.29%、14.29%；長日照處理中部葉的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量較短日照處理分別降低12.75%、41.67%、21.95%，且均差異顯著（Plt;0.05）。

2.2 光照時間對煙葉化學(xué)成分含量的影響

對煙葉主要化學(xué)成分進(jìn)行分析（表2），長日照處理上部葉的還原糖、淀粉含量較短日照處理分別提升30.56%、14.59%，中部葉的還原糖、淀粉含量分別提升33.82%、24.47%；長日照處理上部葉的煙堿、總氮、蛋白質(zhì)含量較短日照處理分別降低11.69%、11.50%、12.29%，中部葉的煙堿、總氮、蛋白質(zhì)含量分別降低22.42%、20.46%、13.04%，且均差異顯著。

2.3 代謝組學(xué)分析

通過LC-MS分析T1和T2組的葉片樣品，并使用QC樣品評估檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性。QC樣品在正離子模式和負(fù)離子模式下的總離子色譜圖表現(xiàn)為各個色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時間基本重疊（圖2），表明在整個試驗過程中儀器誤差引起的變化很小，數(shù)據(jù)可靠。PCA結(jié)果（圖3-A）顯示，在正負(fù)離子模式下，QC樣品偏移較小，表明試驗過程的穩(wěn)定性和可靠性；但T1和T2組的樣品表現(xiàn)出分離趨勢，表明試驗可以進(jìn)一步分析。OPLS-DA用于區(qū)分各組之間代謝譜的總體差異，并旨在找出與不同處理最相關(guān)的差異代謝物。如圖3-B所示，T1和T2組的樣品有顯著差異，正離子模式中的R2Y、Q2Y為0.988（接近1）、0.793（＞0.5），負(fù)離子模式中的R2Y、Q2Y為0.993（接近1）、0.725（＞0.5）。這表明該模型對正負(fù)離子模式的分組具有良好的解釋率和預(yù)測能力，且這些樣本可用于篩選長日照和短日照煙草葉片中的差異代謝物。代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，在正離子模式和負(fù)離子模式下所有樣品中分別有24 559、13 095個光譜；共注釋了487種代謝物，其中正離子模式下有347種代謝物，負(fù)離子模式下有140種代謝物。

2.4 長日照和短日照煙草差異代謝產(chǎn)物的鑒定

根據(jù)Plt;0.05、|log2FC|gt;1和VIPgt;1的標(biāo)準(zhǔn)，在長日照煙草和短日照煙草之間共鑒定出92種差異代謝物，其中12種代謝物（均下調(diào)）處于負(fù)離子模式（圖4-A），80種代謝物（4種上調(diào)、76種下調(diào)）處于正離子模式（圖4-B）。由表3可以看出，與長日照煙草中的代謝物相比，短日照煙草中甘油酸（VIP=1.62，Plt;0.05，log2FC=1.13）、異香草醛酸（VIP=1.61，Plt;0.05，log2FC=1.15）、L-瓜氨酸（VIP=1.44，Plt;0.05，log2FC=1.16）和3，4-亞甲二氧基苯丙胺（VIP=1.45，Plt;0.05，log2FC=1.12）的相對濃度顯著增加； 短日照煙草中的異亮氨酸色氨酸（VIP=1.42，Plt;0.05，log2FC=-2.53）、苯丙氨酸天冬氨酸（VIP=1.68，Plt;0.05，log2FC=-2.09）、蘇氨酸亮氨酸（VIP=1.48，Plt;0.05，log2FC=-2.06）、黃素單核苷酸（FMN）（VIP=1.91，Plt;0.05，log2FC=-1.52）、L-蘋果酸（VIP=1.78，Plt;0.05，log2FC=-1.10）和細(xì)胞分裂素B（VIP=1.53，Plt;0.05，log2FC=-174）的相對濃度明顯低于長日照煙草。

2.5 已鑒定差異代謝物的KEGG途徑

對鑒定出的差異代謝物進(jìn)行KEGG途徑分析。這些差異代謝產(chǎn)物在42條KEGG途徑中富集，其中14條KEGG途徑顯著富集（P＜0.05），包括托烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成、代謝通路、嘧啶代謝、苯丙素類生物合成和苯丙氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、鳥氨酸、賴氨酸和煙酸衍生的生物堿的生物合成、植物激素的生物合成、組氨酸和嘌呤生物堿的生物合成以及精氨酸和脯氨酸代謝（圖5）。在苯丙氨酸代謝途徑中，短日照煙株的苯丙氨酸、苯丙酮酸鹽、反式肉桂酸鹽和苯丙酸鹽的代謝產(chǎn)物均下調(diào)，嘧啶代謝途徑代謝產(chǎn)物尿苷、尿嘧啶、胞嘧啶和胞苷的濃度均降低。此外，在代謝通路中，甘油酸和L-瓜氨酸的代謝產(chǎn)物被上調(diào)，而胞苷、胞嘧啶、D-脯氨酸、脫氧鳥苷、二甲基甘氨酸、DL-香草醛扁桃酸、L-蘋果酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、苯基丙酮酸、前列腺素A2、反式肉桂酸、尿嘧啶和尿苷的代謝產(chǎn)物均下調(diào)。

3 討論

煙草具有喜光性，雖然不同品種的煙草對光環(huán)境變化的反應(yīng)不同，但是不同的光環(huán)境對煙草的生長發(fā)育、物質(zhì)代謝和品質(zhì)均有較大的影響［11］。適當(dāng)延長光照時間能夠提高煙苗素質(zhì)，促進(jìn)葉片生長發(fā)育，有利于煙株的生長［12-13］。本研究分別對烤煙進(jìn)行長日照和短日照培養(yǎng)，結(jié)果顯示，長日照處理的煙株生長速度更快，有利于煙葉成熟和色素降解，而短日照煙草成熟緩慢，這與前人的研究結(jié)果［14］相似，可能與減少光照時間促進(jìn)色素含量的增加，推遲了其降解進(jìn)程有關(guān)［15］。煙草品質(zhì)一定程度上也會受到日照時間的影響。將化學(xué)成分和氣象因子進(jìn)行相關(guān)性分析，石俊雄等發(fā)現(xiàn)，氣象因子中對貴州煙葉化學(xué)成分影響最大的因素是6月的日照時數(shù)［16］；旺長期日照時數(shù)增多有利于上部煙葉的淀粉、總糖和還原糖含量提高，含氮類化合物與旺長期、成熟期和大田生育期的日照時數(shù)呈負(fù)相關(guān)［17］。煙草含氮物質(zhì)減少可能是因為日照時數(shù)過長影響

了與氮代謝相關(guān)的硝酸還原酶活性［18］。

代謝物是代謝過程的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物，在植物生長、進(jìn)化和適應(yīng)氣候變化方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［19］。然而，不同光照時間對煙葉代謝的影響尚不清楚。對煙草葉片進(jìn)行LC-MS和代謝組學(xué)分析后，在長日照和短日照煙株間共鑒定出92種差異代謝產(chǎn)物，包括4種上調(diào)代謝產(chǎn)物（甘氨酸、異香蘭酸、L-瓜氨酸、3，4-亞甲基二氧基苯丙氨酸）和88種下調(diào)代謝產(chǎn)物（苯丙氨酸、苯丙酮酸、反式肉桂酸、細(xì)胞分裂素B、FMN、D-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、胞苷、胞嘧啶、尿嘧啶等）。甘油酸是甘油的氧化產(chǎn)物，其D-異構(gòu)體作為植物化學(xué)物質(zhì)可以從煙草的葉片中獲得［19］。參與苯丙氨酸代謝的反式肉桂酸和苯丙酮酸不僅參與了葉綠素和綠原酸的合成過程，還影響煙草葉片顏色的產(chǎn)生［20］。FMN是參與氧化還原反應(yīng)的重要蛋白質(zhì)組，在黃素合成和植物免疫中有重要作用［21］。此外，對不同耐寒性煙草（CB-1和K326）樣本的分析發(fā)現(xiàn)，乙烯和水楊酸水平的差異是導(dǎo)致其耐寒性不同的主要原因［22］。由此推斷，由于光照時間不同產(chǎn)生的包括氨基酸、有機(jī)酸、糖和嘧啶等92種不同代謝產(chǎn)物，可能與烤煙的生長發(fā)育密切相關(guān)。

這些已確定的差異代謝產(chǎn)物在14條KEGG途徑中顯著富集，包括代謝通路、嘧啶代謝、苯丙素類生物合成、氨基酸的代謝途徑（苯丙氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，鳥氨酸、賴氨酸和煙酸衍生生物堿的生物合成和苯丙氨酸、酪氨酸和胰蛋白酶生物合成）。嘧啶代謝參與由BY-2細(xì)胞編程的細(xì)胞死亡和煙草器官的形成［23］。尿嘧啶代謝平衡、保存和降解途徑的變化影響了植物發(fā)育過程中的重要形態(tài)變化［24］。植物苯丙素類途徑中類黃酮和木質(zhì)素生物合成的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)對煙草的生長和成熟至關(guān)重要［25］。此外，不同的氨基酸代謝途徑是植物免疫系統(tǒng)的組成部分，與煙株生長發(fā)育和煙草品質(zhì)的形成密切相關(guān)［26-27］。哌啶酸是由賴氨酸衍生的非蛋白質(zhì)氨基酸，使煙草在應(yīng)對細(xì)菌感染時迅速積累水楊酸和煙堿，并加強(qiáng)煙草的防御機(jī)制［28］。煙草生物堿的生物合成涉及煙酸衍生物代謝產(chǎn)物N-甲基吡咯啉的縮合［29］。綜上所述，光照時間可能通過調(diào)節(jié)代謝通路、苯丙素類生物合成、嘧啶代謝、氨基酸相關(guān)途徑和煙酸衍生生物堿的生物合成來影響烤煙的生長發(fā)育與質(zhì)量，但這些途徑在烤煙生長發(fā)育中的具體作用仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

光照時間影響煙株生長和煙葉化學(xué)成分，長日照煙草質(zhì)體色素含量顯著低于短日照煙草，還原糖含量升高，總氮、煙堿含量降低，化學(xué)成分協(xié)調(diào)性變好。在短日照和長日照煙草植物中共鑒定出包括氨基酸、有機(jī)酸、糖和嘧啶在內(nèi)的92種不同的代謝產(chǎn)物，其中4種上調(diào)，88種下調(diào)。功能分析表明，光照時間可以調(diào)節(jié)代謝途徑、苯丙素類生物合成、嘧啶代謝、氨基酸相關(guān)途徑和煙酸衍生生物堿的生物合成，從而影響烤煙的生長發(fā)育和質(zhì)量。

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