摘 " "要：為了提高雜交種篩選效率，從23對(duì)西瓜簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）引物中篩選適用于西瓜雜交種新喜3號(hào)及其親本的特異性引物并進(jìn)行種子純度鑒定。結(jié)果表明，1對(duì)引物BVWS00208在親本間具有多態(tài)性且在雜交后代中兼具雙親條帶，屬于共顯性標(biāo)記。將該引物在98個(gè)雜交后代中進(jìn)行驗(yàn)證，純度鑒定結(jié)果為98.9%，通過(guò)傳統(tǒng)田間純度鑒定結(jié)果為98.0%，二者誤差≤1%。綜上，SSR引物BVWS00208能夠作為特異引物對(duì)西瓜雜交種新喜3號(hào)進(jìn)行種子純度鑒定，且該方法便捷經(jīng)濟(jì)，能為該品種的制種和推廣提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：西瓜；新喜3號(hào)；SSR分子標(biāo)記；純度鑒定

中圖分類號(hào)：S651 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）08-131-05

Identification of seed purity of watermelon hybrid Xinxi 3 by SSR marker

REN Yici1， LIU Xicun1， WANG Wenying1， GAO Zhan1， WANG Xiangdong1， GUO Chunjiang1， LI Jiangwei2

（1. Xinxiang Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang 453000， Henan， China; 2. Xinxiang Agricultural Products Quality and Safety Testing and Inspection Center， Xinxiang 453000， Henan， China）

Abstract： In order to improve the efficiency of hybrid screening， this study screened specific primers suitable for the watermelon hybrid Xinxi 3 and its parents from 23 pairs simple sequence repeat（SSR）primers in watermelon. The results showed that one pair of primers BVWS00208 showed polymorphism between parents and had both parental bands in hybrid offspring， belonging to codominant marker. The primer was validated in 98 hybrid individuals， and the purity identification result was 98.9%. The traditional field test showed the purity was 98.0%， with an error of ≤1% between them. This indicates that the primer BVWS00208 can serve as a specific primer for seed purity detection of watermelon hybrid Xinxi 3. The identification is convenient and economical， which can provide technical support for the seed production and promotion of this variety.

Key words： Watermelon; Xinxi 3; SSR molecular marker; Purity test

西瓜（Citrullus lanatus）屬葫蘆科一年生植物，含有果糖、番茄紅素、瓜氨酸等營(yíng)養(yǎng)成分，是深受消費(fèi)者青睞的水果之一。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的栽培和育種，中國(guó)已有成百上千個(gè)西瓜品種問(wèn)世[1]。通過(guò)保護(hù)地或者熱帶種植，西瓜已實(shí)現(xiàn)周年化生產(chǎn)，全年供應(yīng)。FAO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2022年世界西瓜栽培面積為291.64萬(wàn)hm2，中國(guó)的西瓜栽培面積為139.19萬(wàn)hm2，占比47.73%；2022年全球西瓜總產(chǎn)量為9 995.75萬(wàn)t，中國(guó)的西瓜總產(chǎn)量為6 054.22萬(wàn)t，占比60.57%，中國(guó)的西瓜栽培面積和產(chǎn)量均居于世界首位。

隨著西瓜產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，市面上西瓜種子行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)也日漸激烈。種子質(zhì)量是影響果實(shí)品質(zhì)、產(chǎn)量、種植者和種子企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵因素[2]。雜交育種是最基本的育種方法之一，其后代兼具雙親優(yōu)勢(shì)性狀，世界范圍內(nèi)主要作物的優(yōu)良品種大多通過(guò)雜交育種的方法獲得[3]。在雜交種生產(chǎn)過(guò)程中，氣候環(huán)境、隔離區(qū)選擇、制種工人操作時(shí)機(jī)和認(rèn)真程度等均會(huì)影響種子純度。為保證種子質(zhì)量、市場(chǎng)占有額以及農(nóng)戶的生產(chǎn)安全，種子純度鑒定工作尤為重要[4]。以形態(tài)學(xué)標(biāo)記進(jìn)行純度鑒定會(huì)因作物遺傳背景相對(duì)狹窄、環(huán)境差異等因素而受限制，逐漸不能滿足實(shí)際生產(chǎn)需要。為了更加準(zhǔn)確地鑒定品種純度，提高鑒定效率，通過(guò)DNA鑒定的方法越來(lái)越受到重視。

DNA分子標(biāo)記是能夠反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段，是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的分子標(biāo)記，結(jié)果可靠、重復(fù)性好，不僅在大田作物和蔬菜育種中得到應(yīng)用[5]，在食用菌[6]、果樹(shù)[7]、花卉[8]中也有廣泛應(yīng)用。西瓜的DNA分子標(biāo)記主要包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）、插入或缺失DNA標(biāo)記（InDel）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（SRAP），基于單核苷酸多態(tài)性（SNP）開(kāi)發(fā)的酶切擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（CAPS）等，涉及西瓜的品種選育、種子純度鑒定、遺傳多樣性分析、抗病蟲(chóng)性等研究?jī)?nèi)容。其中，SSR分子標(biāo)記具有共顯性、準(zhǔn)確性強(qiáng)、對(duì)DNA質(zhì)量要求低、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)[4]。

筆者從23對(duì)西瓜SSR引物中篩選適用于西瓜雜交種新喜3號(hào)及其親本的特異性引物并進(jìn)行種子純度鑒定，借助分子標(biāo)記鑒定種子純度，提高鑒定效率，降低檢測(cè)成本，以期為品種的開(kāi)發(fā)與推廣提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的大果型西瓜品種新喜3號(hào)（雜交一代）及其親本為試驗(yàn)材料，新喜3號(hào)為淺綠色果皮，覆較窄的綠齒條帶，果皮堅(jiān)韌，果實(shí)呈橢圓形；母本為圓形果實(shí)，淺綠果皮上覆齒條；父本為橢圓形，淺綠果皮覆網(wǎng)狀條帶（圖1）。

1.2 材料培育

2023年3月25日，選擇新喜3號(hào)種子100粒及其親本種子各20粒，將種子在55 ℃溫水中浸種6 h，使用50孔穴盤（54 cm×28 cm×85 cm）進(jìn)行播種，選用瓜類專用滅菌基質(zhì)育苗。材料長(zhǎng)至3葉1心時(shí)，于2023年4月27日定植于塑料大棚內(nèi)，爬地栽培，常規(guī)管理。

1.3 西瓜基因組DNA提取及檢測(cè)

待植株長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，每株取1 cm2的嫩葉，編號(hào)后液氮速凍帶回實(shí)驗(yàn)室并存入-80 ℃超低溫冰箱。使用冷凍研磨儀將樣品充分研磨，按照改良的CTAB法提取DNA樣本[9]，借助微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)DNA質(zhì)量及濃度，并將樣品稀釋至50 ng?μL-1，放置在-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.4 分子鑒定

試驗(yàn)用23對(duì)SSR引物來(lái)自張慕月[10]。PCR反應(yīng)體系：DNA模板0.5 μL，正、反向引物各0.5 μL，2×PCR Mix 5.0 μL，ddH2O補(bǔ)齊至10.0 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，根據(jù)不同引物設(shè)置退火溫度，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，放于4 ℃保存。利用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，采用銀染法借助膠片觀察燈觀察條帶[2]。

1.5 純度鑒定

定植后對(duì)新喜3號(hào)進(jìn)行日常栽培管理，于2023年7月2日在果實(shí)成熟期統(tǒng)計(jì)果實(shí)皮色、果實(shí)形狀、果肉顏色等農(nóng)藝性狀，通過(guò)形態(tài)學(xué)標(biāo)記判斷雜交種純度。結(jié)合篩選出的具有特異性的SSR引物，通過(guò)DNA分子標(biāo)記技術(shù)鑒定種子純度，同時(shí)顯現(xiàn)雙親的條帶類型即視為真雜種。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物篩選

選取23對(duì)西瓜SSR引物在新喜3號(hào)及其親本材料中進(jìn)行多態(tài)性篩選。有一對(duì)引物BVWS00208（上游引物序列：GCAAAGATTGTCTATGAAGCAGCA；下游引物序列：GCTCATTGGCTTCTTGAATCTGTT）在雙親中呈現(xiàn)單條帶，且具有顯著差異，在雜交種中呈現(xiàn)雙親條帶，具有互補(bǔ)性和共顯性，詳見(jiàn)圖2。初步判斷該引物可作為新喜3號(hào)品種的特異性引物，進(jìn)行純度鑒定。

2.2 多態(tài)性引物的重復(fù)性檢驗(yàn)

利用引物BVWS00208對(duì)98份F1代新喜3號(hào)進(jìn)行種子純度鑒定，擴(kuò)增條帶如圖3所示，除去不明顯的5份材料（編號(hào)21、35、54、58、59），其余92份材料的條帶大小一致，具有雙親的條帶特征，1份材料（編號(hào)92）的條帶表現(xiàn)與母本（P2）一致，純度鑒定結(jié)果為98.9%。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

在果實(shí)成熟期利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記對(duì)品種純度進(jìn)行田間鑒定，發(fā)現(xiàn)西瓜的果實(shí)外觀、瓤質(zhì)瓤色一致性較好，表現(xiàn)為淺綠色果皮覆較窄的綠齒條帶，果皮堅(jiān)韌，果實(shí)呈橢圓形。僅有2株果實(shí)性狀與母本特征相似，表現(xiàn)為圓形果實(shí)，淺綠果皮上覆綠齒條，由此可得雜交種純度為98.0%。

3 討論與結(jié)論

目前依托傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)標(biāo)記的植物特異性、一致性、穩(wěn)定性測(cè)試受主觀或者環(huán)境因素影響，對(duì)育種材料或品種間的差異描述逐漸不能滿足實(shí)際需要[11]。西瓜、甜瓜作為非主要農(nóng)作物，進(jìn)行品種保護(hù)、種子經(jīng)營(yíng)需要向農(nóng)業(yè)農(nóng)村部申請(qǐng)新品種保護(hù)或登記。為了有效管理已登記的品種，自2021年起，向日葵、黃瓜、甜瓜登記品種利用DNA分子鑒定技術(shù)進(jìn)行了清退相似品種的工作，已連續(xù)開(kāi)展三批，以后將會(huì)在其他作物中應(yīng)用[12]。不論是育種者個(gè)人還是公司、檢測(cè)機(jī)構(gòu)，均會(huì)逐步完善遺傳背景的描述，防止惡意競(jìng)爭(zhēng)，維護(hù)育種者的知識(shí)產(chǎn)權(quán)不受侵害。

SSR標(biāo)記具有檢驗(yàn)速度快、成本低、標(biāo)記分布均勻，準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，在種子純度鑒定方面發(fā)揮了重要作用。何玉等[13]在28對(duì)SSR標(biāo)記中篩選出了5對(duì)多態(tài)性好的SSR，并利用BVWS00839標(biāo)記檢驗(yàn)西瓜品種W1806的純度。尤佳琪等[14]利用SSR標(biāo)記對(duì)黑津和申蜜968這兩個(gè)西瓜品種進(jìn)行純度檢測(cè)，鑒定結(jié)果高效準(zhǔn)確，彌補(bǔ)了大田純度鑒定耗時(shí)長(zhǎng)、易受環(huán)境影響的不足。楊會(huì)會(huì)等[15]利用雙重以及三重PCR純度鑒定體系鑒定西瓜品種錦霞八號(hào)雜交種的純度，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。程維舜等[16]采用熒光標(biāo)記SSR鑒定西瓜品種武農(nóng)8號(hào)雜交種的純度，峰值清晰，避免了凝膠電泳圖結(jié)果辨別困難的問(wèn)題。筆者在本研究中利用SSR標(biāo)記BVWS00208對(duì)西瓜品種新喜3號(hào)進(jìn)行純度鑒定，分子標(biāo)記鑒定與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。篩選到的特異性標(biāo)記，加深了對(duì)育種材料間差異關(guān)系的了解，為該品種制種及推廣開(kāi)發(fā)有一定的助力作用。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，三代分子標(biāo)記SNP在作物遺傳育種中的應(yīng)用逐漸增多。其中競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）、靶向測(cè)序基因型檢測(cè)（GBST）技術(shù)都具有準(zhǔn)確性高、成本較低的優(yōu)勢(shì)[11]。KASP適宜檢測(cè)大量樣本SNP位點(diǎn)；GBST技術(shù)是對(duì)靶向位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序和基因型檢測(cè)，依托其開(kāi)發(fā)的基于GenoBaits的液相芯片可以更深層次探究遺傳多樣性和不同材料的精細(xì)差異。目前該技術(shù)已在玉米、水稻、大豆等作物上應(yīng)用，未來(lái)有望實(shí)現(xiàn)資源共享與開(kāi)源育種[17]。Park等[18]使用Fluidigm基因分型開(kāi)發(fā)了一組核心SNPs，用以韓國(guó)西瓜商業(yè)品種的鑒定和新品種開(kāi)發(fā)的所有權(quán)保護(hù)。Yang等[1]在前人研究的基礎(chǔ)上，篩選出241個(gè)SNPs對(duì)247個(gè)中國(guó)西瓜品種基因型進(jìn)行鑒定與多樣性分析，將西瓜品種分為5個(gè)亞群，并選擇了32個(gè)核心SNPs，通過(guò)KASP標(biāo)記可實(shí)現(xiàn)高效低成本的西瓜品種精準(zhǔn)鑒定，有助于開(kāi)展西瓜品種保護(hù)管理工作。徐云碧等[19]通過(guò)分析世界各國(guó)主要作物品種保護(hù)經(jīng)驗(yàn)，建議建立專家咨詢委員會(huì)，完善DUS評(píng)價(jià)和實(shí)質(zhì)性派生品種評(píng)價(jià)體系，建立品種保護(hù)數(shù)據(jù)庫(kù)，提供查詢對(duì)比服務(wù)，進(jìn)而推動(dòng)種業(yè)創(chuàng)新和新品種保護(hù)。

綜上所述，SSR標(biāo)記BVWS00208能對(duì)新喜3號(hào)品種純度進(jìn)行有效鑒定，純度達(dá)98.9%，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，研究結(jié)果為其他西瓜品種的純度鑒定和新品種保護(hù)提供了借鑒。品種的培育、開(kāi)發(fā)與推廣離不開(kāi)基礎(chǔ)研究與市場(chǎng)化運(yùn)作，借助分子技術(shù)輔助西瓜育種是必然趨勢(shì)。育種者應(yīng)合理利用技術(shù)手段，提高西瓜品質(zhì)和品種適應(yīng)性，充分利用DNA指紋圖譜對(duì)品種純度進(jìn)行鑒定和新品種保護(hù)，維護(hù)育種人員的合法權(quán)益，從而推動(dòng)西瓜產(chǎn)業(yè)綠色健康發(fā)展。

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收稿日期：2024-02-29；修回日期：2024-06-16

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（222102110361）

作者簡(jiǎn)介：任藝慈，女，研究實(shí)習(xí)員，主要從事西瓜甜瓜育種工作。E-mail：ycamy14@163.com

共同第一作者：劉喜存，男，副研究員，主要從事西瓜甜瓜育種及病蟲(chóng)害防治工作。E-mail：lxc78zll79@126.com

通信作者：李江偉，男，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣應(yīng)用工作。E-mail：lijiangwei8855@126.com