摘要：[目的】克隆山葡萄乙烯響應(yīng)因子基因VaERF095及其啟動子序列，分析在低溫和外源激素誘導(dǎo)下該基因的表達(dá)模式和啟動子活性，為深入探究VaERFO95基因參與低溫脅迫響應(yīng)機(jī)理提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎猛纯寺》椒◤纳狡咸哑贩N左山-1中獲得VaERFO95基因及其啟動子，并通過實時熒光定量PCR檢測VaERF095基因在低溫（4℃）脅迫和外源激素誘導(dǎo)下及不同組織中的表達(dá)情況。同時構(gòu)建VaERF095基因啟動子融合GUS蛋白表達(dá)載體，瞬時轉(zhuǎn)化葡萄葉片，通過β-葡萄糖苷酸酶（GUS）活性定量分析VaERF095基因啟動子受低溫脅迫和外源激素誘導(dǎo)的表達(dá)情況。【結(jié)果】從山葡萄克隆獲得VaERF095基因，編碼區(qū)（CDS）全長393bp，編碼130個氨基酸殘基，該蛋白含有1個保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，與歐洲葡萄和河岸葡萄的親緣關(guān)系較近，氨基酸序列相似性分別為100.00%和93.08%。VaERF095基因可響應(yīng)低溫和外源激素乙烯（ET）、水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和脫落酸（ABA）的誘導(dǎo)，呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。VaERF095基因在老葉、莖、花序、卷須和果實均有表達(dá)，其中在卷須中的表達(dá)量最高，在幼葉中的表達(dá)量極低或幾乎不表達(dá)?？寺～@得長度為1360bp的VaERF095基因啟動子，含有2個低溫響應(yīng)元件（LTR）、1個ET響應(yīng)元件（ERE）、1個SA響應(yīng)元件（TCA-element）、2個MeJA響應(yīng)元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）、1個ABA響應(yīng)元件（ABRE）、1個GA響應(yīng)元件（P-box）和1個防御和脅迫響應(yīng)元件（TC-rich repeats）。在低溫脅迫及外源激素（ET、SA和ABA）誘導(dǎo)下，VaERF095基因啟動子活性較對照極顯著升高（Plt;0.01），在MeJA誘導(dǎo)下，VaERF095基因啟動子活性顯著增強(qiáng)（Plt;0.05）。【結(jié)論】VaERF095基因及其啟動子正向響應(yīng)低溫（4℃）及外源激素（ET、SA、ABA和MeJA）的誘導(dǎo)，具有明顯的組織表達(dá)特異性。

關(guān)鍵詞：山葡萄；ERF轉(zhuǎn)錄因子；基因表達(dá)；啟動子；功能分析

中圖分類號：S663.103.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）01-0037-10

Gene expression of VaERF095and functional analysis of its promoter from Vitis amurensis

WANG Lan'，XU Jian-ren2

（'College of Enology and Horticulture，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia750021，China;2College of Bioscience and Engineering，North MinzuUniversity，Yinchuan，Ningxia750021，China）

Abstract：[Objective]In this study，the transcription factor gene VaERF095and its promoter were cloned from Chi-nese Vitis amwrensis.The gene expression and promoter activity under the induction of low temperature and exogenous hormones were analyzed，so as to provide theoretical basis for the regulation mechanism of VaERF095gene inresponse to low temperature stress.【Method]The VaERF095gene from Vamurensis variety Zuoshan-1and its promoter were cloned by homology-based cloning.The expressions of VaERF095gene induced by low temperature（4℃）and exogenous hor-mones and in different tssues were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR.The GUS protein expression vec-tor inserted with VaERF095gene promoter was constructed and transiently transformed into grape leaves.The β-glucuroni-dase（GUS）activity assay was performed to analyze the expression of VaERF095gene promoter induced by low tempera-ture and exogenous hormones.[Result]The VaERF095gene was cloned from V.amurensis and the total length of the co-ding sequence（CDS）was393bp，encoding130amino acid residues.The protein contained aconserved AP2/ERF do-main，which was closely related to V.vinifera L.and V.riparia，with amino acid sequence similarity of100.00%and93.08%，respectively.The VaERF095gene showed different expression patterns in response to low temperature and induc-tion ofexogenous hormones ethylene（ET），salicylic acid（SA），methyl jasmonate（MeJA）and abscisic acid（ABA）.VaERFO95gene was expressed in mature leaf，stem，inflorescence，tendril and berry，with the highest expression in ten-dril and very low or almost no expression in young leaf.The VaERF095gene promoter with alength of1360bp was cloned.The sequence analysis indicated that VaERF095gene promoter containing two low temperature responsive ele-ment（LTR），one ETresponsive element（ERE），one SA responsive element（TCA-element），two MeJA responsive ele-ments（CGTCA-motif and TGACG-motif），one ABA responsive element（ABRE），one GA responsive element（P-box）and one defense and stress responsive element（TC-rich repeats）.The activity of VaERF095gene promoter was extremely enhanced in response to low temperature and exogenous hormonesET，SA and ABA（Plt;0.01）.Meanwhile，the activity of VaERF095gene promoter was significantly enhanced in response to MeJA induction（Plt;0.05）.【Conclusion】VaERF095gene and its promoter positively respond to the induction of low temperature（4℃）and exogenous hormones such asET，SA，ABAand MeJA，and has obvioustissue expression specificity

Keywords：Vitis amurensis;ERF transcription factor;gene expression;promoter;funcional analysis

Foundation items：Ningxia Natural Science Foundation（2021AAC03092）;Ningxia Key Research and Develop-ment Plan Project（2020BEB04024）

0引言

【研究意義】歐洲葡萄（Vitis vinifera L.）在葡萄的栽培生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛，雖然其果實品質(zhì)優(yōu)良，但抗寒性較差，在我國北方進(jìn)行葡萄栽培生產(chǎn)時，需采取冬季埋土防寒、春季出土上架的措施，耗費大量人力和物力，增加了生產(chǎn)成本。而我國擁有豐富的野生葡萄種質(zhì)資源，其中山葡萄（Vitis amurensis）起源于我國東北，具有較強(qiáng)的抗寒性，能耐受-40℃的低溫，作為葡萄屬中最抗寒的種，是探究葡萄抗寒機(jī)理的常用材料（賀普超和晁無疾，1982）。乙烯響應(yīng)因子（Ethylene responsive factor，ERF）作為植物中重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，具有響應(yīng)生物和非生物脅迫、調(diào)控初級和次級代謝、參與植物生長發(fā)育等功能（Licausi et al.，2013）。因此，克隆山葡萄VaERF095基因及其啟動子，分析基因表達(dá)模式和啟動子功能，以期深入探究VaERF095基因響應(yīng)低溫脅迫的作用機(jī)理，對葡萄種質(zhì)抗寒性狀改良具有重要的指導(dǎo)意義。【前人研究進(jìn)展】ERF家族轉(zhuǎn)錄因子是一類主要存在于植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控高等植物的多種環(huán)境脅迫響應(yīng)過程，如低溫、高溫、干旱等（Feng et al.，2020）。該家族轉(zhuǎn)錄因子首先在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，均含有AP2結(jié)構(gòu)域（Jofuku et al.，1994）。隨后在煙草中發(fā)現(xiàn)4個ERF蛋白，能特異結(jié)合GCC-box元件（Ohme-Takagi and Shinshi，1995）。近年來，在葡萄（Licausi et al.，2010）、油菜（Ghorbani et al.，2020）、玉米（Hao et al.，2020）、紅薯（He et al.，2021）等植物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因，并開展了相關(guān)功能研究。在不同植物中，ERF轉(zhuǎn)錄因子對低溫脅迫的響應(yīng)方式不同，如白樺BplERF1基因正向調(diào)控抗寒性（Lv et al.，2021），而水稻OsBIERF3基因能響應(yīng)水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA）和低溫誘導(dǎo)，負(fù)調(diào)控抗寒性（Hong et al.， 2022）。擬南芥抗寒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子AtERF105在凍害的耐受性中發(fā)揮重要作用，正向調(diào)控轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性（Bolt et al.，2017）。山葡萄ERF轉(zhuǎn)錄因子基因VaERF080和VaERF087能響應(yīng)低溫和乙烯的誘導(dǎo)，過量表達(dá)可提高植株的抗寒性（Sun et al.，2019b）。在擬南芥中過量表達(dá)山葡萄VaERF057基因，也可增強(qiáng)植株的抗寒性（Sun et al.，2016）。山葡萄VaERF092基因響應(yīng)低溫脅迫，該轉(zhuǎn)錄因子蛋白通過結(jié)合VaWRKY33基因的啟動子，增強(qiáng)對低溫脅迫的抗性（Sun et al.，2019a）。低溫是影響植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因素之一，植物細(xì)胞通過一系列信號通路調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)形成信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與低溫脅迫應(yīng)答（Gong et al.，2020）。已有文獻(xiàn)報道，不同物種ERF轉(zhuǎn)錄因子的啟動子序列中，含有多個與低溫及激素響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件，常為誘導(dǎo)型啟動子。玉米低溫響應(yīng)ZmERFs基因啟動子中高度富集多種逆境相關(guān)元件，包括ABA響應(yīng)元件（ABRE）、厭氧響應(yīng)元件（ARE）、低溫響應(yīng)元件（LTR）和干旱響應(yīng)元件（MBS）（王雪賀緣等，2021）。水稻OsERF096基因啟動子中含有多個低溫響應(yīng)元件（MYC-CONSENSUSAT）、ABA響應(yīng)元件（ABRERATCAL）、SA響應(yīng)元件（WBBBOXATNPR1）、赤霉素（GA）響應(yīng)元件（HVAL21）等，推測該基因響應(yīng)低溫和激素脅迫（陳悅等，2022）?！颈狙芯壳腥朦c】基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與其啟動子密切相關(guān)，繼續(xù)挖掘葡萄中低溫脅迫相關(guān)ERF轉(zhuǎn)錄因子，并探究其啟動子響應(yīng)外界環(huán)境信號誘導(dǎo)的功能，有助于完善葡萄中低溫脅迫應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前葡萄中仍有許多ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員的功能未深入研究，未見山葡萄VaERF095基因表達(dá)及其啟動子功能分析的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用同源克隆方法從山葡萄品種左山-1中獲得VaERF095基因及其啟動子，并通過實時熒光定量PCR檢測VaERF095基因在低溫脅迫和不同外源激素誘導(dǎo)及不同組織中的表達(dá)情況。同時構(gòu)建VaERF095基因啟動子融合β-葡萄糖苷酸酶（GUS）表達(dá)載體，瞬時轉(zhuǎn)化葡萄葉片，GUS定量分析VaERF095基因啟動子響應(yīng)低溫脅迫和不同外源激素誘導(dǎo)的表達(dá)情況，為VaERF095基因參與低溫脅迫響應(yīng)機(jī)理提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

中國野生山葡萄品種左山-1（Vitis amurensis accession‘Zuoshan-1’）和歐洲葡萄品種赤霞珠（Vitis vinifera cv.Cabernet Sauvignon）均來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院葡萄種質(zhì)資源圃，采集左山-1的幼葉、老葉、莖、卷須、花序和果實進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析?？寺≥d體pMD19-T、GUS表達(dá)載體pCAM-BIA0380-GUS和pCAMBIA0380-CaMV35S-GUS為寧夏大學(xué)葡萄酒與園藝學(xué)院實驗室保存；大腸桿菌Topl0感受態(tài)細(xì)胞、DNA回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefa-ciens）GV3101感受態(tài)細(xì)胞購自北京擎科生物科技股份有限公司；大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑盒和植物總RNA提取試劑盒購自廣州歐米伽（Omega）生物科技有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR Max DNA聚合酶和T4DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；乙烯（ET）、SA、MeJA和ABA購自上海希格瑪（Sigma）高技術(shù)有限公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純。主要儀器設(shè)備：低溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、光照培養(yǎng)箱（寧波東南儀器有限公司）、qTOWER3G定量PCR儀（AnalytikJena，德國）、循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、PCR儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]和分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2材料處理

選取長勢一致的2年生左山-1盆栽扦插苗，分別進(jìn)行低溫處理和外源激素處理。低溫處理時植株置于4℃低溫培養(yǎng)箱，在0、1.0、3.0、6.0、12.0、24.0和48.0h取樣收集葉片，液氮速凍后于-80℃保存。外源激素處理時，植株葉片分別均勻噴施0.5g/L的ET溶液和100μmol/L的SA、MeJA、ABA溶液（Wang et al.，2020），置于光照培養(yǎng)箱，設(shè)光周期為16h光照/8h黑暗進(jìn)行培養(yǎng)，分別在0、0.5、1.0、2.0、6.0和10.0h取樣，液氮速凍，-80℃保存。試驗共使用45株盆栽扦插苗，每處理均設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)3株。

1.3RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

保存于-80℃的葡萄葉片和其他組織材料，使用液氮充分研磨至粉末狀，按照植物總RNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Total RNA KitⅡ）說明進(jìn)行RNA提取。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastKing RT Kit With gDNase）說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，cDNA稀釋5倍后保存于-20℃，用于后續(xù)VaERF095基因克隆和實時熒光定量PCR。

1.4VaERF095基因克隆及序列分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得ERF095基因序列（XM_002284724.4），利用Primer Premier5.0設(shè)計試驗所需的引物（VaERF095-F和VaERF095-R）（表1），引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。VaERF095基因克隆以稀釋后的cDNA為模板，反應(yīng)體系30.0μL：2×PrimeSTAR Max Premix15.0μL，正、反向引物（10μmol/L）各1.0μL，100ng/pL cDNA模板1.0μL，ddH?O補(bǔ)充至30.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3min;98℃10s，55℃20s，72℃1min，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，使用DNA回收試劑盒回收目的片段并測序，測序正確的序列命名為VaERF095。使用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST功能，查找與VaERF095氨基酸序列相近的其他物種ERF轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列，使用DNAMAN9.0進(jìn)行氨基酸序列比對，使用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.5VaERF095基因表達(dá)分析

以不同處理的cDNA為模板，RT-VaERF095-F和RT-VaERF095-R為定量引物，通過實時熒光定量PCR檢測VaERF095基因在低溫脅迫和不同外源激素誘導(dǎo)及不同組織中的表達(dá)情況，以GAPDH基因為內(nèi)參，其引物為RT-GAPDH-F和RT-GAPDH-R。反應(yīng)體系20.0μL：2×PerfectStart Green qPCR Super-Mix10.0μL，100ng/μL cDNA模板1.0μL，10μmol/L正、反向引物各0.8μL，ddH?O補(bǔ)充至20.0μL。PCR反應(yīng)在qTOWER'G定量PCR儀中進(jìn)行，擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min;94℃5s，60℃15s，72℃20s，進(jìn)行40個循環(huán)；通過熔解曲線（94℃15s，60℃

1min，94℃15s）分析引物的特異性。使用2-～法計算目的基因的相對表達(dá)量，取3次生物學(xué)重復(fù)的平均值，使用SPSS24.0對其進(jìn)行t檢驗。

1.6VaERF095基因啟動子克隆及序列分析

使用CTAB法提取左山-1葉片基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。利用葡萄基因組網(wǎng)站（https：//www.genoscope.cns.fr/externe/Genome-Browser/Vitis/）檢索VaERF095基因上游啟動子序列，設(shè)計啟動子擴(kuò)增引物proVaERF095-F和proVaERF095-R（表1），分別插入BamHI和SalI酶切位點。以基因組DNA為模板，克隆VaERF095基因啟動子，PCR反應(yīng)體系與1.4相同。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3min;98℃10s，55℃20s，72℃2min，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用DNA回收試劑盒回收目的片段，連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，在含100mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測，對陽性菌株進(jìn)行測序，測序正確的啟動子序列命名為proVaERF095，并提取陽性質(zhì)粒pMD19-T proVaERF095。將VaERF095基因的啟動子序列提交至PlantCARE網(wǎng)站（htp：/bioinformatics.psb.ugent be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行順式作用元件分析。

1.7啟動子融合GUS蛋白表達(dá)載體構(gòu)建

對pMD19-TproVaERF095和pCAMBIA0380-GUS表達(dá)載體進(jìn)行BamHI和SalI雙酶切，回收目的片段后使用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，并提取重組質(zhì)粒。通過重組質(zhì)粒雙酶切檢測，從而獲得構(gòu)建正確的啟動子融合GUS蛋白表達(dá)載體pCAMBIA0380-proVaERF095-GUS。通過電擊轉(zhuǎn)化法將pCAMBIA0380-GUS、pCAM-BIA0380-proVaERF095-GUS和pCAMBIA0380-CaMv35S-GUS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株。

1.8VaERF095基因啟動子瞬時轉(zhuǎn)化葡萄葉片的GUS熒光定量分析

活化含不同質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101菌株，25℃4000r/min離心5min收集菌體，加入重懸液（配方為10mmol/LMESpH5.8、10mmol/LMgCl?和200μmol/L乙酰丁香酮）輕微渦旋混勻，調(diào)整OD為0.4后室溫靜置1～3h。采集生長勢一致赤霞珠葉片，置于重懸液中，葉片近軸面向上，使用循環(huán)水式多用真空泵，抽真空30min，設(shè)置壓力為0.07MPa。將葉柄包裹浸潤蒸餾水的脫脂棉，置于塑料托盤中，覆蓋保鮮膜保濕，23℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。將葉片分為6組，一組噴施ddH?O為對照（Mock），一組轉(zhuǎn)移至4℃低溫培養(yǎng)箱，其余4組分別均勻噴施0.5g/L的ET溶液和100μmolL的SA、MeJA、ABA溶液，與Mock一起置于23℃光照培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)1d后收集葉片，用于GUS熒光定量分析。將收集的葉片樣品置于液氮中充分研磨，加入GUS提取緩沖液提取GUS蛋白，使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒測定GUS提取液蛋白含量，配制含有1mmol/L4-甲基傘形酮β-D葡萄糖苷（4-MUG）的反應(yīng)緩沖液，加入GUS蛋白提取物，經(jīng)30min酶反應(yīng)后，使用分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)測定的GUS蛋白含量和熒光強(qiáng)度計算GUS蛋白活性，具體方法參考徐偉榮（2010）的研究報道。

2結(jié)果與分析

2.1VaERF095基因克隆結(jié)果

以左山-1的cDNA為模板，以VaERF095-F和VaERF095-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約為400bp的特異條帶（圖1），純化回收后進(jìn)行測序，結(jié)果顯示該基因編碼區(qū)（CDS）全長393bp，與參考序列（XM_002284724.4）的相似性達(dá)100%，無內(nèi)含子，將該基因命名為VaERF095。

2.2VaERF095蛋白同源比對及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

VaERF095基因編碼130個氨基酸殘基，選取該基因編碼蛋白的10個同源序列進(jìn)行多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，包括歐洲葡萄（Vitis vinifera）VvERF095（XP_002284760.3）、河岸葡萄（Vitis riparia）VrERF095-like（XP_034686807.1）、毛白楊（Populus tomentosa）PtPOTOM_030295（KAG6766224.1）、木薯（Manihot esculenta）MeERF096（XP_021608692.2）、椰子（Cocos nucifera）CnERF096-like（KAG1361391.1）、狹葉羽扇豆（Lupinus angustifolius）LaERF096-like（XP_019439145.1）、黃瓜（Cucumis sativus）CsERF098（XP_004145711.1）、歐洲蘋果（Malus sylvestris）MsERF096-like（XP_050131490.1）、大豆（Glycine max）GmERF095（XP_003553492.1）和擬南芥（Arabidop-sis thaliana）AtERF95（AT3G23220.1）。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，這11個物種ERF轉(zhuǎn)錄因子均含有1個保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域（圖2），屬于ERF家族的B3類。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，VaERF095與歐洲葡萄VvERF095和河岸葡萄VrERF095-like的親緣關(guān)系較近（圖3），氨基酸序列相似性分別為100.00%和93.08%

2.3VaERF095基因表達(dá)分析結(jié)果

對山葡萄品種左山-1盆栽苗進(jìn)行低溫處理（4℃）及外源激素（ET、SA、MeJA和ABA）誘導(dǎo)，并在不同時間點取集葉片，以處理0h為對照，實時熒光定量PCR檢測VaERF095基因的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖4所示。在低溫處理下，VaERF095基因的相對表達(dá)量呈波動式變化，在處理3.0h較對照極顯著升高（Plt;0.01，下同），處理6.0h又下降，處理12.0h相對表達(dá)量極顯著上升至峰值，隨后又下降（圖4-A）;ET處理下，VaERF095基因在處理0.5h的相對表達(dá)量達(dá)峰值，極顯著高于對照，隨后相對表達(dá)量逐漸降低（圖4-B）;SA處理下，VaERF095基因在處理0.5～10.0h的相對表達(dá)量較對照極顯著升高，但整體呈先升高后降低的變化趨勢，在處理1.0h極顯著升至峰值（圖4-C）;MeJA處理下，VaERF095基因在處理1.0h的相對表達(dá)量較對照顯著升高（Plt;0.05，下同），處理6.0h的相對表達(dá)量較對照極顯著升高，處理2.0和10.0h的相對表達(dá)量均低于對照（圖4-D）;ABA處理下，VaERF095基因在處理1.0～10.0h的相對表達(dá)量較對照極顯著升高，在處理1.0h的相對表達(dá)量達(dá)峰值，隨后呈下降趨勢（圖4-E）。以上結(jié)果表明，VaERF095基因可響應(yīng)低溫處理和外源激素（ET、SA、MeJA和ABA）的誘導(dǎo)。

選取山葡萄的幼葉、老葉、莖、花序、卷須和果實，利用實時熒光定量PCR對VaERF095基因進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VaERF095基因在卷須中的相對表達(dá)量最高，但在果實、老葉、莖和花序中的相對表達(dá)量顯著減少，在老葉和莖中的相對表達(dá)量無顯著差異（Pgt;0.05），在幼葉中極低或幾乎不表達(dá)（圖4-F），表明該基因具有明顯的組織表達(dá)特性。

2.4VaERF095基因啟動子克隆結(jié)果

以山葡萄品種左山-1的基因組DNA為模板，proVaERF095-F和proVaERF095-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖5所示。擴(kuò)增條帶長度約1300bp，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)測序驗證，該條帶長度為1360bp，為VaERF095基因啟動子片段，命名為proVaERF095。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pCAMBIA0380-GUS表達(dá)載體獲得pCAMBIA0380-proVaERF095-GUS重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株。

2.5VaERF095基因啟動子順式作用元件分析結(jié)果

使用PlantCARE進(jìn)行啟動子序列順式作用元件分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VaERF095基因啟動子序列中，含有2個低溫響應(yīng)元件（LTR）、1個ET響應(yīng)元件（ERE）、1個SA響應(yīng)元件（TCA-element）、2個MeJA響應(yīng)元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）、1個ABA響應(yīng)元件（ABRE）、1個GA響應(yīng)元件（P-box）和1個防御和脅迫響應(yīng)元件（TC-rich repeats）（表2）。以上結(jié)果表明，VaERF095基因可能參與低溫脅迫響應(yīng)和多種植物激素響應(yīng)。

對山葡萄VaERF095基因啟動子和歐洲葡萄VvERF095基因啟動子序列中的主要順式作用元件進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VaERF095基因啟動子中含有2個低溫響應(yīng)元件，而VvERF095基因啟動子中僅含有1個低溫響應(yīng)元件（圖6）。由于山葡萄的抗寒性強(qiáng)于歐洲葡萄，故推測葡萄的抗寒性與其ERF095基因啟動子區(qū)域的低溫響應(yīng)元件數(shù)量密切相關(guān)。

2.6 VaERF095基因啟動子響應(yīng)低溫脅迫GUS表達(dá)分析結(jié)果

為了進(jìn)一步探究VaERF095基因啟動子響應(yīng)低溫誘導(dǎo)GUS表達(dá)情況，構(gòu)建啟動子融合GUS表達(dá)載體，并分別以pCAMBIA0380-GUS和pCAMBIA0380-CaMV35S-GUS為陰性對照和陽性對照，通過農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的真空滲透法，將不同的GUS表達(dá)載體在赤霞珠葉片中瞬時表達(dá)，并進(jìn)行低溫脅迫，通過GUS活性檢測分析啟動子的表達(dá)情況。GUS熒光定量分析結(jié)果如圖7所示。與Mock相比，VaERF095基因啟動子在低溫脅迫下，GUS活性是Mock的3.2倍，存在極顯著差異，說明VaERF095基因啟動子能正向響應(yīng)低溫的誘導(dǎo)。

2.7VaERF095基因啟動子響應(yīng)外源激素誘導(dǎo)GUS表達(dá)分析結(jié)果

VaERF095基因啟動子具有響應(yīng)植物激素的順式作用元件，為了進(jìn)一步探究VaERF095基因啟動子響應(yīng)外源激素（ET、SA、MeJA和ABA）誘導(dǎo)的表達(dá)情況，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法，將不同的GUS"""" 表達(dá)載體在歐洲葡萄品種赤霞珠葉片中瞬時表達(dá)，并進(jìn)行外源激素誘導(dǎo)處理，通過GUS活性檢測分析啟動子的表達(dá)情況。GUS熒光定量分析結(jié)果如圖8所示。與Mock相比，VaERF095基因啟動子在ET、SA和ABA誘導(dǎo)下，GUS活性分別為Mock的3.1、3.6和2.9倍，存在極顯著差異；VaERF095基因啟動子在MeJA誘導(dǎo)下，GUS活性為Mock的1.9倍，存在顯著差異，說明VaERF095基因啟動子能正向響應(yīng)外源激素的誘導(dǎo)。

3討論

冬季低溫脅迫引起植物生理、形態(tài)、生化、表型和分子水平等方面的變化（Ritonga et al.，2021），在我國北方葡萄栽培生產(chǎn)過程中，為抵御冬季低溫進(jìn)行埋土防寒，造成生產(chǎn)成本的增加。與常規(guī)雜交育種相比，通過基因工程手段改良?xì)W洲葡萄抗寒性，可有效提高育種效率。因此，解析抗寒相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子功能和作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步挖掘山葡萄中的抗寒基因，為葡萄抗寒育種提供潛在靶標(biāo)基因。ERF轉(zhuǎn)錄因子與植物激素間存在復(fù)雜的低溫脅迫應(yīng)答機(jī)理。本研究從山葡萄中克隆獲得VaERF095基因，在低溫脅迫及外源激素（ET、SA、MeJA和ABA）的誘導(dǎo)下，VaERF095基因的相對表達(dá)量呈不同程度的升高，均為正向響應(yīng)。Sun等（2016，2019a，2019b）研究也發(fā)現(xiàn)，山葡萄ERF家族基因VaERF080、VaERF087、VaERF057和VaERF092均能正向響應(yīng)低溫（4℃）脅迫，且VaERF080和VaERF087基因還可正向響應(yīng)乙烯誘導(dǎo)。在其他植物中也有相似的研究報道，例如山荊子MbERF12基因過量表達(dá)時，通過乙烯信號通路可增加擬南芥的抗寒性（Han et al.， 2021）;低溫脅迫和茉莉酸（JA）誘導(dǎo)番茄SIERFB8基因的表達(dá)，正向調(diào)控抗寒性（Ding et al.，2022）;香蕉MaERF110參與乙烯誘導(dǎo)的抗寒性（Xiao et al.，2023）;歐洲葡萄赤霞珠中VvERF63基因的表達(dá)受到低溫和ABA的誘導(dǎo)，正向調(diào)控擬南芥和葡萄葉片的抗寒性（Liet al.，2023）。然而除正向響應(yīng)之外，也有部分植物中的ERF轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控抗寒性，例如水稻OsERF096基因通過抑制茉莉酸介導(dǎo)的低溫信號通路，負(fù)調(diào)控對低溫脅迫的耐受性（Sun et al.，2022）。上述結(jié)果表明，ERF轉(zhuǎn)錄因子作為家族基因，在各個物種中成員眾多，在響應(yīng)低溫和激素應(yīng)答調(diào)控方面也具有多樣性。本研究山葡萄VaERF095基因表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，該基因響應(yīng)低溫脅迫可能與ET、SA、MeJA和ABA4種植物激素信號通路有關(guān)，為葡萄抗寒相關(guān)ERF轉(zhuǎn)錄因子基因。氨基酸序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VaERF095與歐洲葡萄VvERF095的氨基酸序列一致，說明VaERF095基因參與低溫脅迫應(yīng)答，可能與其啟動子功能相關(guān)。

基因啟動子中存在各種順式作用元件，參與調(diào)控基因功能。已有文獻(xiàn)報道不同植物ERF轉(zhuǎn)錄因子啟動子中含有脅迫和激素響應(yīng)元件。番茄ERF家族基因啟動子序列含有ARE、TC-rich repeats、MBS、LTR等脅迫響應(yīng)元件（Zhu et al.，2020）;棉花GhERF14基因啟動子中含有ABA響應(yīng)元件ABRE和ET響應(yīng)元件（ERE），在受ET、JA和SA誘導(dǎo)時，該基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢（趙龍飛等，2022）;桑樹MaERF105-Like基因啟動子中含有ET、ABA、MeJA相關(guān)順式作用元件（黃仁維等，2022）;中國櫻桃PpcERF5基因啟動子中含有低溫響應(yīng)元件（LTR）、ABA響應(yīng)元件（ABRE）等，啟動子受低溫和ABA誘導(dǎo)表達(dá)（高玉迪等，2021）。在本研究中，也發(fā)現(xiàn)了VaERF095基因啟動子序列中含有低溫響應(yīng)元件（LTR）、乙烯響應(yīng)元件（ERE）、SA響應(yīng)元件（TCA-element）、MeJA響應(yīng)元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）及ABA響應(yīng)元件（ABRE），與其他物種ERF轉(zhuǎn)錄因子基因啟動子中含有的順式作用元件相似。對山葡萄VaERF095基因啟動子和歐洲葡萄VvERF095基因啟動子序列中的主要順式作用元件進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VaERF095基因啟動子比VvERF095基因啟動子中多1個低溫響應(yīng)元件（LTR）。本研究GUS活性分析結(jié)果顯示，在低溫脅迫和外源激素（ET、SA和ABA）誘導(dǎo)下，VaERF095基因啟動子活性較對照極顯著升高，在MeJA誘導(dǎo)下，VaERF095基因啟動子活性顯著增強(qiáng)，說明VaERF095基因的啟動子為誘導(dǎo)型啟動子，序列中含有的低溫和激素響應(yīng)元件參與調(diào)控VaERF095基因表達(dá)，啟動子活性變化與VaERF095基因表達(dá)模式一致，均為正向響應(yīng)，后續(xù)需進(jìn)一步深入探究VaERF095基因及其啟動子參與低溫脅迫的具體調(diào)控機(jī)制，可重點關(guān)注上游調(diào)控因子對VaERF095基因啟動子的表達(dá)調(diào)控，利用酵母單雜交等試驗篩選與VaERF095基因啟動子互作的轉(zhuǎn)錄因子，完善VaERF095基因參與山葡萄抗寒性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

4結(jié)論

山葡萄品種左山-1中VaERF095基因及其啟動于正向響應(yīng)低溫（4℃）以及外源激素（ET、SA、MeJA和ABA）的誘導(dǎo)，具有明顯組織表達(dá)特異性。

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（責(zé)任編輯 陳燕）