【摘要】目的 探索醛縮酶A（ALDOA）過表達和基因敲減對膀胱癌T24細胞生長和侵襲的影響，為探討泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)病機制提供理論依據(jù)。方法 通過慢病毒感染構(gòu)建穩(wěn)定表達的ALDOA過表達和基因敲減膀胱癌T24細胞重組細胞株，采用熒光定量PCR

（RT-PCR）法檢測重組細胞ALDOAmRNA的表達情況；采用CCK-8法、細胞劃痕實驗、Transwell小室實驗檢測重組T24細胞的增殖、遷移和侵襲能力。結(jié)果 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，過表達組重組T24細胞ALDOAmRNA的相對表達量較對照組更高，基因敲減組較對照組更低，證實膀胱癌T24細胞重組細胞株構(gòu)建成功；CCK-8法檢測重組細胞增殖結(jié)果顯示：在培養(yǎng)72、96 h時，過表達組重組T24細胞生存率均較對照組更高；在培養(yǎng)96 h時，基因敲減組T24細胞生存率較對照組更低；劃痕愈合實驗結(jié)果顯示：在培養(yǎng)24 h時，過表達組重組T24細胞劃痕愈合率較對照組更高；Transwell小室細胞實驗結(jié)果顯示：在培養(yǎng)48 h時，過表達組重組T24細胞遷移數(shù)較對照組更多，過表達組重組T24細胞侵襲數(shù)較對照組更多（均P<0.05）；培養(yǎng)24 h時，基因敲減組重組T24細胞劃痕愈合率較對照組更低；在培養(yǎng)48 h時，基因敲減組重組T24細胞遷移數(shù)較對照組更少，但差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。結(jié)論 ALDOA過表達可促進膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲，ALDOA基因敲減可減少膀胱癌T24細胞增殖、遷移和侵襲。

【關(guān)鍵詞】醛縮酶A ; 基因敲減 ; 基因過表達 ; 膀胱癌T24細胞

【中圖分類號】R737.14 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.14.0029.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.14.010

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病原因尚不明確，一般認為與經(jīng)常接觸致癌物質(zhì)有關(guān)，高復(fù)發(fā)率和早期轉(zhuǎn)移是造成膀胱癌病死率高的主要原因[1-2]。目前尚無有效治療方法，因此，尋找新的治療靶標和策略顯得尤為迫切。有氧糖酵解是大多數(shù)腫瘤細胞主要的能量獲取方式，糖酵解過程多種催化酶在腫瘤組織中表達增加，并促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。醛縮酶A（ALDOA）是糖酵解過程中關(guān)鍵酶之一，可催化1， 6-二磷酸果糖裂解3磷酸甘油醛和磷酸二酰甘油。有研究顯示，ALDOA在多種腫瘤組織中高表達，并促進腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲[4]，且ALDOA在膀胱癌組織中高表達，與患者腫瘤組織低分化和較差預(yù)后密切相關(guān)[5]。但有關(guān)ALDOA對膀胱癌細胞增殖和侵襲的影響尚不清楚?；诖?，本研究通過構(gòu)建ALDOA過表達和基因敲減膀胱癌T24重組細胞株，研究ALDOA差異性表達對膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 膀胱癌細胞株T24（中國科學院上海生物所細胞庫）。

1.2 主要試劑與儀器 ALDOA過表達和shRNA干擾慢病毒顆粒（上海吉凱基因技術(shù)有限公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒、RIPA裂解液和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)公司）；Transwell小室和6孔板（美國Corning公司），Trizol RNA提取試劑（美國Invitrogen公司）。倒置顯微鏡（尼康公司，型號：ECLIPSE Ts2）；實時定量PCR擴增儀（伯樂實驗有限公司，型號：CFX96 Deep Well）；酶標儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司，型號：Multiskan FC]。

1.3 研究方法

1.3.1 醛縮酶A過表達和shRNA病毒轉(zhuǎn)染人膀胱癌T24細胞株 T24細胞用含有10%胎牛血清的

RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染前1 d取對數(shù)生長期的細胞，將其鋪板到35 mm培養(yǎng)皿，使感染時細胞密度約達80%，24 h后加入病毒稀釋液：ALDOA過表達組加入pLV-ALDOA慢病毒的病毒稀釋液1.7 mL，病毒滴度為1×106 TU/mL，對照組加入空載質(zhì)粒的病毒稀釋液1.7 mL。 ALDOA基因敲減組加入含shRNA慢病毒的病毒稀釋液1.7 mL，病毒滴度為

1×106 TU/mL，對照組加入空載質(zhì)粒的病毒稀釋液1.7 mL。用病毒培養(yǎng)液替換原細胞培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。第2天換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡觀察，估計慢病毒感染細胞的效率，同時，將細胞擴大培養(yǎng)后凍存。

1.3.2 實時定量PCR（RT-PCR）檢測重組ALDOAmRNA的表達 收集感染慢病毒的重組細胞，按照說明書提取細胞中總RNA，檢測濃度合格后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，按照以下條件進行RT-PCR反應(yīng)，目的基因引物：醛縮酶A-F：GTGGGCATCAAGGTAGACAAGGG；醛縮酶A-R：TGCTGGCAGATACTGGCATAACG。內(nèi)參引物：GAPDH-R：CAAGGGCATCCTGGGCTACACT；GAPDH-R：CTCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC。反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，上游引物0.8 μL，2SYGR 10 μL，加水補足20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。溶解曲線：65 ℃到95 ℃，每

0.5 ℃保溫5 s。RT-PCR采用2-ΔΔCt法進行定量分析并計算ALDOA mRNA相對表達量。均進行3次獨立實驗。

1.3.3 CCK-8法檢測重組細胞增殖 取對數(shù)生長期的過表達和基因敲減重組T24細胞，胰酶消化，離心去上清，重懸后計數(shù)，稀釋至細胞密度2×107個/L，加入96孔板中，每孔100 μL，另設(shè)置只加培養(yǎng)液的對照孔。設(shè)置測定時間點為0、24、48、72和96 h，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后，測定前24 h加入CCK-8試劑，每孔10 μL，混勻后置于培養(yǎng)箱24 h，酶標儀測定波長450 nm處各組的吸光度（OD）值，并計算細胞生存率。細胞生存率=（OD實驗組－OD對照組）/（OD對照組－OD空白組）×100%。均進行3次獨立實驗。

1.3.4 劃痕愈合實驗檢測重組細胞遷移 取對數(shù)生長期的過表達和基因敲減重組T24細胞，將細胞以3×105個/孔的密度接種于六孔板中，細胞生長融合至80%～90%時，用10 μL槍頭垂直劃痕，PBS清洗劃下的細胞，重復(fù)2次，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育，分別在0、24 h用倒置顯微鏡觀察拍照，圖片用Image J軟件進行處理，并計算劃痕愈合率，愈合率=（0 h劃痕寬度－24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。均進行3次獨立實驗。

1.3.5 Transwell小室實驗檢測重組細胞遷移和侵襲 取生長良好的過表達和基因敲減重組T24細胞，加入無血清培養(yǎng)基24 h，取2×104個細胞與200 μL無血清培養(yǎng)基加入上室，用于檢測細胞遷移；取5×104個細胞與基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基稀釋到1 mg/L，取200 μL加入上室，檢測細胞侵襲。在下室加入500 μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，在37 ℃孵育48 h后，將小室上層未侵襲細胞除去，用4%多聚甲醛溶液固定15 min，后用0.1%結(jié)晶紫染色處理10 min，經(jīng)PBS洗滌并干燥后，顯微鏡下隨機取5個（×200）視野拍照，圖片用Image J軟件進行處理；計算細胞數(shù)。均進行3次獨立實驗。

1.4 觀察指標 ⑴通過RT-PCR檢測觀察ALDOA過表達組及基因敲減組重組細胞mRNA的表達水平。⑵通過CCK-8法檢測ALDOA過表達組及基因敲減組重組細胞的生存率。⑶通過劃痕愈合實驗檢測ALDOA過表達組及基因敲減組重組細胞劃痕愈合率，通過Transwell小室細胞實驗檢測ALDOA過表達組及基因敲減組重組細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，所有實驗結(jié)果均重復(fù)3次取平均值，計量數(shù)據(jù)均以（ x ±s）表示，組間比較采獨立樣本t檢驗。 P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達和敲減重組細胞ALDOAmRNA的表達水平 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，過表達組重組細胞ALDOAmRNA的相對表達量為[（187.75±9.19）%]高于對照組重組細胞ALDOAmRNA的相對表達量[（105.05±5.00）%]，差異有統(tǒng)計學意義（t值=10.725，

P<0.05），見圖1；基因敲減組重組細胞ALDOAmRNA的相對表達量為[（2.73±0.14）%]較對照組更低，差異有統(tǒng)計學意義（t值=13.812，P<0.05），見圖2。

2.2 ALDOA過表達和基因敲減重組細胞生存率檢測結(jié)果 培養(yǎng)72 h、96 h時，過表達組重組細胞生存率為

[（119.37±5.97）%]、[（154.71±7.74）%]，均高于對照組重組細胞生存率[（72.48±3.62）%]、[（94.52±4.73）%]，差異均有統(tǒng)計學意義（t值=11.627、12.047，均P<0.05），見圖3；培養(yǎng)96 h時，基因敲減組細胞生存率為[（67.38±3.37）%]，低于對照組細胞生存率[（92.59±4.63）%]，差異有統(tǒng)計學意義（t值=5.738，P<0.05），見圖4。

2.3 ALDOA過表達和基因敲減對重組細胞遷移的影響 劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h時，過表達組重組細胞劃痕愈合率為[（79.38±3.97）%]高于對照組重組細胞劃痕愈合率[（52.14±2.61）%]，差異有統(tǒng)計學意義

（t值=5.831，P<0.05）；基因敲減組重組細胞劃痕愈合率為[（41.57±2.08）%]與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t值=3.627，P>0.05），見圖5。

2.4 ALDOA過表達和基因敲減重組細胞遷移和侵襲的影響 Transwell小室細胞實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h時，過表達組重組細胞遷移數(shù)為[（120.51±6.07）個]多于對照組重組細胞遷移數(shù)[（85.36±4.32）個]，差異有統(tǒng)計學意義（t值=8.325，P<0.05）；基因敲減組重組細胞遷移數(shù)為[（75.72±3.85）個]與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t值=2.948，P>0.05），見圖6。在培養(yǎng)48 h時，過表達組重組細胞侵襲數(shù)為[（105.83±5.32）個]多于對照組重組細胞侵襲數(shù)[（72.43±3.64）個]，差異有統(tǒng)計學意義（t值=5.927，P<0.05）；基因敲減組重組細胞侵襲數(shù)為[（61.75±3.16）個]與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t值=3.529，P>0.05），見圖7。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病原因包括內(nèi)在遺傳因素和外在的環(huán)境因素，為研究ALDOA對膀胱癌細胞增殖和侵襲能力的影響，本研究首先構(gòu)建了針對ALDOA的過表達和基因敲減（shRNA干擾）的慢病毒載體，并篩選出能夠穩(wěn)定表達的ALDOA過表達和基因敲減膀胱癌T24重組細胞株。本研究結(jié)果中，

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，過表達組重組細胞ALDOAmRNA的相對表達量高于對照組，基因敲減組較對照組更低，提示ALDOA過表達和基因敲減膀胱癌T24重組細胞株構(gòu)建

成功。

本研究結(jié)果顯示，在培養(yǎng)72、96 h時，過表達組重組細胞生存率均較對照組更高；在培養(yǎng)96 h時，基因敲減組細胞生存率較對照組更低；這提示過表達ALDOA可促進腫瘤生長，腫瘤細胞生存率更高，基因敲減ALDOA可延緩腫瘤生長，腫瘤細胞生存率更低，這與既往的研究[6]結(jié)果相近。過表達ALDOA可以促進纖維肌動蛋白組裝成微管，微管的增長在細胞周期胞質(zhì)分裂過程中起到關(guān)鍵作用，隨著微管的增長，完成復(fù)制的染色體被牽拉分離進入子細胞，進而促進細胞分裂增殖[7]。

本研究結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24 h后，過表達組重組細胞劃痕愈合率較對照組更高；在培養(yǎng)48 h后，過表達組重組細胞遷移數(shù)較對照組更多，過表達組重組細胞侵襲數(shù)較對照組更多；在培養(yǎng)24 h后，基因敲減組重組細胞劃痕愈合率較對照組更低。這提示ALDOA過表達重組細胞侵襲和遷移能力明顯增強，ALDOA在腫瘤細胞獲得轉(zhuǎn)移能力的過程中起重要作用，這與SAITO等[8]的研究結(jié)果相近。ALDOA過表達可以明顯降低腫瘤細胞上皮性標志物N-cadherin的表達，增加間質(zhì)性標志物N-cadherin和vimetin的表達，增加胞質(zhì)內(nèi)β-caterin 表達量，ALDOA可以促進腫瘤細胞上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化。上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移生長的關(guān)鍵啟動步驟之一[9]；

Wnt/β-caterin信號通路是誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要信號通路，β-caterin是該信號通路激活的關(guān)鍵信使分子[10]。有研究認為ALDOA通過與胞質(zhì)中破壞復(fù)合物中GSK3結(jié)合，使β-caterin無法磷酸化而避免被泛素化降解，在細胞質(zhì)內(nèi)積累并移至細胞核，激活相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。但在膀胱癌中ALDOA是否參與此過程尚不清楚，需進一步研究證實。此外，ALDOA基因敲減重組細胞的增殖會受到顯著抑制，但對其侵襲和遷移無明顯影響，這為利用ALDOA抑劑靶向治療膀胱癌提供了

依據(jù)。

綜上，本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達ALDOA和基因敲減膀胱癌T24重組細胞株，ALDOA過表達可顯著增強膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，為膀胱癌的靶向治療提供了新的策略。

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1 基金項目：福建省自然科學基金資助項目（編號：2020J01206）

作者簡介：李建偉，博士研究生，主任醫(yī)師，研究方向：泌尿腫瘤發(fā)病機制。