摘要 ［目的］建立1%甲酸-乙腈提取結(jié)合QuEChERS凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定紅棗中5種植物生長調(diào)節(jié)劑的方法。［方法］比較不同提取試劑、凈化材料等對提取凈化效果的影響。在ESI源正/負離子模式下，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式采集數(shù)據(jù)，進行定性和定量分析。［結(jié)果］5種植物生長調(diào)節(jié)劑在1～50 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2>0.999），方法檢出限和定量限分別為0.1～0.2和0.3～0.6 μg/kg?？瞻准t棗3個不同的添加水平回收率為82.5%～106.1%，相對標準偏差（RSD）為1.0%～8.4%。通過對市售紅棗樣品檢測，能夠準確測定紅棗中植物生長調(diào)節(jié)劑水平。［結(jié)論］該方法簡單、快速、準確可靠，適用于紅棗中5種植物生長調(diào)節(jié)劑的快速測定。

關(guān)鍵詞 紅棗；植物生長調(diào)節(jié)劑；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；QuEChERS

中圖分類號 TS255.7 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）14-0165-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.14.036

Determination of Five Plant Growth Regulator in Red Jujube by QuEChERS Purification High-performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

LU Li-liang， CHEN Yong-fa， ZHANG Jin-lei et al

（Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science/Food Quality Inspection and Testing Center（Shihezi），Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Shihezi，Xinjiang 832000）

Abstract ［Objective］A method was developed for the simultaneous determination of 5 plant growth regulators （PGRs） in red jujube by using 1% formic acid-acetonitrile extraction and QuEChERS cleanup with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） detection. ［Method］The effects of different extraction reagents， purification materials， etc. on the extraction and purification efficiency were compared. Data were collected in multiple response monitoring （MRM） mode in ESI source positive/negative ion mode for qualitative screening and quantitative analysis. ［Result］The linear relationship of the five plant growth regulators was good within the mass concentration range of 1-50 ng/mL （R2>0.999），the detection and quantification limits were 0.1-0.2 and 0.3-0.6 μg/kg， respectively. The recovery rates of three different addition levels of blank red jujube were 82.5%-106.1%， the relative standard deviation （RSD） was 1.0%-8.4%.Through the detection of actual samples in the market， the level of PGRs in red jujube could be accurately quantified. ［Conclusion］The method is simple， rapid， accurate and reliable， and suitable for the rapid determination of five plant growth regulators in jujube.

Key words Red jujube;PGRs;HPLC-MS/MS;QuEChERS

作者簡介 魯立良（1981—），男，安徽潁上人，高級實驗師，博士，從事食品安全與工程研究。

收稿日期 2023-09-20

植物生長調(diào)節(jié)劑（PGRs）是人工合成或從微生物中提取的與植物激素具有相似生理和生物學(xué)效應(yīng)，能夠調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的有機化合物，也稱為植物外源激素［1-2］，如赤霉素、多效唑、矮壯素、萘乙酸、2，4-D等。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，使用適量的PGRs，可以有效調(diào)控農(nóng)作物的生長發(fā)育過程，促進農(nóng)作物穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)、改善品質(zhì)、增強作物抗逆性等［3-4］。但過量使用可能會使農(nóng)作物過快生長，或生長受到抑制，嚴重的可能會導(dǎo)致農(nóng)作物死亡，嚴重影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量；另外，不規(guī)范的使用還容易造成土壤和水體等的環(huán)境污染，同時易導(dǎo)致PGRs在農(nóng)作物中的殘留，并通過食物鏈的傳遞和富集進入人體，給人們的健康帶來巨大危害。因此，PGRs的使用已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注［5-7］。

紅棗含有豐富的維生素、礦物質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)和藥用價值。在紅棗的種植生產(chǎn)過程中會使用到多種PGRs，由于使用不規(guī)范容易導(dǎo)致PGRs在紅棗中殘留。為了減少潛在的健康風險，急需對紅棗中PGRs進行風險調(diào)查。目前，用于檢測PGRs含量的標準相對較少，前處理過程復(fù)雜，耗費大量的有機試劑，且紅棗含有大量的糖分和營養(yǎng)物質(zhì)，基質(zhì)十分復(fù)雜，PGRs的提取和凈化成為紅棗中PGRs殘留分析的關(guān)鍵。PGRs的提取主要使用有機溶劑，如甲醇［8］、乙腈［9］等，甲醇的極性相對較小，提取的共萃物較多；乙腈提取時回收率高、干擾物較少，是廣泛使用的有機污染物提取試劑；PGRs凈化方法主要有固相柱凈化法和 QuEChERS［10］等，固相柱凈化法需要對固相柱進行活化，使用較多的有機試劑，QuEChERS法具有操作簡便、分析速度快、回收率高、試劑用量少等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于有機污染物的凈化。PGRs的測定方法主要有氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）和離子色譜法（IC）等［11-13］。GC和GC-MS通常要進行待測物衍生化，操作復(fù)雜；HPLC靈敏度較低，難以實現(xiàn)確證分析；HPLC-MS/MS具有高特異性和高靈敏度，具有定性、定量分析準確的特點，適合復(fù)雜樣品中痕量成分的定性定量分析［14-15］。

目前，紅棗中的PGRs檢測存在一定的不足，建立一種快速、高效、準確度高的檢測方法，對紅棗中的PGRs風險監(jiān)控具有重要的意義。該研究采用有機溶劑提取、QuEChERS方法凈化處理，結(jié)合HPLC-MS/MS同時測定鮮棗中5種植物生長調(diào)節(jié)劑，同時，通過對市售鮮棗的實際檢測，驗證方法的準確性，獲得了低檢出限、快速、簡便的PGRs檢測方法，為市場監(jiān)督檢驗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX QTRAP5500+高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB公司）；N-EVAPTM112氮吹儀（美國Organomation Associates公司）；3-30K高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；IKA MS3渦旋混合器（德國IKA公司）；SBL-30PT超聲波恒溫清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；IQ7000超純水儀（美國MilliQ公司）。

5種標準品：赤霉素、多效唑、矮壯素、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），純度均大于97%，德國Dr.Ehrenstorfer公司。乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；甲酸（色譜純）；無水硫酸鎂（分析純）；無水乙酸鈉（分析純）；C18（分析純）。

1.2 標準溶液的配制

1.2.1

標準品儲備液。分別準確稱取適量的赤霉素、多效唑、矮壯素、萘乙酸和2，4-D于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1.0 mg/mL標準儲備液，于-18 ℃儲存。

1.2.2

混合標準品工作液。準確量取“1.2.1”各標準品儲備液，于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成100.0 ng/mL混合標準品中間液，于-18 ℃儲存。

1.3 儀器條件

1.a1a5d148eba65891504b9654f475ea6f3.1 色譜條件。色譜柱為ACQUITY HPLC BEH C18（1.7 μm，100 mm × 2.1 mm，美國Waters公司）；流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速0.30 mL/min；進樣量5 μL，柱溫30 ℃。梯度洗脫，洗脫程序見表1。

1.3.2

質(zhì)譜條件。離子化模式為電噴霧離子源（±ESI源），掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM），IS電壓4 500 V，源溫度500 ℃，霧化氣溫度50 ℃，氣簾氣241.32 kPa，輔助氣344.74 kPa，碰撞氣55.16 kPa。采集方式為正/負離子，其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.4 試驗方法

1.4.1 PGRs提取。

準確稱取均質(zhì)后的鮮棗樣品10 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液，高速勻漿 2 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g無水乙酸鈉，立即渦旋混合1 min，以10 000 r/min離心5 min，使乙腈和水相分層。

1.4.2 QuEChERS凈化。

取4 mL上層乙腈溶液于QuEChERS離心管（含300 mg無水硫酸鎂和100 mg C18）中，渦旋混合2 min，以10 000 r/min 離心5 min，移取全部上清液于15 mL玻璃管中，45 ℃水浴，氮氣吹至近干，甲醇定容至1 mL，渦旋混勻1 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

首先比較了ACQUITY HPLC BEH C18（1.7 μm，100 mm × 2.1 mm）、XSelect csh C18（2.5 μm，100 mm×2.1 mm）和ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8 μm，3.0 mm×150 mm）3款色譜柱對5種PGRs的分離效果和色譜峰型的影響，結(jié)果表明，XSelect csh C18和ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱對萘乙酸的保留性能較差；而ACQUITY HPLC BEH C18色譜柱為三鍵鍵合式烷基柱，具有較寬的pH適應(yīng)性，對離子化化合物具有較強的選擇性，能較好地分離5種PGRs，且峰形尖銳，分析時間較短。因此，該研究選擇ACQUITY HPLC BEH C18色譜柱為分離柱。

分別比較了水-乙腈、水-甲醇體系作為流動相時5種PGRs的分離效果，結(jié)果表明，以水-甲醇作為流動相時，5種化合物出峰時間較快且分離效果和峰型較差，而以水-乙腈作為流動相時，5種化合物的色譜峰分離度好，峰型對稱。在流動相中加入一定量酸，可促進化合物電離，提高其離子化效率和靈敏度。當加入0.1%甲酸時，能有效抑制赤霉素、萘乙酸、2，4-D中羧酸官能團的電離，提高在流動相中的溶解度，故該試驗選擇0.1%甲酸水-乙腈為流動相。5種植物生長調(diào)節(jié)劑空白基質(zhì)標準溶液的總離子流圖如圖1所示。

2.2 提取溶劑的選擇

比較了不同試劑對5種PGRs提取效率的影響，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，甲醇和水作為提取溶劑時，較為渾濁，說明共萃物較多，不利于后續(xù)的凈化。而乙腈具有更強的極性，對5種PGRs的提取效果更佳。同時，在乙腈中添加少量的甲酸可以抑制赤霉素、萘乙酸、2，4-D中羧酸官能團的電離，增大在乙腈中的溶解度。因此，該研究選擇1%甲酸乙腈作為提取溶劑。

2.3 凈化方式的選擇

比較了C18柱、HLB柱和QuEChERS這3種凈化方式對5種PGRs凈化回收率的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，HLB柱與QuEChERS的回收率相差不大，均高于C18柱，但使用固相小柱時需要先后用有機試劑活化和淋洗，有機試劑用量較大且耗時。QuEChERS凈化法具有快速、簡便、有機試劑用量少、回收率高、準確度高等特點，常用的凈化材料有C18、石墨化炭黑、無水硫酸鎂、氟羅里硅土等，可根據(jù)實際凈化樣品選擇合適的凈化材料，可操作性強。因此，綜合考慮，該研究采用QuEChERS凈化方法，以無水硫酸鎂和C18為凈化材料，無水硫酸鎂具有很強的吸水性，能去除提取溶劑里的水分，C18可以去除色素等弱極性小分子。

2.4 標準曲線、方法檢出限和定量限

按“1.3”儀器條件進行測定，以5種PGRs的質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，并得出線性方程（表3）。結(jié)果表明，5種PGRs在1～50 ng/mL線性關(guān)系良好（R2>0.999）。

在空白紅棗樣品中添加不同濃度的5種PGRs混合標準溶液（n=6），按“1.4”方法處理后檢測，以信噪比S/N≥3確定方法的檢出限（LOD），S/N≥10確定方法的定量限（LOQ），得到5種PGRs的LOD和LOQ，見表3。從表3可以看出，5種PGRs的LOD為0.1～0.2 μg/kg，LOQ為0.3～0.6 μg/kg。

2.5 準確度與精密度

在優(yōu)化的條件下，在空白紅棗樣品中進行5種PGRs的加標回收試驗，加標水平分別為5、10和20 μg/kg，按前處理過程測定6個加標平行樣，計算回收率和精密度，結(jié)果見表4。從表4可以看出，5種PGRs在5、10、

20 μg/kg加標水平下的回收率分別為82.5%～106.1%、97.0%～103.5%和89.9%～100.7%，相對標準偏差（RSD）分別為3.6%～6.4%、1.0%～8.4%和1.2%～5.5%，回收率和精密度均滿足分析方法的要求。

2.6 實際紅棗樣品測定

研究了當?shù)厥袌鲣N售的2個批次共20個紅棗中PGRs的殘留情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），市售紅棗中有不同程度的PGRs檢出，其中有9個樣品檢出矮壯素，檢出含量在4.98～6.32 μg/kg，有3個樣品檢出赤霉素，檢出含量在8.75～10.00 μg/kg，這可能與矮壯素和赤霉素的使用量較大相關(guān)，樣品色譜圖見圖5～6。

3 結(jié)論

采用有機溶劑為提取溶劑，QuEChERS凈化、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時快速測定紅棗中矮壯素、赤霉素、萘乙酸、2，4-D、多效唑這5種PGRs，比較了不同提取溶劑、凈化方法對提取凈化效果的影響。試驗結(jié)果表明，1%甲酸乙腈溶劑為提取溶劑時提取效果更好，QuEChERS凈化效果整體優(yōu)于固相柱，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行定性定量分析，5種PGRs得到有效分離，重現(xiàn)性好，方法檢出限和精密度均能滿足分析要求。該方法前處理簡單，縮短了樣品前處理時間，靈敏度高，準確性好，適用于紅棗中5種PGRs的快速定性篩查及準確定量測定。

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