【摘要】 背景 肝細(xì)胞癌（HCC）是全球常見的癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，約占所有原發(fā)性肝癌病例的90%，其復(fù)發(fā)率和死亡率較高，目前發(fā)生的分子機(jī)制仍不清楚。目的 探索HCC潛在的分子機(jī)制，發(fā)掘新的生物標(biāo)志物。方法 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床相關(guān)信息，通過差異基因表達(dá)分析正常肝臟組織與HCC組織的差異基因；對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析；基于TCGA中HCC的基因表達(dá)數(shù)據(jù)概況，使用WGCNA R包建立共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA），選擇具有臨床意義的模塊，并篩選候選Hub基因；進(jìn)一步分析候選Hub基因在HCC組織和正常肝臟組織顯著差異表達(dá)、與HCC患者總體生存期和無病生存期是否顯著相關(guān)，最終確定Hub基因；通過人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Hub基因蛋白表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 本研究的基因表達(dá)數(shù)據(jù)來自50個(gè)正常肝臟組織樣本和373個(gè)HCC組織樣本。通過差異基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)7 230個(gè)在HCC和正常肝臟組織之間差異表達(dá)的基因（HCC中3 691個(gè)上調(diào)基因和3 539個(gè)下調(diào)基因）。富集分析表明，上調(diào)的差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞周期調(diào)控和有絲分裂過程；下調(diào)的差異表達(dá)基因主要參與小分子代謝和有機(jī)酸代謝等過程。WGCNA確定了19個(gè)與HCC患者臨床特征相關(guān)基因模塊，通過分析模塊與臨床特征之間的關(guān)系，篩選出青色模塊和紫色模塊。青色模塊基因中同時(shí)與患者總生存期和無病生存期強(qiáng)烈相關(guān)的前兩個(gè)基因?yàn)閂PS45和FAM189B；紫色模塊基因中同時(shí)與患者總生存期和無病生存期強(qiáng)烈相關(guān)的前兩個(gè)基因分別為CLEC1B和FCN3，因此將VPS45、FAM189B、CLEC1B和FCN3確定為最終的Hub基因。人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)免疫組織化學(xué)染色顯示：VPS45和FAM189B在HCC組織中的表達(dá)高于正常肝臟組織，F(xiàn)CN3在HCC組織中的表達(dá)低于正常肝臟組織，CLEC1B在HCC組織和正常肝臟組織中表達(dá)差異不明顯。結(jié)論 初步確定VPS45、FAM189B、CLEC1B和FCN3可能是HCC的新型潛在生物標(biāo)志物，這些Hub基因可能為HCC的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 癌，肝細(xì)胞；加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析；Hub基因；分子靶向治療

【中圖分類號(hào)】 R 730.261 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0243

Analysis and Identification of Hub Genes in Hepatocellular Carcinoma Based on Weighted Gene Co-expression Network and Cancer Genome Atlas Clinical Data

CHEN Chao1，CHEN Tianxiang2，LIU Qianwei1，ZHANG Zhi1，WANG Huanhuan2，WU Pingping1，GAO Lei1，YU Zhaoxiang1*

1.Department of General Surgery，the First Affiliated Hospital of Xi'an Medical University，Xi'an 710077，China

2.Department of Hepatobiliary Surgery，the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China

*Corresponding author：YU Zhaoxiang，Professor/Chief physician；E-mail：yuzhaoxiang2@163.com

【Abstract】 Background Hepatocellular carcinoma（HCC） is the third leading cause of common cancer-related mortality globally，accounting for approximately 90% of all primary liver cancer cases. Its recurrence and mortality rates are high，with the underlying molecular mechanisms remaining unclear. Objective To explore potential molecular mechanisms of HCC and explore novel biomarkers. Methods RNA-seq expression data and clinical information were retrieved from TCGA database，differential gene expression analysis was conducted between normal liver tissue and HCC tissue. Enrichment analysis on the differentially expressed genes was performed. Based on the gene expression data profiles of HCC in TCGA，a co-expression network was established using the WGCNA R package，and weighted gene co-expression network analysis（WGCNA） was performed to select clinically significant modules and screen candidate Hub genes；the candidate Hub genes were further analyzed for significant differential expression in HCC tissues and normal liver tissues，and whether they were significantly correlated with the overall survival and disease-free survival of HCC patients. The Hub genes were conclusively identified，and their protein expression was validated through the Human Protein Atlas database. Results The genetic expression data in this study were obtained from 50 normal liver tissue samples and 373 HCC tissue samples. Through differential gene expression analysis，a total of 7 230 genes differential expression between HCC and normal hepatic tissue，comprising 3 691 up-regulated genes and 3 539 down-regulated genes in HCC were identified. Enrichment analysis showed that the up-regulated differentially expressed genes were mainly involved in cell cycle regulation and mitotic processes；the down-regulated differentially expressed genes were mainly involved in processes such as small molecule metabolism and organic acid metabolism. WGCNA identified 19 gene modules related to the clinical features of HCC patients，the cyan and purple modules were screened by analyzing the relationship between the modules and the clinical features. The first two genes in the cyan module genes that were strongly associated with both overall survival and disease-free survival of patients were VPS45 and FAM189B. In the purple module genes，first two genes that were strongly associated with both overall survival and disease-free survival of patients were CLEC1B and FCN3，respectively；therefore，VPS45，F(xiàn)AM189B，CLEC1B and FCN3 were identified as the final Hub genes. Immunohistochemical staining in the Human Protein Atlas database showed that VPS45 and FAM189B were expressed higher in HCC tissues than in normal liver tissues. FCN3 was expressed in HCC tissues lower than in normal liver tissues，the difference in the expression of CLEC1B between HCC tissues and normal liver tissues was not obvious. Conclusion VPS45，F(xiàn)AM189B，CLEC1B and FCN3 have been preliminary identified as possible novel potential biomarkers for HCC，which may provide a theoretical basis for targeted therapy of HCC.

【Key words】 Carcinoma，hepatocellular；Weighted gene co-expression network analysis；Hub gene；Molecular targeted therapy

肝細(xì)胞癌（HCC）是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因［1］，也是中國(guó)近年來癌癥相關(guān)死亡的主要原因。HCC在所有原發(fā)性肝癌病例中占90%［2］。HCC發(fā)病機(jī)制的主要危險(xiǎn)因素包括慢性乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染、吸煙、飲酒、超重和非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）、糖尿病以及黃曲霉毒素B1攝入量等［3］，這些因素導(dǎo)致DNA損傷，表觀遺傳改變和癌癥相關(guān)突變，最終導(dǎo)致HCC進(jìn)展［4］。絕大多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期。盡管HCC的治療在近幾年取得很大進(jìn)展，主要包括經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞、分子靶向治療、消融治療、手術(shù)切除和肝移植等［3，5］，但HCC患者的5年生存率仍然很低［6］，并且其5年復(fù)發(fā)率高達(dá)80%～90%，預(yù)后較差［7］。HCC發(fā)生和發(fā)展的確切機(jī)制仍不清楚，因此，闡明HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，開發(fā)新的診斷和治療方法來改善HCC的臨床結(jié)果是非常迫切和必要的。

近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，為癌癥的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀基因組學(xué)的特征提供了新的研究方法。表達(dá)譜的生物信息學(xué)分析已被廣泛用于鑒定新的和更有效的潛在生物標(biāo)志物，用于癌癥的治療和患者預(yù)后［8］。通過生物信息學(xué)的大數(shù)據(jù)分析，可以有效整合復(fù)雜疾病，尤其是癌癥的多個(gè)大規(guī)模數(shù)據(jù)集［9］。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）是一種先進(jìn)的方法，其具有準(zhǔn)確和高效的廣泛基因分析優(yōu)點(diǎn)，用于基于相似的基因表達(dá)模式構(gòu)建共表達(dá)模塊，并分析臨床特征模塊與不同基因組之間的相關(guān)性［10］。WGCNA已被廣泛用于識(shí)別不同類型癌癥相關(guān)的臨床特征模塊和Hub基因。如一項(xiàng)基于WGCNA研究將6個(gè)Hub基因和人腎細(xì)胞癌的進(jìn)展以及患者的預(yù)后聯(lián)系起來［11］，鑒定了在侵襲性腎上腺皮質(zhì)惡性腫瘤中高表達(dá)并與總生存期呈明顯負(fù)相關(guān)的4個(gè)Hub基因（TOP2A、CHEK1、TTK和CENPA）［12］。

本研究通過差異基因表達(dá)分析和WGCNA對(duì)從TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC的mRNA數(shù)據(jù)在表達(dá)和功能水平上進(jìn)行分析。然后進(jìn)行功能富集分析，確定與HCC患者臨床特征相關(guān)的模塊，以了解這些共表達(dá)基因的潛在生物學(xué)功能。通過這些生物信息學(xué)分析鑒定出Hub基因，并結(jié)合生存分析、HCC組織和正常肝臟組織表達(dá)差異分析、免疫組織化學(xué)染色分析和文獻(xiàn)分析進(jìn)行驗(yàn)證。這些結(jié)果將有助于臨床了解HCC的病因和潛在的分子機(jī)制，并為HCC提供新的治療靶點(diǎn)或生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源和數(shù)據(jù)處理

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)［13］（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）中下載HCC患者的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)（50個(gè)正常樣本和373個(gè)HCC樣本）、臨床信息和生存信息（59個(gè)正常樣本和379個(gè)HCC樣本），具體信息見附表1～3（掃描正文首頁二維碼查看），患者臨床信息數(shù)據(jù)和樣本量見表1。根據(jù)注釋文檔將探針轉(zhuǎn)化為基因符號(hào)，通過測(cè)定所有對(duì)應(yīng)探針的中位表達(dá)值，去除同一基因的重復(fù)探針。根據(jù)處理的結(jié)果，總共有11 627個(gè)基因被選中用于后續(xù)分析。分析的工作流程圖見附錄圖1（掃描正文首頁二維碼查看）。

1.2 HCC中差異表達(dá)基因的篩選

使用R軟件包UMAP（version 0.2.7.0）進(jìn)行分析，對(duì)表達(dá)譜進(jìn)行z-score，再使用UMAP函數(shù)進(jìn)行降維分析以獲得降維后的矩陣。Limma（linear models for microarray data）［14］是一種基于廣義線性模型的差異表達(dá)篩選方法，用于識(shí)別正常肝臟組織和HCC組織之間的差異表達(dá)基因，在此處使用R軟件包limma（version 3.40.6）進(jìn)行差異分析，以獲得正常肝臟組織與HCC組織的差異基因。獲取的表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，利用lmFit函數(shù)進(jìn)行多元線性回歸分析，進(jìn)一步使用eBays函數(shù)進(jìn)行分析，最終獲得顯著性差異的基因。

1.3 差異表達(dá)基因的功能富集

對(duì)于基因集進(jìn)行功能富集分析，使用R軟件包org.Hs.eg.db（version 3.1.0）中的基因GO注釋，將其作為背景把基因映射到背景集合中，使用R軟件包c(diǎn)lusterProfiler（version 3.14.3）進(jìn)行富集分析，從而獲取基因集富集的結(jié)果。設(shè)定最小基因集為5，最大基因集為5 000，P<0.05和FDR<0.1作為顯著性差異。

1.4 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

基于TCGA中HCC的基因表達(dá)數(shù)據(jù)概況，使用WGCNA R包建立共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。以基因表達(dá)譜為例：先對(duì)所有成對(duì)基因進(jìn)行Pearson相關(guān)矩陣和平均連鎖法，然后使用冪函數(shù)amn=|Cmn|^β（Cmn=Gene_m和Gene_n）之間的Pearson's相關(guān)，構(gòu)建出加權(quán)鄰接矩陣。β是一個(gè)軟閾值參數(shù)，其可以強(qiáng)調(diào)基因之間的強(qiáng)相關(guān)性。在選擇5的冪之后，將鄰接變換為拓?fù)渲丿B矩陣（topological overlap matrix，TOM）TOMi，j = （lij+ aij）/［min（ki+kj）+1-aij］。為了將具有相似表達(dá)譜的基因分類為基因模塊，根據(jù)基于TOM的不相似性度量進(jìn)行平均連鎖分級(jí)聚類，基因樹圖的最小大?。ɑ蚪M）為50。此外還合并了距離<0.25的模塊，最終獲得了19個(gè)共表達(dá)模塊，其中g(shù)rey模塊被認(rèn)為是無法被分配給任何模塊的基因集合。

1.5 具有臨床意義的模塊的選擇和HCC中的Hub基因的鑒定

基因表達(dá)和臨床特征之間的線性關(guān)系被賦予一個(gè)基因顯著性，等于單個(gè)基因P值的對(duì)數(shù)。如果基因顯著性與模塊成員密切相關(guān)，定義為模塊的特征基因與個(gè)體基因表達(dá)譜之間的相關(guān)性，從而得出結(jié)論該模塊的中心基因與HCC［15］相關(guān)，將這些基因視為候選Hub基因。如先前研究［16］所示：計(jì)算與基因的表達(dá)相關(guān)性以獲得基因顯著性，同時(shí)計(jì)算模塊特征向量與基因的表達(dá)相關(guān)性以獲得模塊成員，根據(jù)截止標(biāo)準(zhǔn)，76個(gè)在臨床顯著模塊中具有高連接性的基因被鑒定為候選Hub基因。

1.6 Hub基因的基因驗(yàn)證和生物信息學(xué)驗(yàn)證

使用GEPIA在線網(wǎng)站（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析HCC樣本中Hub基因的表達(dá)水平，并基于Kaplan-Meier分析使用R套件中的生存包（版本：3.2-7）。從TCGA獲得359個(gè)HCC腫瘤樣本的差異基因表達(dá)譜和預(yù)后數(shù)據(jù)，然后確定每個(gè)基因的中位數(shù)表達(dá)值，根據(jù)給定基因的表達(dá)水平是高于還是低于中位數(shù)，樣本被分配到給定基因的“高表達(dá)”或“低表達(dá)”組。使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)評(píng)估高表達(dá)組或低表達(dá)組之間的總體生存期和無病生存期的顯著性。如果P<0.05，認(rèn)為該基因是經(jīng)過驗(yàn)證的Hub基因。根據(jù)來自TCGA和GEPIA網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)，篩選正常肝臟組織和HCC組織之間Hub基因表達(dá)的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Hub基因蛋白表達(dá)的驗(yàn)證

人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.proteinatlas.org/）主要用于為提供各種人類蛋白質(zhì)的組織和細(xì)胞分布信息。使用來自人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果驗(yàn)證了HCC組織和正常肝臟組織之間生存相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

本研究的表達(dá)數(shù)據(jù)來自50個(gè)正常肝臟組織樣本和373個(gè)HCC組織樣本（附表4）?；谥鞒煞址治鰪臄?shù)據(jù)中排除了14個(gè)腫瘤樣本（圖1A）。最終409個(gè)樣本的基因表達(dá)譜用于后續(xù)分析。

2.2 HCC樣本中差異表達(dá)基因的鑒定及GO富集分析

在50個(gè)正常樣本和359個(gè)HCC樣本之間共鑒定出7 230個(gè)差異表達(dá)基因，差異表達(dá)基因火山圖見圖1B，包括3 691個(gè)上調(diào)基因和3 539個(gè)下調(diào)基因（附表5），差異分析結(jié)果見表2。為了探索差異表達(dá)基因在HCC中的潛在生物學(xué)功能，本研究對(duì)其進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果見附表6和附表7。

上調(diào)的差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞周期調(diào)控、有絲分裂過程、核分裂和染色體分離等（圖2A、2C）；下調(diào)的差異表達(dá)基因主要參與對(duì)外刺激反應(yīng)、小分子代謝和有機(jī)酸代謝等過程（圖2B、2D）。

比較HCC組織和正常肝臟組織的基因表達(dá)差異，獲得表達(dá)數(shù)據(jù)集，根據(jù)差異倍數(shù)為1.5倍，P<0.05為顯著差異，進(jìn)一步利用lmFit函數(shù)進(jìn)行多元線性回歸分析，再使用eBays函數(shù)進(jìn)行分析，最終獲得每個(gè)基因的差異顯著性，并繪制差異表達(dá)基因熱圖（附錄圖2）。

2.3 WGCNA和關(guān)鍵模塊的識(shí)別

加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析基于7 230個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)矩陣和409個(gè)HCC樣本的臨床數(shù)據(jù)。進(jìn)行聚類分析檢查409個(gè)樣本的數(shù)據(jù)質(zhì)量，結(jié)果顯示所有樣本在聚類中并且在截止閾值內(nèi)，加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析中應(yīng)用了6個(gè)臨床變量：疾病狀態(tài)、性別、年齡、體質(zhì)量、TNM分期和微血管侵犯（圖3A）。409個(gè)樣本分為兩個(gè)簇，腫瘤和正常，HCC樣本的臨床特征和數(shù)據(jù)的聚類樹狀圖（圖3B）。

為了構(gòu)建無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)，將軟閾值β設(shè)置為5，獨(dú)立度設(shè)置為0.86，平均連通性接近0（圖4A、4B）。模塊參數(shù)設(shè)置為最小模塊30，敏感性為3，模塊合并閾值為0.25，將其中具有相似表達(dá)模式的差異表達(dá)基因聚集到相同的模塊中，此外合并距離<0.25的模塊，最終獲得了19個(gè)共表達(dá)模塊（附錄圖3），并繪制模塊特征基因熱圖（圖4C），其中g(shù)rey模塊是無法被分配給任何模塊的基因集合，差異基因表達(dá)譜及差異基因見附表8。

然后嘗試評(píng)估模塊與臨床特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)青色模塊的特征基因與HCC之間具有強(qiáng)正相關(guān)（cor=0.64，P=3.6×10-50），而紫色模塊的特征基因與HCC之間具有高度負(fù)相關(guān)（cor=-0.80，P=5.6×10-97）（附錄圖4）。結(jié)果表明，青色模塊可能促進(jìn)HCC的腫瘤發(fā)生，而紫色模塊可能會(huì)預(yù)防HCC。因此，分析青色模塊和紫色模塊的Hub基因。

2.4 從青色和紫色模塊中識(shí)別候選Hub基因

MM和GS分?jǐn)?shù)在青色和紫色模塊中彼此呈正相關(guān)（圖5）。青色模塊中選擇Hub基因的標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)低于標(biāo)準(zhǔn)截止閾值（MM>0.8）。在青色模塊中，選擇滿足“cor.gene Module Membership”>0.7和“cor.gene Trait Significance”>0.5閾值的前8個(gè)基因，分別為TOMM40L、VPS45、MSTO1、FAM189B、TTC13、PYGO2、NVL和EHMT2。在紫色模塊中，選擇滿足“cor.gene Module Membership”>0.8和“cor.gene Trait Significance”>0.7閾值的前16個(gè)基因，分別為CLEC4M、BMP10、CLEC1B、CLEC4G、GDF2、NDST3、BMPER、STAB2、CCL23、CHRM2、COL6A6、CRHBP、FCN3和CCBE1。

2.5 Hub基因表達(dá)及其與生存的相關(guān)性

青色模塊基因中僅與患者總生存期強(qiáng)相關(guān)的前3個(gè)基因分別為TOMM40L、VPS45和FAM189B；青色模塊基因中同時(shí)與患者總生存期和無病生存期強(qiáng)相關(guān)的前兩個(gè)基因?yàn)閂PS45和FAM189B。紫色模塊基因中僅與患者總生存期強(qiáng)相關(guān)的前3個(gè)基因分別為CLEC1B、CCL23和FCN3；紫色模塊基因中同時(shí)與患者總生存期和無病生存期強(qiáng)相關(guān)的前兩個(gè)基因分別為CLEC1B和FCN3（圖6）。因此，將VPS45、FAM189B、CLEC1B和FCN3確定為最終的Hub基因。兩個(gè)模塊中與無病生存期有顯著差異的基因有VPS45、FAM189B、CLEC1B、FCN3和BMPER（附錄圖5）。

使用GEPIA網(wǎng)站，分析這些模塊基因在HCC組織和正常組織之間表達(dá)情況（圖7），結(jié)果顯示，VPS45和FAM189B在HCC組織中上調(diào)，而CLEC1B和FCN3在HCC組織中下調(diào)。使用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)獲得了類似的結(jié)果（附錄圖6）。

2.6 免疫組織化學(xué)染色驗(yàn)證

從人類蛋白質(zhì)圖譜（The Human Protein Atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫(kù)［17］（https：//www.proteinatlas.org）中獲得的免疫組織化學(xué)染色顯示：VPS45和FAM189B在HCC組織中的表達(dá)高于正常肝臟組織，而FCN3在HCC組織中的表達(dá)低于正常肝臟組織，CLEC1B在HCC組織和正常肝臟組織中表達(dá)差異不明顯（圖8）。

3 討論

HCC篩查指對(duì)符合HCC高風(fēng)險(xiǎn)的患者定期進(jìn)行檢查，其目標(biāo)是在早期時(shí)間檢測(cè)出HCC并予以及時(shí)干預(yù)，使患者存活率和生存質(zhì)量提高。在HCC的臨床應(yīng)用中，常見的傳統(tǒng)篩查方式包括肝臟超聲檢查和血清甲胎蛋白，其靈敏度和特異度相對(duì)有限。因此，開發(fā)出新的更準(zhǔn)確的檢測(cè)方式十分具有臨床應(yīng)用價(jià)值。目前研究表明幾個(gè)基因已被確定為HCC診斷的新型生物標(biāo)志物。例如，長(zhǎng)鏈非編碼RNA KDM4A-AS1在許多腫瘤中過度表達(dá)，尤其是在HCC中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA KDM4A-AS1水平與疾病分期和腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)，與患者生存呈負(fù)相關(guān)［18］，LV等［19］研究顯示BAI3和CKAP2L可能是結(jié)直腸癌的潛在預(yù)后因子和治療靶點(diǎn)。

在這項(xiàng)研究中，將差異表達(dá)基因和加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合起來，以提高識(shí)別HCC相關(guān)基因的能力。差異基因功能富集顯示，主要參與細(xì)胞周期調(diào)控的基因在HCC組織中失調(diào)，與近些年相關(guān)研究結(jié)果一致［20］。正常細(xì)胞周期的紊亂是導(dǎo)致癌癥的原因之一，靶向調(diào)節(jié)癌細(xì)胞周期是一種潛在的治療方法［21］。生物信息學(xué)分析基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，分析在HCC中重要模塊和Hub基因，確定了兩個(gè)關(guān)鍵模塊，分別為青色模塊和紫色模塊。分析這兩個(gè)模塊基因與患者總生存期和無病生存期的相關(guān)性，選擇了青色模塊中顯著相關(guān)的前兩個(gè)基因VPS45和FAM189B，選擇了紫色模塊中顯著相關(guān)的前兩個(gè)基因CLEC1B和FCN3，這4個(gè)基因作為入選的Hub基因。

VPS45缺陷型中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表面的β1整合素水平降低，VPS45缺陷型成纖維細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力受損和細(xì)胞凋亡增加［22］。另外有研究顯示VPS45的表達(dá)水平和多種癌癥相關(guān)，比如YAMANOI等［23］研究表明VPS45表達(dá)水平和惡性腫瘤卵巢癌相關(guān)。FAM189B又稱為COTE1，通過機(jī)制分析表明，F(xiàn)AM189B可以與腫瘤抑制因子結(jié)構(gòu)域氧化還原酶發(fā)生物理關(guān)聯(lián)，F(xiàn)AM189B與HCC細(xì)胞的侵襲密切相關(guān)［24］；FAM189B蛋白和mRNA的過表達(dá)可能會(huì)增加胃癌的發(fā)生率，并且細(xì)胞周期的通路是其KEGG富集分析最具有顯著差異的通路［25］。CLEC1B是C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族1成員，并且其與肝細(xì)胞癌的免疫浸潤(rùn)相關(guān)，過表達(dá)的CLEC1B抑制HuH7細(xì)胞的增殖和遷移能力［26］。FCN3是一種分泌型凝集素，能夠激活補(bǔ)體通路，F(xiàn)CN3的異位表達(dá)能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未折疊蛋白，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可提高肺腺癌細(xì)胞的存活率，F(xiàn)CN通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮抑癌作用［27］。本研究方法具有數(shù)據(jù)挖掘的局限性，研究所用數(shù)據(jù)來源于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)樣本可能存在偏倚，測(cè)序結(jié)果在技術(shù)上可能存在偏差，為了提高WGCNA結(jié)果的可靠性，使用人類蛋白質(zhì)圖譜的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行確認(rèn)，然而由于數(shù)據(jù)庫(kù)的限制，無法獲得每個(gè)基因的腫瘤和鄰近正常樣本的所有相關(guān)IHC數(shù)據(jù)。獲得的Hub基因在肝癌預(yù)后中的分子調(diào)節(jié)機(jī)制還需要進(jìn)一步通過臨床數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)，其可能作為肝癌早期篩查分子標(biāo)志物、預(yù)后分子標(biāo)志物及肝癌治療靶點(diǎn)，為人群篩查或肝癌患者治療提供幫助。

總之，本研究進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，以確定HCC和正常肝臟組織之間的潛在生物預(yù)測(cè)標(biāo)志物，本研究結(jié)果表明，VPS45、FAM189B、CLEC1B和FCN3可能是HCC的新型潛在生物標(biāo)志物，具有特殊臨床意義，然而需要在大量臨床樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)：陳超提出研究目標(biāo)，負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析和寫作；陳天翔負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)驗(yàn)證；劉錢偉、張秩、王歡歡、吳平平和高磊負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)整理；于照祥負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制與審查，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

參考文獻(xiàn)

SUNG H，F(xiàn)ERLAY J，SIEGEL R L，et al. Global cancer statistics 2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries［J］. CA Cancer J Clin，2021，

71（3）：209-249. DOI：10.3322/caac.21660.

MEHTA A，HERRERA H，BLOCK T. Glycosylation and liver cancer［J］. Adv Cancer Res，2015，126：257-279. DOI：10.1016/bs.acr.2014.11.005.

VOGEL A，MEYER T，SAPISOCHIN G，et al. Hepatocellular carcinoma［J］. Lancet，2022，400（10360）：1345-1362. DOI：10.1016/s0140-6736（22）01200-4.

Cancer Genome Atlas Research Network Electronic Address. Comprehensive and integrative genomic characterization of hepatocellular carcinoma［J］. Cell，2017，169（7）：1327-1341.e23. DOI：10.1016/j.cell.2017.05.046.

LLOVET J M，REAL M I，MONTA?A X，et al. Arterial embolisation or chemoembolisation versus symptomatic treatment in patients with unresectable hepatocellular carcinoma：a randomised controlled trial［J］. Lancet，2002，359（9319）：1734-1739. DOI：10.1016/S0140-6736（02）08649-X.

SIEGEL R L，MILLER K D，JEMAL A. Cancer statistics，2017［J］. CA Cancer J Clin，2017，67（1）：7-30.

XIA F，WU L L，LAU W Y，et al. Adjuvant sorafenib after heptectomy for Barcelona clinic liver cancer-stage C hepatocellular carcinoma patients［J］. World J Gastroenterol，2016，22（23）：5384-5392. DOI：10.3748/wjg.v22.i23.5384.

LI N，ZHAN X Q. Identification of clinical trait-related lncRNA and mRNA biomarkers with weighted gene co-expression network analysis as useful tool for personalized medicine in ovarian cancer［J］. EPMA J，2019，10（3）：273-290. DOI：10.1007/s13167-019-00175-0.

KUENZI B M，IDEKER T. A census of pathway maps in cancer systems biology［J］. Nat Rev Cancer，2020，20（4）：233-246.

LANGFELDER P，HORVATH S. WGCNA：an R package for weighted correlation network analysis［J］. BMC Bioinformatics，2008，9：559. DOI：10.1186/1471-2105-9-559.

YUAN L S，CHEN L，QIAN K Y，et al. Co-expression network analysis identified six hub genes in association with progression and prognosis in human clear cell renal cell carcinoma （ccRCC）［J］. Genom Data，2017，14：132-140. DOI：10.1016/j.gdata.

2017.10.006.

XIA W X，YU Q，LI G H，et al. Identification of four hub genes associated with adrenocortical carcinoma progression by WGCNA［J］. PeerJ，2019，7：e6555.

COLAPRICO A，SILVA T C，OLSEN C，et al. TCGAbiolinks：an R/Bioconductor package for integrative analysis of TCGA data［J］. Nucleic Acids Res，2016，44（8）：e71.

RITCHIE M E，PHIPSON B，WU D，et al. Limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies［J］. Nucleic Acids Res，2015，43（7）：e47.

DI Y，CHEN D S，YU W，et al. Bladder cancer stage-associated hub genes revealed by WGCNA co-expression network analysis［J］. Hereditas，2019，156：7. DOI：10.1186/s41065-019-0083-y.

TANG J N，KONG D G，CUI Q X，et al. Prognostic genes of breast cancer identified by gene co-expression network analysis［J］. Front Oncol，2018，8：374. DOI：10.3389/fonc.2018.00374.

KARLSSON M，ZHANG C，MéAR L，et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues［J］. Sci Adv，2021，7（31）：eabh2169. DOI：10.1126/sciadv.abh2169.

CHEN T X，LIU R K，NIU Y S，et al. HIF-1α-activated long non-coding RNA KDM4A-AS1 promotes hepatocellular carcinoma progression via the miR-411-5p/KPNA2/AKT pathway［J］. Cell Death Dis，2021，12（12）：1152.

LV Y M，XIE B B，BAI B J，et al. Weighted gene coexpression analysis indicates that PLAGL2 and POFUT1 are related to the differential features of proximal and distal colorectal cancer［J］. Oncol Rep，2019，42（6）：2473-2485.

SCHAFER K. The cell cycle：a review［J］. Vet Pathol，1998，35：461-478. DOI：10.1177/030098589803500601.

AARTS M，LINARDOPOULOS S，TURNER N C. Tumour selective targeting of cell cycle kinases for cancer treatment［J］. Curr Opin Pharmacol，2013，13（4）：529-535. DOI：10.1016/j.coph.2013.03.012.

VILBOUX T，LEV A，MALICDAN M C V，et al. A congenital neutrophil defect syndrome associated with mutations in VPS45［J］. N Engl J Med，2013，369（1）：54-65.

YAMANOI K，BABA T，ABIKO K，et al. Acquisition of a side population fraction augments malignant phenotype in ovarian cancer［J］. Sci Rep，2019，9（1）：14215. DOI：10.1038/s41598-019-50794-w.

ZHANG H，HUANG C J，TIAN Y，et al. Ectopic overexpression of COTE1 promotes cellular invasion of hepatocellular carcinoma［J］. Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（11）：5799-5804. DOI：10.7314/apjcp.2012.13.11.5799.

WU C L，TAN Q X，LIU D，et al. High FAM189B expression and its prognostic value in patients with gastric cancer［J］. Biomed Res Int，2021，2021：8875971. DOI：10.1155/2021/8875971.

ZHANG G H，SU L S，LV X P，et al. A novel tumor doubling time-related immune gene signature for prognosis prediction in hepatocellular carcinoma［J］. Cancer Cell Int，2021，21（1）：522. DOI：10.1186/s12935-021-02227-w.

JANG H，JUN Y，KIM S，et al. FCN3 functions as a tumor suppressor of lung adenocarcinoma through induction of endoplasmic reticulum stress［J］. Cell Death Dis，2021，12（4）：407.

（收稿日期：2023-03-17；修回日期：2023-08-18）

（本文編輯：賈萌萌）

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳面上項(xiàng)目（2021JM-503）

引用本文：陳超，陳天翔，劉錢偉，等. 基于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和癌癥基因組圖譜臨床數(shù)據(jù)分析并鑒定肝細(xì)胞癌的Hub基因研究［J］. 中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2024，27（32）：4050-4059. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0243. ［www.chinagp.net］

CHEN C，CHEN T X，LIU Q W，et al. Analysis and identification of Hub genes in hepatocellular carcinoma based on weighted gene co-expression network and cancer genome atlas clinical data［J］. Chinese General Practice，2024，27（32）：4050-4059.

? Editorial Office of Chinese General Practice. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 license.