摘要： 【目的】優(yōu)化超聲輔助低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs） 同時提取腎茶黃酮和多酚的工藝，評價提取物的抗氧化活性。【方法】從6 種不同組分的DESs 中篩選出黃酮和多酚得率最高的組分，再采用單因素試驗和響應(yīng)面Box-Behnken 設(shè)計試驗優(yōu)化超聲輔助DESs 提取腎茶黃酮和多酚的工藝，并測定腎茶DESs 提取物的DPPH·清除能力、ABTS+清除能力和還原能力。【結(jié)果】單因素試驗結(jié)果表明：n氯化膽堿∶n乙二醇為1∶5、含水量30%、料液比為1∶20 （g∶mL）、提取溫度為70 ℃、提取時間為40 min 是提取腎茶黃酮和多酚的最佳條件。響應(yīng)面Box-Behnken 設(shè)計表明： n氯化膽堿∶n乙二醇為1∶5、含水量30%、料液比為1∶21（g∶mL）、提取溫度為67 ℃、提取時間為42 min 時，腎茶黃酮得率為140.87 mg/g，多酚得率為63.58 mg/g，均顯著高于50% 乙醇提取的得率。腎茶DESs 提取物清除DPPH·、ABTS+能力和還原能力均高于50% 乙醇提取物?！窘Y(jié)論】DESs 可作為一種新型的溶劑，綠色、高效地同時提取腎茶中的黃酮和多酚，為腎茶的深度開發(fā)提供基礎(chǔ)技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞： 低共熔溶劑；腎茶；黃酮；多酚；抗氧化活性

中圖分類號： S567.239.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 03?0099?08

腎茶在中國已有2 000 多年的應(yīng)用歷史。腎茶[Clerodendranthus spicatus （Thunb.） C. Y. Wu]又名貓須草，傣名“雅糯秒”，全草入藥，傣族醫(yī)書《貝葉經(jīng)》和《檔哈雅》均有記載，具有清火解毒、利尿排石、涼血止血的功效，是傳統(tǒng)傣醫(yī)用于預(yù)防和治療腎、膀胱、尿道等泌尿系統(tǒng)疾病的首選藥材[1]。腎茶深受傣族民眾喜愛，常用其葉作為茶葉和藥用，在中國主要分布于云南、海南、廣西、廣東、福建、臺灣等地，以云南普洱和西雙版納地區(qū)栽培最多[2]。腎茶含有黃酮類、多酚類、二萜類、三萜類等化合物，主要活性成分是黃酮類[3]和多酚類[4]，具有抗氧化、抗炎、抗癌、利尿、神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[2， 5-6]。

目前，通常采用有機(jī)溶劑提取腎茶中的活性成分[7-10]。近年來，綠色溶劑的開發(fā)促進(jìn)了現(xiàn)代綠色化學(xué)的發(fā)展，其通過取代揮發(fā)性溶劑達(dá)到高利用率及低毒性的效果[11]。低共熔溶劑（deep eutecticsolvents，DESs） 是由一定化學(xué)計量比的固體鹵化物鹽的氫鍵受體 （如季銨鹽） 和氫鍵供體 （如酰胺、羧酸、多元醇、糖等化合物） 組合而成的2 組分或3 組分低共熔混合物，其熔點顯著低于各個組分純物質(zhì)的熔點[12]。DESs 可完全生物降解且具有良好的生物相容性[13-14]，其結(jié)合了離子液體的特點，具有生產(chǎn)廉價、無毒、制備工藝較簡單、提取程度高等優(yōu)勢，自首次報道[12]以來，以氯化膽堿為基礎(chǔ)的DESs 成功地從金銀花[15]、草果[16]、山楂[17]、玫瑰[18]、桑葉[19]、紅棗[20]、葛根[21]、黃精[22]、麥冬[23]、覆盆子[24]、枇杷葉[25]、黃芩[26]等藥材中提取到活性成分，且該方法比傳統(tǒng)方法更高效。本研究以DESs 為提取溶劑，采用單因素結(jié)合響應(yīng)曲面設(shè)計—中心組合設(shè)計的方法，確定腎茶黃酮類和多酚類成分的最佳提取工藝，以期為腎茶的深度開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

腎茶藥材購于云南省昆明市新螺螄灣藥材市場，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室李學(xué)芳正高級工程師鑒定為腎茶的干燥全草。

1.2 儀器與試劑

754 型紫外可見光分光光度計（上海元析儀器有限公司）；超聲波清洗機(jī)SB-5200DT （寧波新生物科技股份有限公司）；BT125D 雙量程電子分析天平（德國多利斯公司）；TGL-16.5 M 臺式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；600 T 多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；RTC-2（加熱型） 磁力攪拌器[ 大龍新創(chuàng)實驗儀器（北京） 股份公司 ]；DRRH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷儀器設(shè)備有限公司）。

蘆丁對照品（批號DL001701，純度≥99%） 和沒食子酸對照品（批號DM000801，純度≥98%），購于森嵐科技有限公司；氯化膽堿和DL-乳酸均為分析純，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二醇、1，2-丙二醇、丙三醇和尿素均為分析純，購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；1，4-丁二醇、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇和甲醇均為分析純，購于利安隆博華（天津） 醫(yī)藥化學(xué)有限公司；亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉和十水合碳酸鈉均為分析純，購于四川西隴科學(xué)有限公司；福林酚試劑、DPPH·試劑、ABTS+試劑和抗壞血酸均為優(yōu)級純，購于上海源葉生物科技有限公司；純凈水由 Milli-Q 純水制備系統(tǒng)制備。

1.3 試驗方法

1.3.1 DESs 的制備

不同種類DESs 對活性成分提取效果不同。為篩選不同的DESs，參考文獻(xiàn)[27-28] 的方法，以氯化膽堿為氫鍵受體與不同種的氫鍵供體按照物質(zhì)的量比為1∶2 混合，80 ℃ 水浴加熱攪拌至形成澄清均勻的液體，制得DESs （表1）。

1.3.2 腎茶活性成分的提取

腎茶藥材去除雜質(zhì)后50 ℃ 減壓干燥24 h，粉碎過 65 目篩，即為腎茶粉末。取腎茶粉末2.0 g置于具塞錐形瓶中，加入一定體積的不同DESs混合均勻；充分浸泡后，在一定溫度下超聲（功率250 W，頻率40 kHz） 提取，溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，8 000 r/min 離心20 min，取上清液，備用。

1.3.3 腎茶黃酮得率的測算

黃酮含量的測定采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法。吸取提取液0.5 mL，加入60% 乙醇2.0 mL 稀釋混勻，準(zhǔn)確移取0.2 mL，加入5% 亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，室溫反應(yīng)6 min；加入10% 硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，溶液絡(luò)合6 min；再加入4% 氫氧化鈉溶液4.0 mL，搖勻，顯色15 min，在波長510 nm 處測定吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測得質(zhì)量濃度為0.059 8～0.598 0 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度（A1），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線A1=0.460 3ρ1+0.011 5 （R2=0.999 2），其中，ρ1 為蘆丁質(zhì)量濃度。將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得對應(yīng)的黃酮質(zhì)量濃度（ρ），再按照公式計算腎茶黃酮得率：

得率=ρ×V×N／m。

式中：V 為提取液體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；m為樣品干質(zhì)量，g。

1.3.4 腎茶多酚得率的測算

多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu 比色法[4]。吸取提取液0.2 mL 置于50 mL 棕色容量瓶中，用純水稀釋至刻度，搖勻，即為供試溶液。吸取供試溶液0.5 mL，加入10% 福林酚試劑2.5 mL，搖勻，室溫靜置8 min；加入7.5% 碳酸鈉溶液2.0 mL，搖勻，30 ℃ 水浴避光反應(yīng)60 min，在波長765 nm 處測定吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測得質(zhì)量濃度為0.000 6～0.030 0 mg/mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度（A2），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線A2=11.508 0ρ2+0.056 2 （R2=0.999 1），其中，ρ2 為沒食子酸質(zhì)量濃度。將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得對應(yīng)的多酚質(zhì)量濃度（ρ），再計算腎茶多酚得率。計算公式同1.3.3 節(jié)。

1.3.5 超聲輔助DESs 提取腎茶活性成分的單因素優(yōu)化試驗

單因素考察提取工藝對腎茶黃酮和多酚得率的影響，包括提取溶劑（6 種不同類型DESs）、DES 物質(zhì)的量比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）、DES 含水量（0%、10%、20%、30%、40%、50%）、料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 （g∶mL）]、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、提取時間（10、20、30、40、50 min）?？疾焯崛∪軇r，其他參數(shù)固定為：n氫鍵受體∶n氫鍵供體為1 ∶ 2， DESs 含水量10%， 料液比為1 ∶ 15（g∶mL），提取溫度為50 ℃，提取時間為20 min；考察DES 物質(zhì)的量比時，提取溶劑選用最佳提取溶劑，其他參數(shù)不變[DES 含水量10%，料液比為1∶15 （g∶mL），提取溫度為50 ℃，提取時間為20 min]；考察DES 含水量時，提取溶劑和物質(zhì)的量比選用最佳參數(shù)，其他參數(shù)不變[ 料液比為1∶15 （g∶mL），提取溫度為50 ℃，提取時間為20 min]；以此類推。

1.3.6 超聲輔助DESs 提取腎茶活性成分的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇3 因素3 水平的響應(yīng)曲面設(shè)計—中心組合設(shè)計（Box-Behnken 設(shè)計） 試驗優(yōu)化提取條件，以黃酮得率、多酚得率為響應(yīng)值，運用Design-Expert 8.0.6 軟件中的Box-Behnken 模式，選取料液比（X1）、提取溫度（X2）和提取時間（X3） 因素中影響最大的3 水平（表2），優(yōu)化腎茶活性成分的提取工藝。

1.3.7 不同溶劑腎茶活性成分提取效果對比

在響應(yīng)面設(shè)計的最佳提取條件下，分別用50% 乙醇[4， 7]和DES 提取腎茶黃酮和多酚，計算得率。

1.3.8 抗氧化活性評價

取不同溶劑提取的腎茶提取液，經(jīng)大孔吸附樹脂吸附→80% 乙醇解吸附→減壓濃縮→冷凍干燥，得到腎茶提取物凍干粉，制成1.0～1.5 mg/mL樣品溶液，進(jìn)行抗氧化活性評價，并與相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸溶液作比較。DPPH·清除能力參考李曉花等[4]的方法測定，ABTS+清除能力參考蘇德禹等[3]的方法測定，還原能力參考蔡旋等[29]的方法測定，且均有改進(jìn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

響應(yīng)曲面模型的回歸方程式和顯著性統(tǒng)計采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行計算和分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行方差分析。所有試驗均平行重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 DES 的篩選

由圖1 可知：6 種DESs 中，DES-2 的提取效果最好，黃酮得率為（83.52±2.50） mg/g，多酚得率為（32.49±0.84） mg/g，均顯著高于其他DESs 的提取效果。因此，確定DES-2 （氯化膽堿—乙二醇） 為最佳提取溶劑。

2.1.2 物質(zhì)的量比

由圖2 可知：隨著乙二醇比例的增大，黃酮和多酚的提取效果均呈先升高后降低的變化趨勢。當(dāng)n氯化膽堿∶n乙二醇=1∶5 時，提取效果最佳，黃酮得率為（93.54±3.71） mg/g，多酚得率為（36.59±1.83） mg/g。因此，選擇氯化膽堿和乙二醇最佳物質(zhì)的量比為1∶5。

2.1.3 含水量

隨著DESs 體系中含水量的增加，黃酮和多酚得率均呈先升高后降低的變化（圖3）。當(dāng)含水量為30% 時，提取效果最佳，黃酮得率為（109.84±3.27） mg/g，多酚得率為（36.59±1.76） mg/g。因此，選擇30% 為最適含水量。

2.1.4 料液比

料液比（g∶mL） 從1∶5 到1∶20 的過程中，腎茶黃酮和多酚的得率逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶20 時，黃酮得率為（119.97±3.54） mg/g，多酚得率為（46.34±2.31） mg/g，提取效果最佳（圖4）。因此，選擇1∶20 為最佳料液比。

2.1.5 提取溫度

由圖5 可知：提取溫度從40 ℃ 升至70 ℃的過程中，腎茶黃酮和多酚的得率逐漸增加；當(dāng)提取溫度為70 ℃ 時，得率達(dá)到最大值，黃酮為（130.54±3.92） mg/g，多酚為（54.36±2.17） mg/g；隨著提取溫度繼續(xù)增加，提取效果呈下降趨勢。因此，選擇70 ℃ 為最佳提取溫度。

2.1.6 提取時間

提取時間從10 min 到40 min 的過程中，腎茶黃酮和多酚的得率逐漸增加；當(dāng)提取時間為40 min 時，黃酮得率為（141.26±4.38） mg/g，多酚得率為（62.53±2.83） mg/g，提取效果最佳；隨著提取時間繼續(xù)增加，提取效果呈下降趨勢（圖6）。因此，選擇40 min 為最佳提取時間。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 統(tǒng)計分析和模型擬合

Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果見表2，經(jīng)Design-Expert 8.0.6 軟件擬合，得到各因素（X1：料液比，X2：提取溫度，X3：提取時間） 對黃酮得率（Y1） 和多酚得率（Y2） 的回歸方程分別為：Y1=140.78+1.81X1+1.49X2+1.40X3+1.30X1X2+1.69X1X3+1.44X2X3?6.11X12?3.97X22?3.64X32；Y2=63.86+1.61X1+1.35X2+1.16X3+0.90X1X2+1.49X1X3+0.93X2X3?8.53X12?5.50X22?9.48X32。

方差分析結(jié)果（表3） 顯示：2 個數(shù)據(jù)模型的Plt;0.000 1，表明模型具有極顯著性；失擬項Pgt;0.05，差異不顯著，表示模型的擬合良好，試驗誤差小。模型決定系數(shù)R2pred和調(diào)整系數(shù)R2adj均接近于1， 二者差異在合理范圍內(nèi)（｜R2adj-R2pred｜＜0.2），說明該模型具有較好的回歸性。工藝參數(shù)對腎茶黃酮和多酚得率的影響強(qiáng)弱（F 值的大小）為：料液比（X1）gt;提取溫度（X2）gt;提取時間（X3）。

2.2.2 驗證試驗

根據(jù)擬合方程和方差分析結(jié)果，腎茶黃酮和多酚的最佳提取條件為：料液比1∶20.64 （g∶mL）、提取溫度67.08 ℃、提取時間41.68 min，預(yù)測黃酮得率為141.39 mg/g，多酚得率為64.09 mg/g。為方便試驗操作，將提取參數(shù)調(diào)整為料液比1∶21 （g∶mL）、提取溫度67 ℃、提取時間42 min，進(jìn)行3 次平行驗證試驗，腎茶黃酮得率為140.87mg/g，多酚得率為63.58 mg/g，均與預(yù)測結(jié)果相近（Pgt;0.05），表明模型預(yù)測良好，可用于腎茶黃酮和多酚的同時提取。

2.3 不同溶劑對腎茶黃酮和多酚的提取效果

由圖7 可知：DES 對腎茶黃酮和多酚的提取效果顯著高于50% 乙醇。

2.4 腎茶提取物的抗氧化活性

由圖8 可知：不同溶劑得到的腎茶提取物均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，且活性隨著提取物質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。DES 提取物對DPPH·和ABTS+的清除率均優(yōu)于抗壞血酸和50% 乙醇提取物；DES 提取物的還原能力與抗壞血酸相當(dāng)，優(yōu)于50% 乙醇提取物。其中，DES 提取物和50%乙醇提取物清除DPPH·的IC50 分別為4.72 和6.14 μg/mL，清除ABTS+的IC50 分別為41.97 和62.93 μg/mL，還原能力的斜率分別為0.056 1 和0.051 8。

3 討論

傳統(tǒng)有機(jī)溶劑較難實現(xiàn)極性差異較大化學(xué)成分的同時提取，而DESs 具有良好的生物相容性和結(jié)構(gòu)可設(shè)計性，能夠應(yīng)用于極性差異較大的多種成分的高效提取，并已在多個品種上實現(xiàn)了不同成分的同時提取[27， 30-31]。DESs 的組分一般來源于植物的初級代謝產(chǎn)物，無毒無害，同時，DESs不易揮發(fā)、蒸氣壓小、不可燃、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性好，與傳統(tǒng)提取溶劑相比，其提取更加高效，已在多個品種上得到驗證[32-36]。腎茶主要活性成分為黃酮類和多酚類，本研究利用DESs 同時提取黃酮類和多酚類成分，與已報道的常規(guī)溶劑[9-10]相比，DESs 提取效率更加高效，能為其他民族藥多種活性成分的高效提取提供借鑒。

DESs 由氫鍵受體和氫鍵供體組合而成，氫鍵受體和氫鍵供體的種類較多，可選擇性較強(qiáng)，能形成多種不同類型溶劑，可根據(jù)試驗材料選擇適宜的類型和比例。在氯化膽堿—乙二醇的物質(zhì)的量比單因素試驗中，隨著乙二醇比例的增加，提取率先升高后降低，可能是乙二醇比例增加引入更多氫鍵形成更完善的溶劑體系，促進(jìn)黃酮和多酚的溶出，從而改善提取效果；但乙二醇比例過大，過多的氫鍵是否會破壞溶劑體系分子間的作用力，從而影響提取效果，還需進(jìn)一步試驗驗證。DESs 的黏度較大，流動性不強(qiáng)，在提取后的固液分離時操作難度較大，故在溶劑制備過程中需加入水。DESs 由氫鍵維持其性能，水的加入引入了較強(qiáng)的氫鍵，如何影響DESs 體系進(jìn)而影響提取效果，還有待進(jìn)一步研究。腎茶DESs提取物的含量和體外抗氧化活性明顯優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑，提取物的多種生理活性是否強(qiáng)于傳統(tǒng)溶劑以及是否具有明顯毒性，是下一步研究的重點。

因DESs 不易揮發(fā)，熱濃縮并不適用于DESs提取物，提取物的純化和富集常采用大孔樹脂吸附技術(shù)，因此，DESs 的回收再利用效能可能不如常規(guī)溶劑。在提取和純化過程中不可避免地會混入難以去除的雜質(zhì)，或顯著改變其含水量，從而影響提取效果[37]?？梢?，循環(huán)利用可能是制約生產(chǎn)的主要瓶頸之一。

4 結(jié)論

本研究以DESs 為提取溶劑，采用單因素結(jié)合響應(yīng)曲面設(shè)計—中心組合設(shè)計的方法，確定腎茶黃酮類和多酚類成分的最佳提取工藝為：n氯化膽堿∶n乙二醇=1∶5，含水量30%，料液比為1∶21 （g∶mL），提取溫度為67 ℃，提取時間為42 min。與傳統(tǒng)溶劑相比，DESs 的提取效能更佳，提取物的抗氧化活性更好。DESs 可作為一種新型的溶劑，綠色、高效地同時提取腎茶中的黃酮和多酚，為腎茶后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：何謦成

基金項目：云南省教育廳研究基金項目（2021J0403） ；云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院團(tuán)隊建設(shè)項目；云南省科技人才和平臺計劃（202105AG070012）；云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才項目（202205AC160038）；云南省科學(xué)技術(shù)院重大科技專項 （202002AA00007）；云南省科技廳基礎(chǔ)研究計劃中醫(yī)聯(lián)合專項重點項目（202001AZ070001-011）。