收稿日期：2023-02-20

作者簡(jiǎn)介：何俊峰（1996-），男，湖北洪湖人，碩士，主要從事微生物工程研究，（電話）15072373501（電子信箱）739896929@qq.com；通信作者，王 志（1971-），男，河南駐馬店人，教授，博士，主要從事代謝工程研究，（電話）18986282836（電子信箱）wangzhi@hbut.edu.cn。

何俊峰，魯佳康，陳 雄，等. 凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵優(yōu)化工藝［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（7）：147-153．

摘要：為提高凝結(jié)芽胞桿菌（Bacillus coagulans）的生長(zhǎng)效率，在搖瓶、發(fā)酵罐水平考察了最適的碳源、溫度、維生素添加量、pH以及發(fā)酵過程存在的氧化脅迫對(duì)凝結(jié)芽胞桿菌生長(zhǎng)代謝的影響，獲得了發(fā)酵培養(yǎng)基配方，并確定了30 L發(fā)酵罐最適培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為40 ℃，初始pH為6.2～6.5，培養(yǎng)過程中9～14 h用氨水溶液控pH=5.5，pH大于5.5后停止控制，全程以4.1 mg/（L·h）速率流加半胱氨酸。優(yōu)化條件下，發(fā)酵13 h細(xì)胞生物量達(dá)1.9×1010 CFU/mL，較對(duì)照提高363.4%，細(xì)胞生長(zhǎng)效率為1.5×109 CFU/（mL·h），較對(duì)照提高305.4%。顯著提高了生物量、縮短了發(fā)酵周期，為凝結(jié)芽胞桿菌工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要參考。

關(guān)鍵詞：凝結(jié)芽胞桿菌（Bacillus coagulans）；分批發(fā)酵；培養(yǎng)條件；氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào)：TQ927 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）07-0147-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.07.024 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimizations of fermentation of Bacillus coagulans

HE Jun-feng， LU Jia-kang， CHEN Xiong， WANG Zhi

（School of Biological Engineering and Food/Key Laboratory of Fermentation Engineering （Ministry of Education）， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract：In order to improve the growth efficiency of Bacillus coagulans， the effects of the appropriate carbon source， temperature， vitamin content， pH and oxidation stress in fermentation process on the growth and metabolism of Bacillus coagulans were investigated at the shaking flask and bioreactor level， and the fermentation medium was obtained. The optimum culture conditions in 30 L bioreactor were as follows： fermentation temperature was at 40 ℃， initial pH was 6.2～6.5， pH was controlled at 5.5 via the automatic addition of ammonia solution at 9～14 h during the culture process， control was stopped after pH above 5.5， and cysteine was added at a rate of 4.1 mg/（L·h） during the whole process. Under these conditions， the fermentation biomass reached 1.9×1010 CFU/mL at 13 h， which was 363.4% higher than that of the control， and the cell growth efficiency was 1.5×109 CFU/（mL·h）， which was 305.4% higher than that of the control. It significantly increased the biomass and shortened the fermentation period， which provided an important reference for the industrial production of Bacillus coagulans.

Key words：Bacillus coagulans； batch fermentation； culture condition； oxidative stress

凝結(jié)芽胞桿菌（Bacillus coagulans）作為一種益生菌［1］能有效緩解畜禽等宿主腸道的氧化應(yīng)激［2］、水解多種碳源產(chǎn)生高純度的L-乳酸［3］、合成凝固素進(jìn)而抑制多種病原微生物的生長(zhǎng)，從而增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫能力，提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用率，提升動(dòng)物機(jī)體的生產(chǎn)性能［1］。因此其被歐洲食品與飼料菌種協(xié)會(huì)、美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局和國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)認(rèn)定為安全菌種［4］，并列入中國(guó)《可用于食品的菌種名單》《飼料添加劑品種目錄》中。

凝結(jié)芽胞桿菌是革蘭氏陽性菌，其過氧化氫酶陽性，形成芽胞，可以完全利用葡萄糖、木糖、海藻糖，不能直接利用纖維素、木質(zhì)素［2，5］。Reyes-Mendez等［6］在35 ℃、pH10條件下培養(yǎng)凝結(jié)芽胞桿菌GBI-30，發(fā)酵72 h對(duì)大豆蛋白胨的水解程度只有27%，說明其蛋白胨水解體系較弱。另外，凝結(jié)芽胞桿菌2-6不能合成生物素與硫胺素，且丙酮酸羧化酶的基因缺失［7］。細(xì)胞缺乏生物素會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)脂肪酸代謝［8］，缺乏硫胺素會(huì)抑制丙酮酸脫氫酶的活性［9］，因而其微氧/厭氧發(fā)酵會(huì)生成大量乳酸、乙酸及一些三羧酸循環(huán)（TCA）中間體［10］。細(xì)菌發(fā)酵過程有機(jī)酸的積累會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、降低發(fā)酵液的pH、抑制關(guān)鍵酶活性、破壞細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的穩(wěn)定性［11］，引起酸脅迫效應(yīng)。同時(shí)，酸脅迫過程細(xì)菌代謝也伴隨著活性氧（如·OH、O2-及H2O2）的產(chǎn)生和積累［12］，并對(duì)細(xì)胞造成氧化脅迫，甚至導(dǎo)致細(xì)胞自溶。而控制pH發(fā)酵乳酸菌可有效緩解酸脅迫［13］。另外，半胱氨酸不僅能直接還原H2O2［14］，還可以被芽胞桿菌用于合成芽胞桿菌硫醇（BSH）清除細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷［15］。但是，目前關(guān)于通過發(fā)酵優(yōu)化緩解凝結(jié)芽胞桿菌氧化脅迫的研究尚未見報(bào)道。

為提高凝結(jié)芽胞桿菌高密度發(fā)酵效率，本研究從溫度、碳源、維生素、半胱氨酸及pH多角度優(yōu)化發(fā)酵工藝，有效緩解了氧化脅迫對(duì)生長(zhǎng)效率的影響，確定了凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵新型培養(yǎng)工藝，為凝結(jié)芽胞桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 凝結(jié)芽胞桿菌HB為發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 蛋白胨FP410、酵母浸粉FM888，安琪酵母股份有限公司；一水合葡萄糖，山東西王糖業(yè)有限公司；蔗糖、乳糖、三水乙酸鈉、甘油、K2HPO4·3H2O、NaCl、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3、瓊脂粉、氨水，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生物素、硫胺素、L-半胱氨酸，上海麥克林生化科技股份有限公司；玉米淀粉，福建浦城綠康生化有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LB-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；7890B型氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；DELTA320型pH計(jì)，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；SPX-150D型恒溫生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；V-1300型可見分光光度計(jì)，上海美析儀器有限公司；30 L發(fā)酵罐，上海保興生物工程設(shè)備工程有限公司；HNV-211B型恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；S-10型生物傳感器分析儀，深圳市西爾曼科技有限公司；CJ-2D型無菌操作臺(tái)，天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨50 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、MnSO4·H2O 0.3 g/L、CaCO3 6 g/L、K2HPO4·3H2O 3 g/L，調(diào)節(jié)pH至6.2～6.5。

碳源優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源20 g/L、蛋白胨50 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、 MnSO4·H2O 0.3 g/L、CaCO3 6 g/L、K2HPO4·3H2O 3 g/L，調(diào)節(jié)pH至6.2～6.5。

MRS固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母粉5 g/L、三水乙酸鈉2 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、MnSO4·H2O 0.03 g/L、CaCO3 6 g/L、吐溫-80 0.1 g/L、瓊脂粉 2 g/L，調(diào)節(jié)pH至6.2～6.5。

上述培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min。其中硫胺素、生物素與L-半胱氨酸溶液用0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.3.2 菌種活化與培養(yǎng) 將-80 ℃冰箱保藏的HB菌株甘油管接種于MRS固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行第一次活化，37 ℃培養(yǎng)40～48 h，得到一級(jí)種子；將一級(jí)種子轉(zhuǎn)接至MRS固體培養(yǎng)基茄子瓶斜面進(jìn)行第二次活化，37 ℃培養(yǎng)40～48 h后得到二級(jí)種子，加入60 mL無菌水后，用無菌竹簽將菌體刮下，與水混勻后制備成種子液待用。

1.3.3 生物素和硫胺素單因素優(yōu)化 按照“1.3.1”的方法配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別加入終濃度為0、10、20、30、40 μmol/L的硫胺素溶液。接入菌株后40 ℃、200 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期，平板計(jì)數(shù)法［16］測(cè)定活細(xì)胞數(shù)。

按照“1.3.1”的方法配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別加入終濃度為0、5、10、15、20 μmol/L的生物素溶液。接入菌株后40 ℃、200 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活細(xì)胞數(shù)。

按照“1.3.1”的方法配制發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)加入硫胺素與生物素溶液，濃度為上述優(yōu)化后結(jié)果。接入菌株后40 ℃、200 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活細(xì)胞數(shù)。

1.3.4 不同碳源對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 按照“1.3.1”的方法加入“1.3.3”優(yōu)化后的維生素組分后，分別以0.6 mol/L的葡萄糖、蔗糖、乳糖、乙酸鈉、甘油、玉米淀粉為碳源配制碳源優(yōu)化培養(yǎng)基。接種后40 ℃、200 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 發(fā)酵溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 按照“1.3.1”的方法配制發(fā)酵培養(yǎng)基，加入“1.3.3”優(yōu)化后的維生素。接入菌株后分別在32、37、40、42、45 ℃，200 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 30 L發(fā)酵罐培養(yǎng)驗(yàn)證 在30 L發(fā)酵罐上按裝液量60%進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液體積為18 L。

滅菌條件：溫度120～123 ℃，壓力0.10～0.12 MPa，保壓時(shí)間30 min。

發(fā)酵條件：溫度40 ℃，通風(fēng)量恒定1.5 m3/h，轉(zhuǎn)速400 r/min，初始pH控制在6.0～6.5，罐壓0.03～0.05 MPa。

培養(yǎng)工藝按照表1進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)驗(yàn)證，每種工藝重復(fù)3次取平均值。

1.3.7 測(cè)定方法 葡萄糖濃度測(cè)定：DNS法［17］。

乳酸含量測(cè)定：生物傳感儀測(cè)定［18］。

過氧化氫含量測(cè)定：過氧化氫（H2O2）含量檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

發(fā)酵液有機(jī)酸含量測(cè)定：采用高效氣相色譜法測(cè)定。樣品處理：將發(fā)酵液上清液樣品用甲醇稀釋，12 000 r/min離心5 min。取上清液加入叔戊醇作為內(nèi)標(biāo)，甲酸酸化。用0.22 μm濾膜過濾后待用。升溫條件：柱溫40 ℃保留5 min，后以20 ℃/min升至120 ℃，再以10 ℃/min上升到220 ℃，保留3 min。分流比為10∶1，流速設(shè)定5 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃。檢測(cè)器：氫火焰離子檢測(cè)器；色譜柱型號(hào)：INNOWax（Agela，30 m×0.32 mm×0.25 μm）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3組平行試驗(yàn)均值，通過軟件Origin 9.0和SPSS 23.0進(jìn)行作圖以及數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫胺素、生物素對(duì)凝結(jié)芽胞桿菌生物量的影響

硫胺素是焦磷酸硫胺素（TPP）的前體，TPP是丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶的輔酶［9］。生物素是乙酰-CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酰-CoA羧化酶的輔酶［8］。姚婉婷等［9］發(fā)現(xiàn)外源添加硫胺素能緩解魯氏酵母的高滲脅迫，增加生物量。Satiaputra等［19］通過外源添加生物素，顯著縮短了金黃色葡萄球菌發(fā)酵周期。

雖然發(fā)酵體系中蛋白胨（50 g/L）和酵母粉（5 g/L）中含有多種維生素，但其含量及成分未知，且經(jīng)過高溫滅菌后，維生素會(huì)反應(yīng)失活。因而，考察了硫胺素、生物素對(duì)凝結(jié)芽胞桿菌生物量的影響。

由圖1a可知，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中外源添加硫胺素對(duì)HB菌株生長(zhǎng)有顯著影響。未添加硫胺素時(shí)，生物量為8.8×108 CFU/mL。當(dāng)添加量為20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞生物量最高，為3.8×109 CFU/mL，比對(duì)照提升331.8%。

由圖1b可知，當(dāng)生物素添加量為10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞生物量最高，為1.3×109 CFU/mL，較對(duì)照提升47.7%。

當(dāng)基料中同時(shí)添加20 μmol/L硫胺素與10 μmol/L生物素時(shí)，細(xì)胞生物量為4.1×109 CFU/mL，較對(duì)照提升365.9%。

2.2 碳源、溫度對(duì)凝結(jié)芽胞桿菌生物量的影響

孫研等［5］發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽胞桿菌對(duì)海藻糖等6種糖有不同的代謝能力，但部分碳源過于昂貴，不適合工業(yè)生產(chǎn)。因而考察了工業(yè)上常用的幾種碳源作為單一碳源培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以確定其最適碳源。結(jié)果如圖1c所示。以葡萄糖作為碳源時(shí)HB菌株的生物量顯著高于其他碳源。不同碳源對(duì)生物量影響表現(xiàn)為葡萄糖>蔗糖>玉米淀粉>乳糖>乙酸鈉>甘油>無碳源。

凝結(jié)芽胞桿菌被廣泛應(yīng)用于高溫發(fā)酵乳酸，但高溫對(duì)芽胞桿菌有很強(qiáng)的氧化作用［12］，不利于細(xì)胞增殖。因而探索了溫度對(duì)凝結(jié)芽胞桿菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖1d所示。HB菌株在40 ℃發(fā)酵時(shí)生物量最高，溫度過高或過低均不適合凝結(jié)芽胞桿菌HB的生長(zhǎng)。不同培養(yǎng)溫度對(duì)生物量影響表現(xiàn)為40 ℃>42 ℃>37 ℃>45 ℃>32 ℃。

2.3 單因素優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)單因素優(yōu)化，確定了凝結(jié)芽胞桿菌HB最適維生素組分、最適碳源、最適培養(yǎng)溫度。最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g/L、蛋白胨 50 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、MnSO4·H2O 0.3 g/L、輕質(zhì)CaCO3 6 g/L、K2HPO4·3H2O 3 g/L，生物素10 μmol/L，硫胺素20 μmol/L，初始pH為6.2～6.5，培養(yǎng)溫度為40 ℃。此條件下生物量為4.1×109 CFU/mL。

2.4 0#工藝HB菌株生長(zhǎng)情況

30 L發(fā)酵罐上采用“1.3.1”發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)凝結(jié)芽胞桿菌HB發(fā)酵培養(yǎng)，菌株生長(zhǎng)情況如圖2所示。9～11 h細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，11 h細(xì)胞生物量最高達(dá)4.1×109 CFU/mL，發(fā)酵效率為3.7×108 CFU/（mL·h）。此生物量短暫維持到12 h。12～15 h后細(xì)胞生物量迅速下降，15 h細(xì)胞生物量?jī)H2.0×109 CFU/mL。

0～12 h由于細(xì)胞的溢流代謝，發(fā)酵液pH迅速下降，pH由6.3下降至4.7。發(fā)酵液中有機(jī)酸主要為乙酸，且乳酸并未檢出。10～11 h發(fā)酵液中葡萄糖消耗速率為1.9 g/（L·h），乙酸生成速率為0.5 g/（L·h），細(xì)胞迅速增殖。而11～12 h發(fā)酵液葡萄糖消耗速率為7.0 g/（L·h），乙酸生成速率為0.8 g/（L·h），細(xì)胞生物量并未上升反而稍稍下降。12～15 h葡萄糖已完全耗盡。發(fā)酵液pH回升緩慢，乙酸并未利用。

0#工藝未添加外源維生素，基質(zhì)中維生素含量可能無法滿足HB菌株高密度生長(zhǎng)。硫胺素缺乏會(huì)影響丙酮酸脫氫酶的活性［9］，丙酮酸難以轉(zhuǎn)化成乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)，能量產(chǎn)生受阻，影響生物量增長(zhǎng)。另一方面凝結(jié)芽胞桿菌無丙酮酸羧化酶［7］，無法催化丙酮酸生成草酰乙酸。乙酸磷酸化生成乙酰磷酸，乙酰磷酸可以轉(zhuǎn)化為乙酰CoA進(jìn)入TCA循環(huán)。凝結(jié)芽胞桿菌中草酰乙酸回補(bǔ)可能不足，影響乙酰CoA合成檸檬酸的能力，造成了乙酸積累，故而發(fā)酵液pH回升緩慢。長(zhǎng)時(shí)間的低pH使細(xì)胞受到酸脅迫。細(xì)胞為維持中性環(huán)境需要ATP往胞外泵出質(zhì)子［20］，這大大增加細(xì)胞的能量消耗。故而葡萄糖耗盡后細(xì)胞迅速死亡。

2.5 1#工藝HB菌株生長(zhǎng)情況

1#工藝考察了外源添加“1.3.3”優(yōu)化后維生素對(duì)凝結(jié)芽胞桿菌HB生長(zhǎng)情況的影響，結(jié)果如圖3所示。

10～13 h細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，13 h細(xì)胞生物量最高達(dá)5.6×109 CFU/mL，相較于0#工藝生物量提高36.6%。發(fā)酵效率為4.3×108 CFU/（mL·h），較0#工藝提升16.2%。13～15 h細(xì)胞緩慢自溶，15 h細(xì)胞生物量為4.0×109 CFU/mL。

與0#工藝相似，0～13 h發(fā)酵液pH迅速下降，發(fā)酵液中有機(jī)酸主要為乙酸，無乳酸生成。13 h葡萄糖基本耗盡，發(fā)酵液pH為4.8，生物量達(dá)到峰值，隨后細(xì)胞自溶。

Hamitouche等［21］發(fā)現(xiàn)，一旦碳源耗盡，活性氧積累，蠟樣芽胞桿菌的生長(zhǎng)就會(huì)停止。硫胺素是一種含硫化合物，能與細(xì)胞中活性氧反應(yīng)提高細(xì)胞抗逆能力［9］。基料中加入維生素，顯著提高了HB菌株的生物量。但發(fā)酵過程中溢流代謝情況并未改變，發(fā)酵液中仍有大量乙酸積累，pH較低，細(xì)胞受到酸脅迫情況未改變。后續(xù)擬控pH培養(yǎng)。

2.6 2#工藝HB菌株生長(zhǎng)情況

Chen等［22］以恒pH=5.5培養(yǎng)凝結(jié)芽胞桿菌，細(xì)胞碳流傾向磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。故2#工藝在1#工藝基礎(chǔ)上控pH=5.5培養(yǎng)，即在發(fā)酵周期9～13 h控pH=5.5補(bǔ)氨水。由于碳源耗盡細(xì)胞即死亡，故將初始葡萄糖濃度提升至40 g/L，結(jié)果如圖4所示。

8～11 h細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，11 h細(xì)胞生物量最高為9.5×109 CFU/mL，較1#工藝提高69.6%。發(fā)酵效率為8.6×108 CFU/（mL·h），較1#工藝提高100%。11～15 h細(xì)胞進(jìn)入衰亡期，15 h生物量為3.4×109 CFU/mL。

9～13 h控pH 5.5，無乳酸生成。對(duì)數(shù)期控發(fā)酵液pH 5.5能使生物量顯著提高。13～15 h生物量達(dá)到高點(diǎn)后細(xì)胞迅速死亡。與1#工藝不同，當(dāng)基質(zhì)中葡萄糖耗盡后，發(fā)酵液pH迅速回升，但乙酸僅少量利用。推測(cè)細(xì)胞分解氨基酸生成氨基和能量［23］，但不足以維持其高密度生長(zhǎng)。

通過測(cè)定發(fā)酵液中過氧化氫濃度，結(jié)果如圖5所示。細(xì)胞在對(duì)數(shù)階段受到了較強(qiáng)的氧化脅迫，對(duì)數(shù)期結(jié)束時(shí)H2O2濃度達(dá)到峰值，為235.0 μmol/L。Imlay［24］提到，當(dāng)H2O2濃度高于0.5 μmol/L時(shí)，即會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)。氧化脅迫可能是細(xì)胞在碳源耗盡后迅速死亡的原因。故擬在發(fā)酵過程中補(bǔ)加L-半胱氨酸，幫助細(xì)菌抵抗氧化脅迫。

2.7 3#工藝HB菌株生長(zhǎng)情況

為緩解HB菌株生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激。3#工藝在2#工藝基礎(chǔ)上以恒速4.1 mg/（L·h）補(bǔ)入L-半胱氨酸，L-半胱氨酸添加對(duì)凝結(jié)芽胞桿菌HB生物量的影響如圖6所示。

8～13 h細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，13 h生物量最高為1.9×1010 CFU/mL，較2#工藝提高100%。發(fā)酵效率為1.5×109 CFU/（mL·h），較2#工藝提高74.4%。與2#工藝相同，9～13 h發(fā)酵液pH維持在5.5，待基質(zhì)中糖耗完后pH開始回升，乙酸不利用，且無乳酸生成。

發(fā)酵液內(nèi)H2O2濃度如圖5所示，發(fā)酵液中H2O2濃度12 h達(dá)到峰值，為65.1 μmol/L，相較于2#工藝減少72.3%。緩解細(xì)胞氧化脅迫能大幅提高凝結(jié)芽胞桿菌HB的生物量。

2.8 不同發(fā)酵工藝對(duì)凝結(jié)芽胞桿菌生物量的影響

由表2可知，硫胺素、生物素、控pH及L-半胱氨酸均能促進(jìn)凝結(jié)芽胞桿菌的生長(zhǎng)。其中0#、1#發(fā)酵工藝均在糖耗完后迅速死亡，使發(fā)酵液pH大幅下降，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。故在此基礎(chǔ)進(jìn)行控pH補(bǔ)糖發(fā)酵（2#工藝），13 h生物量大幅提高。經(jīng)測(cè)定發(fā)酵液中H2O2濃度發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可能受到較為嚴(yán)重的氧化脅迫。雖然凝結(jié)芽胞桿菌存在抵抗氧化脅迫的酶，但活性氧產(chǎn)出速度大于細(xì)胞的處理能力，造成細(xì)胞大量死亡［12］。3#工藝流加半胱氨酸后，發(fā)酵液H2O2濃度顯著下降。細(xì)胞13 h生物量達(dá)到最高，為1.9×1010 CFU/mL，15 h生物量為9.7×109 CFU/mL。3#工藝13 h發(fā)酵效率為1.5×109 CFU/（mL·h），較涂家霖等［25］的9.4×108 CFU/（mL·h）有顯著提升。

3 小結(jié)

碳源及氧化脅迫對(duì)凝結(jié)芽胞桿菌高密度發(fā)酵有顯著影響。本研究在搖瓶水平確定了最適硫胺素、生物素濃度，在最適碳源和最適溫度的基礎(chǔ)上，進(jìn)行30 L發(fā)酵罐放大試驗(yàn)。確定了凝結(jié)芽胞桿菌最適發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖 40 g/L、蛋白胨 50 g/L、酵母浸粉 5 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、MnSO4·H2O 0.3 g/L、輕質(zhì)CaCO3 6 g/L、K2HPO4·3H2O 3 g/L、生物素10 μmol/L，硫胺素20 μmol/L。培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)初始pH至6.2～6.5，9～14 h用氨水溶液控pH=5.5，pH>5.5后停止控制。培養(yǎng)全程恒速4.1 mg/（L·h）流加半胱氨酸。本工藝13 h最高生物量達(dá)1.9×1010 CFU/mL，較對(duì)照提升363.4%。發(fā)酵效率為1.5×109 CFU/（mL·h），較對(duì)照提升305.4%。極大程度地縮短了發(fā)酵周期，為凝結(jié)芽胞桿菌工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要參考。

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