李莘 李雪 王諳

基金項目：天津市教委科研計劃項目（2022YGYB14）

作者單位：1天津市海河醫(yī)院病理科（郵編300350）；2天津市呼吸疾病研究所；3天津市海河醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗部

作者簡介：李莘（1980），女，主任醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病的診斷及治療方面研究。E-mail：x_li2012@hotmail.com

摘要：目的 探討溫石棉對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的影響。方法 實驗組以50、100、200 mg/L溫石棉纖維液刺激HUVECs 24、48、72 h，對照組僅加RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，β-半乳糖苷酶法分析細(xì)胞衰老情況，四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測細(xì)胞存活率。采用實時熒光定量PCR法檢測細(xì)胞中Wnt5a、p16和p21 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 實驗組HUVECs多呈梭形，部分呈圓形或不規(guī)則形，出現(xiàn)裸核及空泡現(xiàn)象，可見死亡細(xì)胞。隨溫石棉質(zhì)量濃度及暴露時間的增加，細(xì)胞活性逐漸降低，衰老細(xì)胞逐漸增多。100 mg/L溫石棉處理HUVECs 24 h時，細(xì)胞生長較活躍。與對照組相比，實驗組Wnt5a、p16和p21 mRNA表達(dá)水平均增高（P＜0.05）。結(jié)論 溫石棉可促進(jìn)HUVECs衰老，Wnt5a、p16和p21參與此過程。

關(guān)鍵詞：石棉，蛇紋石；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；肺纖維化；Wnt-5a蛋白；基因，p16；基因，p21

中圖分類號：R563.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20240060

Effects of chrysotile on expression of Wnt5a， p16 and p21 in endothelial cells

LI Xin1， 2， LI Xue2， 3， WANG An2， 3

1 Department of Pathology， Tianjin Haihe Hospital， Tianjin 300350， China; 2 Tianjin Key Laboratory of Lung Regenerative Medicine; 3 Tianjin Institute of Respiratory Diseases， Tianjin Haihe Hospital

Abstract： Objective To investigate the influence of chrysotile on human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）. Methods HUVECs in the experimental group were treated with 50， 100 and 200 mg/L chrysotile for 24， 48 and 72 h. The control group was cultured with RPMI 1640 medium only. Morphological changes of HUVECs were observed. Cell viability was detected by MTT assay. β-Galactosidase staining was used to analyze the cell senescence. The cell survival rate was determined by tetramethylazolium blue assay. Wnt5a， p16 and p21 expression were investigated by qRT-PCR. Results Cells of the experimental group were oval and irregular， and some of them were round or irregular， with naked nuclei and vacuolar， and dead cells were present. With the increase of chrysotile concentration and exposure time， the level of cell viability decreased and the number of aged cells increased gradually （P＜0.05）. The cell growth of HUVECs was more active when 100 mg/L chrysotile treated for 24 h. Compared with the control group， the mRNA expression levels of Wnt5a， p16 and p21 were increased in the experimental group （P＜0.05）. Conclusion Chrysotile can promote HUVECs senescence， and Wnt5a， p16 and p21 are involved in this mechanism.

Key words： asbestos， serpentine; human umbilical vein endothelial cells; pulmonary fibrosis; Wnt-5a protein; genes， p16; genes， p21

我國為全球第一石棉消費國，目前90%以上使用的是溫石棉［1-2］。長期大量暴露于石棉會導(dǎo)致石棉肺、間皮瘤、肺癌、喉癌等疾病的發(fā)生［3-4］。根據(jù)礦物學(xué)及化學(xué)結(jié)構(gòu)，石棉纖維分為蛇紋石（溫石棉）和角閃石兩大類，溫石棉在細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，易裂解被吞噬［5］，長期高濃度吸入會出現(xiàn)石棉肺等表現(xiàn)。石棉肺是指吸入過量石棉纖維導(dǎo)致的彌漫性肺纖維化［6］，目前針對肺纖維化的治療方法有限。衰老受損肺組織的病理表現(xiàn)包括成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積、血管結(jié)構(gòu)破壞。以往的研究主要集中在溫石棉對肺泡上皮細(xì)胞及間皮細(xì)胞的作用，而對血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究不多。Wnt5a、p16和p21屬于老化相關(guān)分子，其中Wnt5a還參與胚胎氣道及血管的分化，而石棉肺的病理過程在一定程度上表現(xiàn)為老化及血管結(jié)構(gòu)異常。本研究利用分子生物學(xué)方法檢測了暴露在不同質(zhì)量濃度溫石棉下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）Wnt5a、p16和p21表達(dá)情況，旨在探討溫石棉對內(nèi)皮細(xì)胞分化、衰老過程的影響，為安全使用溫石棉提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 溫石棉由西南科技大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院中心實驗室惠贈。HUVECs購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，Trizol試劑、胎牛血清購自Invitrogen公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自索萊寶公司，二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖檢測試劑盒和細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶檢測試劑盒購自Sigma公司，Wnt5a、p16和p21引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司，SYBR Green實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒購自羅氏公司。

1.2 溫石棉懸液制備 將實驗原礦反復(fù)碾壓、劈分、剪短后進(jìn)行細(xì)研磨，200目篩過濾，烘干，最后研磨成更細(xì)的粉體，高溫充分殺菌消毒，加入RPMI 1640培養(yǎng)基制成200 mg/L粉塵懸液備用，實驗時分別稀釋為50 mg/L和100 mg/L。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的HUVECs，0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整為2×105個/mL，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.4 溫石棉刺激實驗及形態(tài)學(xué)觀察 根據(jù)文獻(xiàn)［7-8］，分別以50、100、200 mg/L溫石棉纖維液1 mL處理細(xì)胞24、48、72 h。對照組僅加RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 β-半乳糖苷酶法觀察細(xì)胞衰老情況 分別以50、100、200 mg/L溫石棉纖維液1 mL處理細(xì)胞24、48、72 h后收集細(xì)胞，對照組為僅加RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。PBS清洗后固定液固定15 min，再次PBS清洗后，加入預(yù)熱的37 ℃、1 mL β-半乳糖苷酶檢測試劑盒中X-gal染色液，37 ℃孵育12 h，直至細(xì)胞出現(xiàn)藍(lán)色，光學(xué)顯微鏡下觀察，藍(lán)色細(xì)胞為衰老細(xì)胞。每孔隨機(jī)讀取5個視野，計算衰老細(xì)胞占觀察細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.6 MTT法檢測細(xì)胞存活率 1.4實驗結(jié)束后棄去上清液，加入5 g/L的MTT液20 μL，37 ℃避光培養(yǎng)4 h，空白對照組加入20 μL PBS。吸取孔內(nèi)液體后，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩溶解15 min，酶標(biāo)儀測定490 nm光密度（OD）值。計算細(xì)胞存活率（%）=（實驗組OD/空白對照組OD）×100%。后續(xù)PCR實驗選擇細(xì)胞存活率較高的質(zhì)量濃度和作用時間。

1.7 qRT-PCR檢測細(xì)胞中Wnt5a、p16、p21 mRNA表達(dá)水平 100 mg/L溫石棉處理24 h后收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR One-step試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，引物序列見表1。反應(yīng)體系（20 μL）：2×qRT-PCR緩沖液10 μL，酶混合液2.0 μL，ROX液0.4 μL，RNA模板2.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 4.8 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 10 min；94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，70 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參計算mRNA相對表達(dá)量。計算方式為2-ΔCt法計算，ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。每組設(shè)立3個平行，實驗獨立重復(fù)3次。[基因名稱 引物序列（5→3） 產(chǎn)物大小/bp Wnt5a 上游：CTAACTTAGCTGTGTGGGACATG 235 下游：AAATGCAGAAAGCAAGCTAGCAG p16 上游：CGGGGACATCAAGACATCGT 203 下游：GCCGGATTTAGCTCTGCTCT p21 上游：ACATCTCAGGGCCGAAAACG 173 下游：AAGACACACAGAGTGAGGGC β-actin 上游：CCACTGGCATCGTGATGGAC 171 下游：GCGGATGTCCACGTCACACT ][Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 29.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以[[x] ±s

]表示，2組間比較采用t檢驗，多個時間點的比較采用重復(fù)測量資料的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 見圖1。實驗組細(xì)胞多呈梭形，部分呈圓形或不規(guī)則形，出現(xiàn)裸核、胞核濃染及空泡現(xiàn)象，可見死亡細(xì)胞。隨著時間的延長及溫石棉質(zhì)量濃度的增加，衰老及死亡細(xì)胞逐漸增多。對照組細(xì)胞呈長梭形，邊界清楚，貼壁生長，胞質(zhì)清亮，胞核清晰，細(xì)胞死亡不顯著。

2.2 細(xì)胞衰老情況 隨著刺激時間的延長及溫石棉質(zhì)量濃度的增加，實驗組中藍(lán)色衰老細(xì)胞數(shù)增加，見圖2

2.3 細(xì)胞存活率變化 MTT實驗發(fā)現(xiàn)，隨溫石棉質(zhì)量濃度的增加及作用時間的延長，細(xì)胞存活率逐漸降低。處理24 h時，100 mg/L溫石棉處理的細(xì)胞生長最為活躍（圖3），以此質(zhì)量濃度及時間作為后續(xù)PCR實驗的依據(jù)。[0][20][100][80][60][40][細(xì)胞存活率/%][120][Fig.3 The level of cell viability of HUVECs treated by different concentrations of chrysotile for different times

2.4 細(xì)胞中Wnt5a、p16和p21 mRNA表達(dá)情況 與對照組相比，實驗組Wnt5a、p16和p21 mRNA表達(dá)水平均增高（P＜0.05），見表3。

3 討論

溫石棉是一種硅酸鎂鹽，呈中空管狀結(jié)構(gòu)，易裂解并在細(xì)胞內(nèi)沉積。石棉進(jìn)入人體，產(chǎn)生的活性氧（ROS）使細(xì)胞DNA受損；同時石棉成分中的鎂、硅等會破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)而致?。?］。這些機(jī)制決定了石棉相關(guān)疾病會具有較長潛伏期，時間跨度大，疾病個體差異大。動物實驗發(fā)現(xiàn)，病變主要圍繞小血管及支氣管發(fā)生，出現(xiàn)炎癥、輕度纖維化及閉塞性細(xì)支氣管炎（BO）表現(xiàn)，表明溫石棉會影響細(xì)支氣管及其伴行血管的結(jié)構(gòu)及功能，而血管結(jié)構(gòu)異常會導(dǎo)致細(xì)胞缺氧及衰老，最終出現(xiàn)纖維化表現(xiàn)［9］。本研究中，實驗組HUVECs在接受溫石棉刺激后細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則變化，可見死亡細(xì)胞。實驗組β-半乳糖苷酶活性增加，衰老細(xì)胞數(shù)增多，均證實了溫石棉對HUVECs存在一定的毒性作用。

本研究中低濃度溫石棉刺激對細(xì)胞增殖有輕度促進(jìn)作用，隨接觸時間延長及濃度的增加，毒性加大，細(xì)胞存活率快速下降，與以往研究結(jié)果相似［10］。由于溫石棉產(chǎn)地不同，鎂、硅含量不同，對于患者體內(nèi)細(xì)胞的影響就更為復(fù)雜。

p16和p21是經(jīng)典的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，能夠使細(xì)胞周期停滯，在細(xì)胞衰老時表達(dá)增加［11-12］。本研究實驗組中p16和p21高表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化（IPF）患者肺組織中p16表達(dá)明顯升高，并且與IPF的病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［13］。在小鼠肺纖維化模型中，靶向清除p16陽性細(xì)胞后，小鼠肺功能得到明顯改善［14］。不同的是，在石棉處理過的人永生化支氣管上皮細(xì)胞（BEP2D）中，p16表達(dá)無明顯變化，p21表達(dá)下降［15］。這些結(jié)果的差異提示石棉在不同種類細(xì)胞中的作用可能有差異，這需要更深層次的探索。在溫石棉中暴露1個月后，大鼠肺組織p16 mRNA水平升高，但在第6個月與第12個月時表達(dá)下降，表明溫石棉不穩(wěn)定的特性對于細(xì)胞的影響存在階段性的差異［16］。溫石棉通常含有硅、鎂等成分，有的產(chǎn)地溫石棉中還含有鐵，這些成分在吸入的人體細(xì)胞中長期存在，影響細(xì)胞因子的合成。

Wnt5a屬于Wnt/β-catenin信號通路，除影響胚胎氣道和血管的分化外，還間接參與成人肺組織的損傷修復(fù)［17］。在肺纖維化模型中，博來霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS損傷內(nèi)皮細(xì)胞DNA后，細(xì)胞啟動修復(fù)過程，激活Wnt/β-catenin等通路，Wnt5a表達(dá)增加［18］。敲除Wnt5a的小鼠膠原沉積減少，纖維化程度明顯下降，IPF患者的支氣管肺泡灌洗液中Wnt5a表達(dá)增加［19］。在溫石棉刺激導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的過程中，Wnt5a表達(dá)增高，提示W(wǎng)nt5a參與血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的過程。Wnt5a、p16和p21同屬細(xì)胞衰老相關(guān)基因，既往研究發(fā)現(xiàn)p21過表達(dá)會激活Wnt/β-catenin通路［20］，而Wnt5a是該通路的重要成員。溫石棉誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞p21的過表達(dá)，與同時高表達(dá)的Wnt5a的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)暴露于溫石棉后HUVECs衰老增多、活性下降，細(xì)胞中Wnt5a、p16和p21表達(dá)增加，提示在溫石棉導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞老化過程中，Wnt5a、p16和p21參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷修復(fù)。

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（2024-01-10收稿 2024-03-03修回）

（本文編輯 魏杰）