李墨琳 朱亞瓊 丁雨菲 易丹 葛乃僑 陳思明 王月香

摘要：目的 探究富血小板血漿源性外泌體（PRP-Exos）對肌腱干/祖細(xì)胞（TSPC）增殖及遷移能力的影響。方法 采用聚合沉淀結(jié)合超速離心法提取PRP-Exos，采用透射電鏡和納米顆粒跟蹤分析技術(shù)鑒定其形態(tài)、濃度及粒徑，采用蛋白免疫印跡法檢測外泌體表面標(biāo)志蛋白及血小板膜糖蛋白的表達(dá)水平。提取并培養(yǎng)大鼠TSPC，采用流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光染色檢測TSPC表面標(biāo)志分子的表達(dá)情況。CCK-8法及EdU實(shí)驗(yàn)評估PRP-Exos對TSPC增殖情況的影響。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)評估PRP-Exos對TSPC遷移情況的影響。結(jié)果 提取的PRP-Exos呈典型茶托狀結(jié)構(gòu)，濃度為4.9×1011個/mL，平均粒徑為（132.2±56.8）nm，PRP-Exos表面表達(dá)CD9、CD63及CD41。提取的TSPC表達(dá)CD44蛋白。PRP-Exos可被TSPC攝取，共培養(yǎng)48 h時，濃度為50、100 μg/mL的PRP-Exos可顯著促進(jìn)TSPC的增殖（P均＜0.001），且兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.283）；共培養(yǎng)24 h后，濃度為50 μg/mL的PRP-Exos可顯著促進(jìn)TSPC的遷移（P＜0.001）。結(jié)論 體外培養(yǎng)條件下，PRP-Exos對大鼠TSPC的增殖及遷移具有顯著促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：富血小板血漿；外泌體；肌腱干/祖細(xì)胞；增殖；遷移；肩袖損傷

中圖分類號： R459.9；R686.5? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A? 文章編號：1000-503X（2024）03-0307-09

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15890

Effects of Platelet-Rich Plasma-Derived Exosomes on Proliferation and Migration of Tendon Stem/Progenitor Cell

LI Molin1，2，ZHU Yaqiong2，DING Yufei3，YI Dan2，GE Naiqiao1，4，CHEN Siming2，WANG Yuexiang2

1Chinese PLA Medical School，Beijing 100853，China

2Department of Ultrasound，The First Medical Center of Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

3Department of Orthopedics，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China

4Department of Radiology，Armed Police Corps Hospital of Jilin Province，Jilin，Jilin 130000，China

Corresponding author：WANG Yuexiang Tel：010-66935455，E-mail：wangyuexiang1999@sina.com

ABSTRACT：Objective To investigate the effects of platelet-rich plasma-derived exosomes （PRP-Exos） on the proliferation and migration of tendon stem/progenitor cell （TSPC）.Methods PRP-Exos were extracted through the combination of polymer-based precipitation and ultracentrifugation.The morphology，concentration，and particle size of PRP-Exos were identified by transmission electron microscopy and nanoparticle tracking analysis.The expression levels of surface marker proteins on PRP-Exos and platelet membrane glycoproteins were determined by Western blot analysis.Rat TSPC was extracted and cultured，and the expression of surface marker molecules on TSPC was detected using flow cytometry and immunofluorescence staining.The proliferation of TSPC influenced by PRP-Exos was evaluated using CCK-8 assay and EdU assay.The effect of PRP-Exos on the migration of TSPC was evaluated by cell scratch assay and Transwell assay.Results The extracted PRP-Exos exhibit typical saucer-like structures，with a concentration of 4.9×1011 particles/mL，an average particle size of （132.2±56.8） nm，and surface expression of CD9，CD63 and CD41.The extracted TSPC expressed the CD44 protein.PRP-Exos can be taken up by TSPC，and after co-cultured for 48 h，concentrations of 50 and 100 μg/mL of PRP-Exos significantly promoted the proliferation of TSPC （both P<0.001），with no statistical difference between the two concentrations （P=0.283）.Additionally，after co-cultured for 24 h，50 μg/mL of PRP-Exos significantly promoted the migration of TSPC （P<0.001）.Conclusion Under in vitro culture conditions，PRP-Exos significantly promote the proliferation and migration of rat TSPC.

Key words：platelet-rich plasma；exosome；tendon stem/progenitor cell；proliferation；migration；rotator cuff injury

Acta Acad Med Sin，2024，46（3）：307-315

肩袖撕裂是肩關(guān)節(jié)疼痛最常見的病因，常引發(fā)患者的慢性疼痛和功能受限，嚴(yán)重時甚至可能致殘［1］。急性肩袖損傷后，及時有效的腱骨界面重塑是良好預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肌腱干/祖細(xì)胞（tendon stem/progenitor cell，TSPC）作為重要的內(nèi)源性干細(xì)胞，在肌腱損傷后肌腱細(xì)胞的代謝及肌腱功能的維持中起著重要作用，但其增殖及遷移的效率較低［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞外泌體可以在一定程度上影響TSPC的增殖及遷移［3］。外泌體是由各種類型細(xì)胞所分泌的雙層膜囊泡，直徑為20～150 nm，具有與親本細(xì)胞相似的功能，通過攜載大量生物效應(yīng)分子發(fā)揮促組織再生及修復(fù)功能［4-5］。然而，干細(xì)胞外泌體受來源有限、體外擴(kuò)增成本昂貴且易污染、干細(xì)胞老化等限制，臨床轉(zhuǎn)化存在困難［6］。因此，需要尋找合適的外泌體來源以解決干細(xì)胞來源外泌體的局限性。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是將全血經(jīng)過離心后得到的富含高濃度血小板的血漿，活化的血小板釋放多種生長因子，是誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞活化并發(fā)揮修復(fù)功能的關(guān)鍵［7］。最新研究顯示，PRP激活后可釋放大量外泌體，因其富含比PRP更高水平的生長因子而受到關(guān)注。富血小板血漿源性外泌體（platelet-rich plasma-derived exosome，PRP-Exos）具有高穩(wěn)定性和低免疫原性，能夠保護(hù)其內(nèi)多種生長因子（血小板衍生生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β等）及核酸、蛋白質(zhì)等免于降解，突破生物屏障并實(shí)現(xiàn)跨物種信息傳遞［8］。重要的是，PRP-Exos的來源廣泛，既可從自體血中提取，亦可從臨床血液輸注資源中過剩的血小板單位中獲得，據(jù)報道，不同批次之間的外泌體具有較低變異性［9］。關(guān)于PRP-Exos對TSPC增殖及遷移的影響目前尚不清楚。因此，本研究探究PRP-Exos對TSPC增殖及遷移的潛在作用，以期為肩袖損傷疾病的治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

4周齡SD大鼠8只購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。低糖DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco公司，小鼠源抗CD9、抗CD63、抗CD41抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗、兔源抗CD44抗體及Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG（H+L）二抗均購自美國Proteintech公司，ExoQuick試劑盒購自美國System Biosciences公司，CD34-PE抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，CD44-APC抗體購自美國LifeSpan Biosciences公司，CD45-APC-Cy7抗體購自美國BioLegend公司，CD90-FITC抗體購自英國Abcam公司，BeyoClickTM EdU-488細(xì)胞增殖檢測試劑盒、DAPI、鬼筆環(huán)肽抗體和抗熒光淬滅封片劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PKH67熒光染料購自北京富百科生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒和結(jié)晶紫染料購自北京百瑞極生物科技有限公司，Transwell 6孔板購自美國Corning公司，Ⅰ型膠原酶、牛凝血酶及10%氯化鈣溶液購自美國Sigma-Aldrich公司。本研究通過中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批編號：2023-X19-32）。

1.2 PRP制備

6名健康志愿者簽署知情同意書后每人采集8 mL新鮮全血，并置于含38 g/L檸檬酸鈉的無菌管內(nèi)。采用兩步離心法提取PRP：第1次離心（400×g，10 min）去除底層的紅細(xì)胞和白細(xì)胞，將富含血小板的上清液移至新的離心管；第2次離心（800×g，10 min），收集下1/3部分即為PRP［10］，于-80 ℃冰箱內(nèi)儲存。

1.3 PRP上清液提取

采用牛凝血酶和10%氯化鈣溶液的混合液激活PRP［10］。PRP形成凝塊后回縮，并釋放大量的生長因子。經(jīng)離心后（2800×g，15 min）獲得富含大量生長因子的上清液，儲存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.4 PRP-Exos制備

采用聚合沉淀結(jié)合超速離心法提取PRP-Exos［11］。首先采用ExoQuick試劑盒獲得PRP-Exos：PRP經(jīng)凝血酶處理并離心去除纖維蛋白后，將上清液移至新的無菌離心管內(nèi)，再次離心去除細(xì)胞碎片；隨后加入外泌體提取工作液，經(jīng)沉淀、離心后，底部米黃色沉淀即為PRP-Exos。為進(jìn)一步去除PRP-Exos中的脂蛋白，將米黃色沉淀經(jīng)PBS重懸后，進(jìn)行4 ℃超速離心（100 000×g，70 min），棄去上清液，得到的PRP-Exos沉淀儲存于-80 ℃冰箱。

1.5 PRP-Exos鑒定

1.5.1 透射電鏡觀察PRP-Exos結(jié)構(gòu)形態(tài)

使用PBS將PRP-Exos重懸后，吸取15 μL的外泌體樣本滴加于銅網(wǎng)上靜置沉淀1 min，用濾紙將銅網(wǎng)上多余液體吸干，滴加15 μL 2%醋酸雙氧鈾染色液，室溫染色1 min，再次吸干多余液體，常溫干燥，采用透射電鏡在80 kV的加速電壓下觀察PRP-Exos形態(tài)。

1.5.2 納米顆粒跟蹤分析檢測PRP-Exos濃度及粒徑分布

采用ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀檢測外泌體的濃度及粒徑分布。使用PBS將PRP-Exos重懸后，吸取1 mL加入樣本檢測池內(nèi)，采用激光光束照射樣本，收集納米顆粒的散射光信號，計(jì)算粒子濃度，并對做布朗運(yùn)動的粒子進(jìn)行跟蹤分析，通過二維Stokes-Einstein方程計(jì)算粒子流體力學(xué)半徑，進(jìn)而推算外泌體的粒徑分布。

1.5.3 蛋白免疫印跡法檢測PRP-Exos表面標(biāo)志蛋白表達(dá)

分別向PRP和PRP-Exos內(nèi)加入RIPA裂解液，超聲下進(jìn)行裂解，取上清液。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離并轉(zhuǎn)膜。使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入一抗CD9（1∶1000）、CD63（1∶5000）及CD41（1∶4000），4 ℃孵育過夜。孵育后TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，再次洗膜，加入適量ECL化學(xué)發(fā)光液對條帶進(jìn)行曝光、顯影。

1.6 TSPC提取與培養(yǎng)

選取4周齡SD大鼠，處死后浸入75%的酒精中消毒。切除跟腱并剝離肌腱鞘膜，將肌腱組織切成碎塊，加入0.2%Ⅰ型膠原酶，于37 ℃下消化1 h。將消化后的懸浮液通過70 μm細(xì)胞過濾器，去除多余的細(xì)胞團(tuán)、組織塊及雜質(zhì)，離心后用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，并接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)基，選用第3～6代細(xì)胞用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測TSPC表面標(biāo)志分子表達(dá)

采用300 μL PBS重懸TSPC，制備濃度為1×107個/mL的細(xì)胞懸液，分別加入5 μL CD34-PE、CD44-APC、CD45-APC-Cy7、CD90-FITC抗體，充分混勻后避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測TSPC表面標(biāo)志分子的表達(dá)情況。

1.8 免疫熒光染色鑒定TSPC

將TSPC以2×104個/孔的密度接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁生長后吸出培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛于4 ℃固定30 min，經(jīng)0.25% Triton X-100透化及10%山羊血清封閉處理2 h后，滴加100 μL抗CD44（1∶100），4 ℃孵育過夜；滴加熒光二抗（1∶500）室溫避光孵育2 h，DAPI染核3～5 min，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.9 TSPC對PRP-Exos的攝取

將TSPC以1×104個/孔的密度接種于12孔板內(nèi)。將PRP-Exos沉淀使用100 μL含0.4 μL原液的PKH67熒光染色液重懸，37 ℃避光孵育5 min，4 ℃避光孵育15 min，4 ℃超速離心（100 000×g，70 min），去除未結(jié)合染料。將PKH67熒光標(biāo)記的PRP-Exos與TSPC共培養(yǎng)24 h后，加入4%多聚甲醛4 ℃固定15 min，對照組采用等體積PBS替代PRP-Exos。滴加100 μL鬼筆環(huán)肽抗體（1∶100），室溫避光標(biāo)記細(xì)胞骨架30 min，滴加DAPI染核3～5 min，使用激光共聚焦顯微鏡觀察TSPC攝取外泌體情況。

1.10 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將TSPC以4×103個/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，加入100 μL含有0、10、50、100 μg/mL PRP-Exos的完全培養(yǎng)基，分別于24、48 h更換為含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基孵育4 h，使用TECAN酶標(biāo)儀檢測每孔在450 nm的吸光度值。

1.11 EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

將TSPC以2×104個/孔的密度均勻接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入1 mL含有50 μg/mL PRP上清液或PRP-Exos的完全培養(yǎng)基以及等體積PBS，培養(yǎng)48 h，加入終濃度為10 μmol/L的EdU工作液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min，0.3% Triton-X100透化15 min，每孔加入100 μL Click反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核后，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的增殖情況。采用Image J軟件分別計(jì)算EdU陽性細(xì)胞的數(shù)量及DAPI標(biāo)記的總細(xì)胞數(shù)量，其比值為EdU陽性增殖細(xì)胞百分率。

1.12 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞遷移

將TSPC以5×104個/孔的密度接種于6孔板中，當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)90%時，使用200 μL無菌槍頭在細(xì)胞生長的中央?yún)^(qū)域劃直線，以去除部分細(xì)胞。PRP-Exos組更換含50 μg/mL PRP-Exos的新鮮無血清培養(yǎng)基，PRP組更換含相同濃度PRP上清液的無血清培養(yǎng)基，對照組為含等體積PBS的無血清培養(yǎng)基，分別于0、24 h采用倒置顯微鏡進(jìn)行拍照，觀察劃痕區(qū)細(xì)胞的遷移情況。

1.13 Transwell實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞遷移

將500 μL含TSPC細(xì)胞懸液（5×104個/孔）的無血清培養(yǎng)基均勻接種于Transwell孔板上室，另將600 μL含50 μg/mL的PRP上清液或PRP-Exos的完全培養(yǎng)基加入下室，孵育24 h后，棄去上室培養(yǎng)基，使用棉簽輕輕擦去上室上層未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定滲透膜上的遷移細(xì)胞15 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況，采用Image J軟件計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞相對遷移比值。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用Shapiro-Wilk法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間不同時間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測量的方差分析，采用Turkey法進(jìn)行組間的事后多重比較。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRP-Exos鑒定

透射電鏡觀察顯示，PRP-Exos顆粒為圓形囊泡，呈現(xiàn)外泌體典型的茶托狀結(jié)構(gòu)特征（圖1A）。納米顆粒跟蹤分析技術(shù)顯示，PRP-Exos濃度為4.9×1011個/mL，平均粒徑（132.2±56.8）nm（圖1B）。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，PRP-Exos表達(dá)外泌體特異標(biāo)志蛋白CD9、CD63及血小板膜糖蛋白CD41（圖1C）。

2.2 TSPC鑒定

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，TSPC表面CD44、CD90、CD34、CD45陽性表達(dá)率分別為85.9%、93.2%、0.16%、2.39%（圖2A）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，提取的TSPC大小均一，呈梭形或多角形，可見大量表面標(biāo)志蛋白CD44表達(dá)陽性（圖2B）。

2.3 TSPC對PRP-Exos的攝取

激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，PRP-Exos組觀察到綠色熒光標(biāo)記的PRP-Exos明顯聚集在TSPC的細(xì)胞核周圍，分布于呈紅色熒光信號的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而對照組未見綠色熒光信號（圖3）。

2.4 PRP-Exos對TSPC增殖能力的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，共培養(yǎng)24 h后，100 μg/mL PRP-Exos組的TSPC增殖能力較0、10、50 μg/mL組增強(qiáng)（P＜0.001，P＜0.001，P=0.028）；共培養(yǎng)48 h后，50 、100 μg/mL PRP-Exos組的TSPC增殖能力較0、10 μg/mL組明顯增強(qiáng)（P均＜0.001），而50 μg/mL和100 μg/mL PRP-Exos組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.283）（圖4A），后續(xù)選擇50 μg/mL作為PRP-Exos組的最佳藥物刺激濃度。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，PRP組和PRP-Exos組的EdU陽性細(xì)胞率均明顯增加［（27.00±2.93）%比（14.22±3.92）%，P=0.042和（40.01±9.60）%比（14.22±3.92）%，P＜0.001］；與PRP組比較，PRP-Exos組表現(xiàn)出更強(qiáng)的促細(xì)胞增殖作用［（40.01±9.60）%比（27.00±2.93）%，P=0.039］（圖4B）。

2.5 PRP-Exos對TSPC遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，共培養(yǎng)24 h后，PRP、PRP-Exos、對照組的劃痕區(qū)間隙均有不同程度的縮?。▓D5A）。PRP-Exos組的TSPC遷移能力較PRP組和對照組明顯增加［（53.31±7.75）%比（40.52±5.99）%；P=0.045和（53.31±7.75）%比（26.76±4.92）%；P＜0.001］（圖5B）。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，PRP-Exos組的細(xì)胞遷移能力較PRP組和對照組明顯增加（1.55±0.13比1.28±0.07；P=0.025和1.55±0.13比1.00±0.14；P＜0.001）（圖5C、5D）。

3 討論

肩袖損傷是重要的肌肉骨骼系統(tǒng)疾病，常導(dǎo)致長期疼痛和預(yù)后不良，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［12］。目前，以手術(shù)修復(fù)為主的對癥治療是臨床常用且有效的治療手段，但越來越多的證據(jù)表明，腱骨界面的愈合能力十分有限［13-14］。天然肌腱-纖維軟骨-骨的梯度結(jié)構(gòu)及功能往往很難僅通過手術(shù)修補(bǔ)重塑，主要原因之一是肌腱損傷部位TSPC的數(shù)量及遷移能力難以支撐肩袖的再生修復(fù)。本研究成功地從健康志愿者的PRP中提取出形態(tài)良好且濃度較高的PRP-Exos，經(jīng)證實(shí)這些外泌體能夠被TSPC細(xì)胞有效攝取。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRP-Exos可以顯著增強(qiáng)TSPC的增殖及遷移能力。PRP-Exos作為一種新型的效應(yīng)分子，有可能解決肩袖修復(fù)過程中TSPC功能不足的問題。

基于TSPC的干細(xì)胞療法在運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有獨(dú)特的發(fā)展前景。相比于受到廣泛關(guān)注的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，TSPC被證實(shí)具有更強(qiáng)大的克隆、增殖及特殊的肌腱分化能力［15］，通過改善細(xì)胞基質(zhì)、影響血管生成和膠原蛋白合成及調(diào)控肌腱代謝微環(huán)境來修復(fù)損傷肌腱［16］。許多研究將TSPC作為種子細(xì)胞，與基于3D打印材料［2］、納米纖維材料［17］、多功能水凝膠［18］等組織工程技術(shù)相結(jié)合，在運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展。然而，隨著內(nèi)源性TSPC或體外擴(kuò)增過程中的細(xì)胞衰老，其發(fā)揮修復(fù)功能的表型也隨之改變，以轉(zhuǎn)錄因子Scleraxis為主的腱細(xì)胞譜系標(biāo)志基因的表達(dá)逐漸降低［2］。細(xì)胞衰老不可避免地導(dǎo)致錯誤的干細(xì)胞分化和基質(zhì)沉積改變，包括異位骨化和纖維化，最終導(dǎo)致干細(xì)胞耗竭和肌腱再生失敗。因此，維持具有活性TSPC的數(shù)量及關(guān)鍵表型至關(guān)重要，亟待探索可適用于TSPC的生物活性分子。

關(guān)于PRP的臨床療效和用途目前仍存在一定的爭議，其主要原因可能涉及以下幾個方面：（1）PRP制備方法及質(zhì)量控制尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，這導(dǎo)致對比評估不同研究中PRP的再生功能及治療有效性十分困難［19］；（2）PRP療法具有個體局限性，其效果易受患者性別、年齡及自身機(jī)能水平的影響，在一定程度上限制了臨床應(yīng)用［7，20］。而PRP-Exos含有較PRP更高水平的生長因子及豐富的核酸信息，具有極高穩(wěn)定性和低免疫原性，可以突破PRP自體療法的限制，實(shí)現(xiàn)跨物種治療的可能。近期研究已證實(shí)PRP-Exos具有止血、促血管生成、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的能力，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有強(qiáng)大的潛能［9，21］。本研究探究PRP-Exos對大鼠TSPC增殖及遷移的促進(jìn)作用，為肩袖疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)。

組織損傷后，內(nèi)源性細(xì)胞的活化、增殖并向損傷區(qū)域趨化是介導(dǎo)修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)PRP-Exos發(fā)揮再生作用與其參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及功能有關(guān)。Tao等［22］研究發(fā)現(xiàn)PRP-Exos可逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素處理后人微血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、小鼠胚胎成骨細(xì)胞的抗增殖作用，從而改善股骨頭壞死骨組織的維持與再生。Xu等［23］研究發(fā)現(xiàn)PRP-Exos可促進(jìn)人永生化表皮細(xì)胞的增殖、遷移，并改善傷口愈合。此外，維持干細(xì)胞群并加強(qiáng)其在損傷區(qū)域的生物學(xué)行為對組織再生更為重要?，F(xiàn)已證實(shí)PRP-Exos可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等多種干細(xì)胞的增殖、存活及分化［24-25］。本研究結(jié)果顯示，PRP-Exos能夠顯著促進(jìn)TSPC的增殖及遷移能力，且作用效果受濃度和時間的影響。共培養(yǎng)24 h后，100 μg/mL PRP-Exos組出現(xiàn)明顯的促增殖效果，而10、50 μg/mL PRP-Exos組的促增殖效果較0 μg/mL組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；共培養(yǎng)48 h后，50、100 μg/mL PRP-Exos組較0 μg/mL組均有明顯的促增殖效果。這可能是因?yàn)槎虝r間PRP-Exos刺激TSPC需要較高的濃度閾值，隨著培養(yǎng)時間的延長，稍低濃度的PRP-Exos也可能起到促增殖效果。此外，共培養(yǎng)48 h后，50 μg/mL和100 μg/mL兩組濃度的促增殖效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示更高濃度的PRP-Exos并不一定介導(dǎo)更高效的促增殖效果。其原因可能為PRP-Exos刺激能力存在濃度飽和，亦或是外泌體內(nèi)復(fù)雜的mRNA、微小RNA、蛋白質(zhì)、活性分子等改變了TSPC表型，進(jìn)而對增殖能力產(chǎn)生影響。本研究選取50 μg/mL濃度用于觀察PRP-Exos對TSPC的促遷移能力，Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)均顯示PRP-Exos組較PRP組表現(xiàn)出更強(qiáng)的促細(xì)胞遷移作用。

本研究存在一定的局限性。首先，50 μg/mL的PRP-Exos濃度僅為大致參考濃度，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，需要詳細(xì)設(shè)置濃度梯度來篩選最佳的刺激濃度。其次，隨培養(yǎng)時間延長，更高濃度PRP-Exos并不能進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的增殖效果，其原因還需要進(jìn)一步探討。最后，由于外泌體內(nèi)容物的復(fù)雜性，其對TSPC生物學(xué)行為影響的復(fù)雜機(jī)制通路同樣值得探索。

綜上，本研究結(jié)果表明，PRP-Exos可顯著促進(jìn)大鼠TSPC增殖及遷移能力。PRP-Exos的來源及制備極具優(yōu)勢，可為肩袖損傷的臨床治療提供新的方法。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 李墨琳：研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)搜集、起草論文及修改；朱亞瓊：研究選題、審閱文稿；丁雨菲：數(shù)據(jù)搜集和分析、對重要學(xué)術(shù)內(nèi)容做出關(guān)鍵性修訂；易丹：數(shù)據(jù)分析，修改論文；葛乃僑：數(shù)據(jù)收集及分析、對學(xué)術(shù)問題進(jìn)行解答；陳思明：研究選題、論文定稿；王月香：對學(xué)術(shù)問題進(jìn)行解答、同意對研究工作各方面的誠信問題負(fù)責(zé)

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-10-19）