藺錫桐 劉加秀 張樹超

［摘要］ 目的

分析富血小板血漿（PRP）-80 ℃深低溫短期保存以后，其內(nèi)P-選擇素、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板源生長因子（PDGF）濃度及其pH值等重要指標(biāo)的變化，為PRP低溫儲存提供理論依據(jù)。

方法

取30例健康供者血液制備的PRP，每份樣本分裝成5份，每份留取0.5 mL，分別為A組（新鮮組）和B～E組（分別凍存5、10、15、20 d）。測定各組PRP的pH值；ELISA法測定各組PRP中P-選擇素、PDGF和VEGF的水平；血管形成實驗檢測A組和E組對HUVEC細胞血管形成能力的影響。

結(jié)果 各組pH值比較差異無顯著性（P＞0.05）；各組PRP中P-選擇素、PDGF、VEGF的濃度比較，差異均無顯著性（P＞0.05）；A組和E組中HUVEC血管形成數(shù)量比較差異無顯著意義（P＞0.05）。

結(jié)論 -80 ℃深低溫保存PRP對其pH值、P-選擇素、VEGF和PDGF濃度變化無顯著影響，可延長PRP臨床應(yīng)用時間。

［關(guān)鍵詞］ 富血小板血漿；低溫保存；P選擇素；血管內(nèi)皮生長因子類；血小板源性生長因子；氫離子濃度

［中圖分類號］ R457.14;R318.52??? ［文獻標(biāo)志碼］ A

富血小板血漿（PRP）是自體全血經(jīng)由離心濃縮制得的血液制品，其主要成分為濃縮后的血小板[1]。血小板內(nèi)含有多種細胞器，包括α-顆粒、致密顆粒和溶酶體等，其中α-顆粒中包含大量生長因子。PRP受刺激后會脫顆粒釋放大量的生長因子，如P-選擇素、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板源生長因子（PDGF）等[2]，這些因子通過相互介導(dǎo)，可形成廣泛且多層次的信號分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，促進成纖維細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、上皮以及內(nèi)皮細胞的增殖，加速傷口愈合和組織修復(fù)[3]。目前PRP多用于退行性疾病、難愈性創(chuàng)面修復(fù)、急慢性損傷、燒傷和角膜損傷等多種臨床疾病的治療，已被廣泛應(yīng)用于運動醫(yī)學(xué)科、康復(fù)醫(yī)學(xué)科、心臟外科、婦科、整形外科和眼科等多個學(xué)科領(lǐng)域[4]。PRP治療的一個療程多為1～3周，但其常規(guī)保存期只有5 d，超過保存期以后的PRP由于理化性質(zhì)等方面的改變會導(dǎo)致PRP失活，致血液浪費。因此，如何長期保存PRP是目前臨床的一大難題。本研究通過將PRP在-80 ℃深低溫短期保存后，比較冷凍前后其pH值的變化，以及其內(nèi)P-選擇素、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板源生長因子（PDGF）等重要生長因子濃度的變化，為PRP低溫儲存提供理論依據(jù)。 現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

多功能酶標(biāo)分析儀、-80 ℃冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），正置倒置一體熒光顯微鏡（美國Discover Echo公司），筆式pH計（上海般特儀器有限公司），凝血酶（批號No.721N031，北京索萊寶公司，終濃度為1×105 U/L）；ABW基質(zhì)膠（批號20223019ZHA，上海諾娃醫(yī)藥科技有限公司）；VEGF-ELISA試劑盒（批號25319591007，武漢博士德生物工程有限公司）；PDGF-ELISA試劑盒（批號7WKTNPQ1JD）和P-選擇素-ELISA試劑盒（批號KL048RN06998）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 對象及其分組

選取30例自愿獻血者的PRP樣本。納入標(biāo)準：①均符合我國國家標(biāo)準中對獻血者的體檢以及血液檢查的要求；②年齡18～55歲者；③體質(zhì)量50～82 kg者；④身體健康無傳染病，并在1周內(nèi)未服用過干擾血小板的藥物者；⑤PRP的計數(shù)納入標(biāo)準約為（1 081.30±115.66）×109/L者。將每例PRP分裝成5份，每份0.5 mL，分別為A～E組。A組為新鮮PRP，B～E組分別置于-80 ℃凍存5、10、15、20 d的PRB。

1.3 研究方法

1.3.1 各組PRP的pH值測定 使用筆式pH計測定A～E組PRP的pH值。其中B～E組PRP在從冰箱取出以后，需要先解凍至室溫狀態(tài)，再進行測量。

1.3.2 ELISA方法測定各組PRP中P-選擇素、PDGF和VEGF的水平 將凝血酶用生理鹽水配成濃度為1×105 U/L的溶液，加入無水氯化鈣溶解，按照Ca2＋∶凝血酶為40 g/L∶1×105 U/L的比例配置激活溶液。分別取A～E組PRP樣品，按照1 mL的PRP中加入40 μL激活溶液配比激活PRP，靜置2 h后，以15 000 r/min離心10 min，取上層血清。嚴格按照各細胞因子的ELISA試劑盒說明書中的要求進行操作，在加入終止液后立即用多功能酶標(biāo)儀測量波長450 nm處的吸光度值，并根據(jù)各自標(biāo)準曲線，帶入所測得吸光度值，計算血清中P-選擇素、PDGF和VEGF水平。

1.3.3 細胞培養(yǎng) 將HUVEC細胞置于含有10%的FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，待細胞密度達70%～80%時進行換液傳代，傳至第三代的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.4 HUVEC細胞血管形成實驗 ①將ABW基質(zhì)膠和不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液按照1∶2比例稀釋，取24孔板，每孔加入200 μL基質(zhì)膠稀釋液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中45 min使其凝固；②取A組與E組PRP血清分別加入到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中混勻，留待備用；③將生長狀態(tài)良好的第三代HUVEC細胞以胰酶消化，分為兩份，以1 000 r/min離心5 min后棄上清液，分別用配制好的含有A組與E組PRP血清的混合培養(yǎng)基重懸，調(diào)整HUVEC細胞濃度為1×106個/mL，待基質(zhì)膠凝固后于24孔板中每孔中加入200 μL細胞重懸液，使得每孔中細胞數(shù)量約為2×105個，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，使用正置顯微鏡觀察HUVEC細胞血管形成的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 9.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和圖像處理，計量資料以[AKx-D]±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。A組和E組HUVEC細胞的血管形成數(shù)量比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 各組PRP的pH值以及PDGF、P-選擇素、VEGF水平比較

A～E組PRP的pH值比較差異無顯著意義（P＞0.05），各組中P-選擇素、PDGF和VEGF的水平比較差異無顯著性（P＞0.05）。見表1。

2.2 PRP中的生長因子對于HUVEC血管形成的影響

A組和E組中HUVEC的血管形成數(shù)量分別為（49.67±3.79）、（50.00±1.00）個，兩組比較差異無顯著性（P＞0.05）。見圖1。

3 討? 論

PRP中血小板的濃度遠高于生理基線，在受到刺激后血小板會釋放大量與創(chuàng)傷愈合相關(guān)的生長因子和黏附蛋白，從而啟動細胞和組織的修復(fù)并加快其進程[5-7]。PRP釋放的大量生長因子能通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌等機制啟動損傷修復(fù)級聯(lián)反應(yīng)，通過刺激細胞的遷移和增殖、血管生成和基質(zhì)的合成等途徑，啟動和促進傷口的愈合和修復(fù)[8]。

近些年來PRP已被開發(fā)應(yīng)用于臨床中的多個學(xué)科[9-14]。PRP治療每療程多不超過3次，時間間隔多為1～3周。據(jù)此，本研究探索-80 ℃凍存5、10、15、20 d后PRP的pH值及其內(nèi)各種細胞因子的變化，研究結(jié)果可為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

離體后的血小板失去細胞內(nèi)環(huán)境的保護作用會變得極其脆弱，容易受劇烈震蕩、溫度和pH值變化等影響而引起血小板的聚集和碎裂，從而影響其生物學(xué)功能。常規(guī)在臨床上PRP多在（22±2）℃的恒溫振蕩箱中保存，并且保存時間不超過5 d[13]。依靠這種常溫振蕩保存方法，PRP保存時間短、易污染和功效易降低或失活等缺點給臨床治療帶來諸多不便，還需要對患者進行頻繁血液樣本采集，為患者帶來巨大精神和經(jīng)濟壓力。因此，在不損害PRP功能的前提下對其進行凍存也已成為關(guān)注熱點之一。隨著深低溫冰箱的推廣，本研究分析PRP儲存在-80 ℃冰箱后其pH值及各種因子水平的變化，以探索延長PRP臨床應(yīng)用時間的方法。

PRP發(fā)揮生理功能的最適pH值約為6.5～7.2，在常溫保存過程中，PRP仍會進行有氧代謝和糖酵解等新陳代謝，糖酵解產(chǎn)生的乳酸和氫離子積累到一定濃度時會使得PRP的pH值迅速下降，當(dāng)pH值下降至6.0～6.1時，血小板形態(tài)由圓盤狀變?yōu)閳A球狀，并且此不可逆的形態(tài)變化伴隨血小板數(shù)量下降和釋放的各類生長因子生物學(xué)功能的完全喪失[15]。低溫能夠減慢其新陳代謝進程，降低乳酸的生成和積累，維持血漿緩沖作用。本研究結(jié)果顯示，新鮮PRP及-80 ℃凍存5、10、15、20 d的PRP比較，各組的pH值不存在顯著差異，說明在-80 ℃凍存條件下能夠延緩PRP糖酵解作用引起的乳酸堆積，延緩pH下降的速度，延長保存時間。

血小板釋放的各種生長因子中，PDGF是一種刺激組織細胞生長的肽類調(diào)節(jié)分子，生理狀態(tài)下存在于血小板α顆粒中[16]。有研究表明，PDGF在早期發(fā)育階段能通過結(jié)合PI3K/Akt、JAK/STAT和Src等多條跨膜酪氨酸通路促進細胞有絲分裂和趨化，從而刺激傷口處成纖維細胞、平滑肌細胞和其他細胞的分裂增殖[17-18]。在后期成熟期，PDGF則可促進組織重塑以及特殊細胞的分化[19]。本研究結(jié)果顯示，新鮮PRP及-80 ℃凍存5、10、15、20 d的PRP比較，各組中PDGF含量無顯著差異，提示凍存的PRP在PDGF水平釋放上可以滿足臨床應(yīng)用需求。

VEGF是一類重要的具有促血管生成活性的生長因子，對內(nèi)皮細胞有促進有絲分裂和抗凋亡作用，能夠增加血管通透性，促進細胞遷移[20]。既往研究顯示，VEGF可以通過PLCγ-ERK和PLCγ-PKC通路來調(diào)節(jié)細胞增殖，從而促進創(chuàng)面愈合[21]。同時，VEGF是促進血管和淋巴管形成的重要因子，新生的血管和淋巴管可為創(chuàng)面組織的新生和修復(fù)供應(yīng)充足的養(yǎng)分，促進傷口的愈合[22-23]。本研究中，新鮮PRP及-80 ℃凍存5、10、15、20 d的PRP比較，各組中VEGF含量比較無顯著差異；同時新鮮PRP和-80 ℃凍存20 d的PRP對HUVEC血管形成能力的影響也無顯著差異。提示凍存5、10、15、20 d并不會對PRP的VEGF濃度造成影響，在促進新生血管的生成中的作用與新鮮PRP相近。

另外，血小板中的P-選擇素作為黏附分子家族一員，能夠介導(dǎo)粒細胞和單核細胞在內(nèi)皮細胞表面的滾動以及血小板之間的黏附作用，不僅能夠參與細胞間和細胞-細胞外基質(zhì)的相互作用，調(diào)節(jié)參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和炎癥的發(fā)生發(fā)展[24]，而且是在血栓形成和凝血過程中發(fā)揮有重要作用[25]。P-選擇素能夠易位到活化后的血小板表面，支持血小板-血小板之間的相互作用，促進血栓形成和凝血[26]。不僅如此，P-選擇素還能夠促進損傷部位對白細胞的募集，此行為能夠加速炎癥的早期進程[27]。本研究中，PRP在-80 ℃凍存5、10、15、20 d后，與新鮮PRP釋放的P-選擇素比較，并無顯著差異?？梢?，P-選擇素在冰凍20 d后仍能發(fā)揮其正常生物學(xué)功能。

綜上所述，-80 ℃凍存5、10、15、20 d均不影響PRP中PDGF、P-選擇素和VEGF等重要生長因子的含量及其生物學(xué)功能，同時能夠顯著延緩其pH值下降的速度，較長時間維持PRP功能。該研究結(jié)果為臨床長時間保存PRP提供了一定的理論依據(jù)。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核批準（文件號QYFYWZLL28419）。所有試驗過程均遵照《實驗室安全管理守則》的條例進行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

［參考文獻］

[1]AKGL A， CIRAK M， BIRINCI T. Applications of platelet-rich plasma in lymphedema[J]. Lymphat Res Biol， 2016，14（4）：206-209.

[2]GUPTA S， PALICZAK A， DELGADO D. Evidence-based indications of platelet-rich plasma therapy[J]. Expert Rev Hematol， 2021，14（1）：97-108.

[3]XU J， GOU L， ZHANG P， et al. Platelet-rich plasma and regenerative dentistry[J]. Aust Dent J， 2020，65（2）：131-142.

[4]ZHANG J Y， FABRICANT P D， ISHMAEL C R， et al. Utilization of platelet-rich plasma for musculoskeletal injuries： An analysis of current treatment trends in the United States[J]. Orthop J Sports Med， 2016，4（12）：2325967116676241.

[5]ANDIA I， ABATE M. Platelet-rich plasma： Underlying biology and clinical correlates[J]. Regen Med， 2013，8（5）：645-658.

[6]NURDEN A T. Platelets， inflammation and tissue regeneration[J]. Thromb Haemost， 2011，105（Suppl 1）：S13-S33.

[7]COLLINS T， ALEXANDER D， BARKATALI B. Platelet-rich plasma： A narrative review[J]. EFORT Open Rev， 2021，6（4）：225-235.

[8]MARX R E. Platelet-rich plasma （PRP）：What is PRP and what is not PRP？[J]. Implant Dent， 2001，10（4）：225-228.

[9]ALIO J L， RODRIGUEZ A E， FERREIRA-OLIVEIRA R， et al. Treatment of dry eye disease with autologous platelet-rich plasma： A prospective， interventional， non-randomized study[J]. Ophthalmol Ther， 2017，6（2）：285-293.

[10]GIUSTI I， DASCENZO S， MACCHIARELLI G， et al. In vitro evidence supporting applications of platelet derivatives in regenerative medicine[J]. Trasfusione Del Sangue， 2020，18（2）：117-129.

[11]BRASS L F. Thrombin and platelet activation[J]. Chest， 2003，124（3 Suppl）：18S-25S.

[12]EVERTS P A， KNAPE J T， WEIBRICH G， et al. Platelet-rich plasma and platelet gel： A review[J]. J Extra Corpor Technol， 2006，38（2）：174-187.

[13]潘宗岱，薛靜，孫士鵬，等. 血小板及其衍生物的保存方案和應(yīng)用進展[J]. 臨床血液學(xué)雜志， 2022，8（12）：900-904.

[14]ZIEGLER M E， STABEN A， LEM M， et al. Targeting myofibroblasts as a treatment modality for dupuytren disease[J]. J Hand Surg Am， 2023，48（9）：914-922.

[15]李秋燕，夏志楊，熊小敏. 單采血小板儲存時間對pH值和乳酸含量的影響觀察[J]. 中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用， 2020，14（15）：237-239.

[16]CECERSKA-HERY E， GOSZKA M， SERWIN N， et al. Applications of the regenerative capacity of platelets in modern medicine[J]. Cytokine Growth Factor Rev， 2022，64：84-94.

[17]FREDRIKSSON L， LI H， ERIKSSON U. The PDGF family： Four gene products form five dimeric isoforms[J]. Cytokine Growth Factor Rev， 2004，15（4）：197-204.

[18]PATSCH C， CHALLET-MEYLAN L， THOMA E C， et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells[J]. Nat Cell Biol， 2015，17（8）：994-1003.

[19]ANTONIADES H N. PDGF： A multifunctional growth factor[J]. Baillieres Clin Endocrinol Metab， 1991，5（4）：595-613.

[20]MELINCOVICI C S， BO瘙塁CA A B，瘙塁U瘙塁MAN S， et al. Vascular endothelial growth factor （VEGF）-key factor in normal and pathological angiogenesis[J]. Rev Roum De Morphol Embryol， 2018，59（2）：455-467.

[21]ZHANG X， YAO D， ZHAO W Y， et al. Engineering platelet-rich plasma based dual-network hydrogel as a bioactive wound dressing with potential clinical translational value[J]. Adv Funct Materials， 2021，31（8）：2009258.

[22]KARAMAN S， LEPPNEN V M， ALITALO K. Vascular endothelial growth factor signaling in development and disease[J]. Development， 2018，145（14）：dev151019.

[23]MOLENAAR T J， TWISK J， DE HAAS S A， et al. P-selectin as a candidate target in atherosclerosis[J]. Biochem Pharmacol， 2003，66（5）：859-866.

[24]YEINI E， SATCHI-FAINARO R. The role of P-selectin in cancer-associated thrombosis and beyond[J]. Thromb Res， 2022，213（Suppl 1）：S22-S28.

[25]PALABRICA T， LOBB R， FURIE B C， et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets[J]. Nature， 1992，359（6398）：848-851.

[26]GENG J G， CHEN M， CHOU K C. P-selectin cell adhesion molecule in inflammation， thrombosis， cancer growth and metastasis[J]. Curr Med Chem， 2004，11（16）：2153-2160.

[27]ANDR?P. P-selectin in haemostasis[J]. Br J Haematol， 2004，126（3）：298-306.