李龍 譚占坤 李文鳳 劉鎖珠

摘要：為有效預(yù)防和治療藏仔豬腹瀉，采用PCR和Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法對(duì)西藏林芝市舍飼藏仔豬分離的102株腹瀉源大腸桿菌（Escherichia coli）毒力基因、粘附因子基因和耐藥性進(jìn)行檢測(cè)。大腸桿菌毒力基因和菌毛粘附因子基因檢測(cè)結(jié)果表明，檢出率最高的菌毛粘附因子基因是F18（45.10%），其次是F4（15.69%），所有菌株均未檢出F41基因；102株菌株中有37株菌株未檢出菌毛粘附因子基因。毒力基因中檢出率最高的是Stx2e基因（25.49%），其次為STb：EAST-1基因（21.57%）和STa：STb基因（17.65%）。大腸桿菌菌毛粘附因子基因和非菌毛粘附因子基因檢測(cè)結(jié)果表明，在檢出AIDA-1基因的菌株中菌毛粘附因子基因（F18、F4）的菌株占比為44.73%，在檢出paa基因的菌株中菌毛粘附因子基因（F18、F4）的菌株占比為54.17%；在檢出eae基因的菌株中沒(méi)有檢測(cè)到F4基因。大腸桿菌對(duì)氯霉素、四環(huán)素、氨芐西林和鏈霉素表現(xiàn)出高的耐藥性，對(duì)3種及以上抗生素產(chǎn)生耐藥性的大腸桿菌菌株數(shù)占總菌株數(shù)的86.27%。

關(guān)鍵詞：藏仔豬；腹瀉源；大腸桿菌（Escherichia coli）；毒力基因；耐藥性；菌毛粘附因子基因；非菌毛粘附因子基因

中圖分類號(hào)：S828? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）06-0156-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.025 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Detection and drug resistance analysis of virulence and adhesion factor genes of

Escherichia coli from Tibetan piglets with diarrhea under house feeding conditions

LI Long1， TAN Zhan-kun2， LI Wen-feng1， LIU Suo-zhu2

（ 1. College of Animal Engineering， Yangling Vocational & Technical College， Yangling? 712100， Shaanxi， China；2.College of Animal Science， Xizang Agricultural and Animal Husbandry University， Linzhi? 860000， Tibet， China）

Abstract： To effectively prevent and treat diarrhea in Tibetan piglets， PCR and Kirby Bauer paper diffusion methods were used，the virulence genes， adhesion factor genes and drug resistance of 102 strains of Escherichia coli from Tibetan piglets with diarrhea in Linzhi， Xizang were detected. The detection results of virulence genes and pili adhesion factor genes in Escherichia coli showed that the pili adhesion factor gene with the highest detection rate was F18 （45.10%）， followed by F4 （15.69%）， and no F41 gene was detected in all strains； among the 102 strains， the pili adhesion factor gene was not detected in 37 strains. The gene with the highest detection rate among virulence genes was Stx2e （25.49%）， followed by the STb：EAST-1 gene （21.57%） and the STa：STb gene （17.65%）. The detection results of Escherichia coli pili adhesion factor genes and non pili adhesion factor genes showed that 44.73% of the strains containing AIDA-1 gene had pili adhesion factor genes （F18， F4）， and 54.17% of the strains containing paa gene had pili adhesion factor genes （F18， F4）；no F4 gene was detected in the strains that the eae gene was detected. Escherichia coli exhibited high drug resistance to chloramphenicol， tetracycline， ampicillin， and streptomycin， with 86.27% of the total bacterial strains exhibiting resistance to three or more antibiotics.

Key words： Tibetan piglets； diarrhea source； Escherichia coli； virulence genes；drug resistance； pili adhesion factor genes； non pili adhesion factor genes

致病性大腸桿菌（Escherichia coli）是引起仔豬腹瀉的一種常見(jiàn)病原微生物，仔豬腹瀉具有高發(fā)病率和死亡率的特點(diǎn)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前仔豬致病性大腸桿菌主要有產(chǎn)毒性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、腸致病性大腸桿菌（Enteropathogenic Escherichia coli， EPEC）和Vero毒素大腸桿菌（Verotoxigenic Escherichia coli， VTEC）。不同類型致病性大腸桿菌的區(qū)分主要依據(jù)其所分泌的毒力基因和毒性機(jī)制，如ETEC分泌熱不穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定毒素（Sta和Stb）、EPEC分泌緊密粘附素（Intimin）、VTEC分泌Vero毒素VT1和VT2［1］。

抗生素在養(yǎng)豬業(yè)中發(fā)揮預(yù)防和治療疾病的重要作用，2020年前中國(guó)通過(guò)在飼料中添加抗生素類添加劑來(lái)保障豬的健康和促生產(chǎn)。長(zhǎng)期低劑量在飼料中添加抗生素造成大量耐藥菌產(chǎn)生和抗生素殘留，嚴(yán)重危害到人類的公共安全和食品衛(wèi)生，因此中國(guó)在2020年1月1日起全面禁止飼料中添加抗生素。

由于耐藥菌的產(chǎn)生與擴(kuò)散，許多國(guó)家已經(jīng)開(kāi)始對(duì)細(xì)菌耐藥性展開(kāi)監(jiān)測(cè)，如丹麥、日本和加拿大等［2］。致病性大腸桿菌毒力基因和耐藥基因更新頻率會(huì)隨著時(shí)間和地區(qū)的變化而改變［3］。因此對(duì)其毒力基因和耐藥性的監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要。致病性大腸桿菌引起藏仔豬流行性腹瀉、黃痢、白痢和豬水腫病，其發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重制約藏豬養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。西藏林芝市舍飼條件下藏豬源致病性大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型為O8、O64、O138、O107、O19、O125和O115等［3］，并且在西藏多個(gè)地區(qū)散養(yǎng)藏豬腹瀉樣品中檢測(cè)出毒力基因［4，5］，但目前關(guān)于西藏林芝市舍飼條件下藏仔豬腹瀉源大腸桿菌的毒力基因檢測(cè)與耐藥性分析還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在調(diào)查西藏主要的藏豬飼養(yǎng)區(qū)林芝市舍飼條件下藏仔豬腹瀉源大腸桿菌毒力基因檢測(cè)和耐藥性流行趨勢(shì)，為該地區(qū)仔豬致病性大腸桿菌的防治和臨床抗生素的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

2019年1月至2021年12月從西藏自治區(qū)林芝市藏豬養(yǎng)殖場(chǎng)無(wú)菌采集新鮮仔豬腹瀉糞便，采集樣品53份。新鮮糞樣采用麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行大腸桿菌初篩，分離純化的菌株進(jìn)一步通過(guò)16s rRNA序列分析鑒定為大腸桿菌，共分離大腸桿菌102株，分離菌株加入50%甘油后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與設(shè)備

麥康凱培養(yǎng)基、蛋白胨、酵母提取物等均購(gòu)自陜西吉爾泰生物科技有限公司，細(xì)菌DNA提取試劑盒（OMEGA，D3350-01）購(gòu)自山西諾其爾生物科技有限公司，引物合成和基因測(cè)序?yàn)槟暇┙鹚谷鹕锟萍加邢薰尽?/p>

C1000型PCR儀購(gòu)自山西諾其爾生物科技有限公司，SNP-250型全自動(dòng)生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏儀器設(shè)備有限公司，SW-CG-1FD型無(wú)菌操作臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 大腸桿菌毒力基因檢測(cè)

以大腸桿菌DNA為模板進(jìn)行毒力基因（LT、STa、STb、Stx2e和EAST-1）、菌毛粘附因子基因（F4、F5、F6、F18和F41）和非菌毛粘附因子基因（AIDA-1、paa、eae）的PCR擴(kuò)增。參考文獻(xiàn)［2，6，7］合成引物序列，具體序列信息如表1所示。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，滅菌去離子水6 μL。擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 大腸桿菌耐藥性分析

利用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法對(duì)分離的大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦標(biāo)準(zhǔn)［8］，多黏菌素藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定參照歐洲抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)委員會(huì)推薦標(biāo)準(zhǔn)［9］。當(dāng)菌株有3種及以上抗生素超過(guò)推薦耐藥標(biāo)準(zhǔn)時(shí)就認(rèn)定為多重耐藥菌［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒力基因與菌毛粘附因子基因檢出率分析

大腸桿菌毒力基因和菌毛粘附因子基因檢出結(jié)果如表2所示。檢出率最高的菌毛粘附因子基因是F18（45.10%），其次是F4基因（15.69%）；只有2株菌株檢出F5基因，1株菌株同時(shí)檢出F18和F4基因，所有菌株均未檢出F41基因；102株菌株中有37株菌株未檢出菌毛粘附因子基因。毒力基因中檢出率最高的是Stx2e基因（25.49%），其次為STb：EAST-1基因（21.57%）和STa：STb基因（17.65%）。

2.2 菌毛粘附因子基因和非菌毛粘附因子基因檢出率分析

大腸桿菌菌毛粘附因子基因和非菌毛粘附因子基因檢出結(jié)果如表3所示。在分離到的102株菌株中，38株檢出AIDA-1基因，24株檢出paa基因，只有1株檢出eae基因。在檢出AIDA-1基因的菌株中菌毛粘附因子基因（F18、F4）的菌株占比為44.73%，其中F18占比為42.10%，F(xiàn)4占比為2.63%；在檢出paa基因的菌株中菌毛粘附因子基因（F18、F4）的菌株占比為54.17%；在檢出eae基因的菌株中沒(méi)有檢測(cè)到F4基因。

2.3 耐藥性分析

由表4可知，102株大腸桿菌對(duì)氯霉素、四環(huán)素、氨芐西林和鏈霉素的耐藥率均大于80.0%，分別為88.2、86.3%、84.3%和80.4%。其次為慶大霉素、新霉素、頭孢噻吩、多黏菌素和環(huán)丙沙星，分別為40.2%、35.3%、23.5%、22.5%和19.6%。對(duì)頭孢唑啉、頭孢吡肟、阿莫西林和恩諾沙星的耐藥率均低于10.0%。

由表5可知，無(wú)耐藥性的菌株占總菌株數(shù)的2.94%，對(duì)3種及以上抗生素產(chǎn)生耐藥性的大腸桿菌菌株數(shù)占總菌株數(shù)的86.27%，其中3耐、4耐和5耐的菌株數(shù)較多，分別為31、26、24株，分別占總菌株數(shù)的30.39%、25.49%和23.53%。

3 討論

大腸桿菌在不同地區(qū)和不同時(shí)期表現(xiàn)出不同的毒力類型［11］。本研究共分離102株藏仔豬腹瀉源大腸桿菌，至少含有一種毒力基因的菌株高于畢斕婷等［12］和張敏等［13］分別在吉林省和四川省豬腹瀉源大腸桿菌毒力基因的檢出率。同時(shí)畢斕婷等［12］發(fā)現(xiàn)在吉林省豬場(chǎng)分離的腹瀉源大腸桿菌毒力基因EAST-1的檢出率最高（32%），本研究毒力基因中檢出率最高的是Stx2e基因（25.49%），其次為STb：EAST-1基因（21.57%）和STa：STb基因（17.65%）。這可能與不同地區(qū)豬場(chǎng)所采取的免疫措施和生物安全手段不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)含STb：EAST-1毒力基因同時(shí)不含菌毛粘附因子基因的菌株檢出率最高，含有STb：EAST-1毒力基因的大腸桿菌致病性更強(qiáng)，更容易誘發(fā)仔豬腹瀉［14］。

大腸桿菌菌毛粘附因子基因F18已被證實(shí)與水腫病密切相關(guān)，藏仔豬在感染致病性大腸桿菌時(shí)可能引起水腫病高發(fā)。不含菌毛粘附因子基因的大腸桿菌有37株，這可能與菌毛粘附因子抗原F4和F18的疫苗廣泛使用有關(guān)，這類疫苗的廣泛使用會(huì)引起大腸桿菌變異，產(chǎn)生新的未知菌毛粘附因子。

在對(duì)非菌毛粘附因子基因的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)AIDA-1檢出率高的菌株，F(xiàn)18的檢出率同樣很高。Niewerth等［15］的研究同樣發(fā)現(xiàn)AIDA-1與F18之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，同時(shí)AIDA-1和F18增加人與豬之間交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)道顯示paa與F4的關(guān)聯(lián)性也很高［16］，與本研究結(jié)果相似。目前關(guān)于paa基因在致病性大腸桿菌中的作用還不是很清楚，但已有研究發(fā)現(xiàn)在含有paa基因的大腸桿菌中水平基因轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著提高［17］。eae基因在大腸桿菌對(duì)腸黏膜細(xì)胞粘附和入侵方面發(fā)揮重要作用，但在本研究中僅發(fā)現(xiàn)1株大腸桿菌含有eae基因。

耐藥率檢測(cè)結(jié)果顯示，藏仔豬腹瀉源大腸桿菌對(duì)氯霉素、四環(huán)素、氨芐西林和鏈霉素4種抗生素的耐藥率均超過(guò)80.0%，對(duì)比楊海峰等［18］的研究結(jié)果。這可能是由于分離菌株的對(duì)象和地域差異造成的。對(duì)3種及以上抗生素產(chǎn)生耐藥性的大腸桿菌菌株數(shù)占總菌株數(shù)的86.27%，其中3耐、4耐和5耐的菌株數(shù)較多，分別為31、26、24株，分別占總菌株數(shù)的30.39%、25.49%和23.53%。102株菌株中6耐及以上的菌株占比較低，與楊海峰等［18］和于吉鋒等［19］的研究結(jié)論不一致，這可能與以下2個(gè)方面有關(guān)：一是西藏藏豬集約化養(yǎng)殖發(fā)展較慢，散養(yǎng)過(guò)程中無(wú)抗生素添加；二是中國(guó)2020年1月全面禁止飼料中添加抗生素，有效減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

4 小結(jié)

大腸桿菌毒力基因和菌毛粘附因子基因檢出率表明，檢出率最高的菌毛粘附因子基因是F18（45.10%），其次是F4基因（15.69%），所有菌株均未檢出F41基因。毒力基因中檢出率最高的是Stx2e基因（25.49%），其次為STb：EAST-1基因（21.57%）和STa：STb基因（17.65%）。在檢出AIDA-1基因的菌株中菌毛粘附因子基因（F18、F4）的菌株占比為44.73%，在檢出paa基因的菌株中菌毛粘附因子基因（F18、F4）的菌株占比為54.17%；在檢出eae基因的菌株中沒(méi)有檢測(cè)到F4基因。大腸桿菌對(duì)氯霉素、四環(huán)素、氨芐西林和鏈霉素表現(xiàn)出高的耐藥性；對(duì)3種及以上抗生素產(chǎn)生耐藥性的大腸桿菌菌株數(shù)占總菌株數(shù)的86.27%。這些結(jié)果對(duì)藏仔豬大腸桿菌病的防治提供了理論依據(jù)。

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