王欣雨 金鑫 杜倩笙 唐非臺 劉可可 董胤余 王曉麗

摘要：研究不同濃度（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL）絞股藍［Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino］多糖（GPP）對小鼠腹腔巨噬細胞的影響，探討GPP對機體免疫功能的調(diào)節(jié)作用及其可能的作用機制。采用中性紅法、Griess法、CCK8法、ELISA法和熒光定量PCR法檢測小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力、增殖、細胞因子（NO、LDH、TNF-α、IL-1β）的分泌量、CaM和GSα基因的表達水平。結(jié)果表明，GPP激活小鼠腹腔巨噬細胞，隨著GPP濃度的增加小鼠腹腔巨噬細胞增殖能力增強，當GPP濃度為50.0、100.0、200.0 μg/mL時，吸光度與空白對照處理相比差異顯著；GPP刺激小鼠腹腔巨噬細胞后，吞噬能力強于空白對照處理，GPP濃度為200.0 μg/mL時，小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力最強；GPP促進小鼠腹腔巨噬細胞NO、LDH、TNF-α和IL-1β的分泌；GPP上調(diào)CaM和GSα基因的表達，GPP濃度為100.0、25.0 μg/mL時CaM、GSα基因表達量分別達到最高。

關(guān)鍵詞：絞股藍［Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino］多糖（GPP）；巨噬細胞；吞噬作用；免疫功能；小鼠；腹腔

中圖分類號：S852.1；S859.7? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）06-0151-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.024 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Gynostemma pentaphyllum polysaccharides enhance the immunologic function of mouse peritoneal macrophages

WANG Xin-yu， JIN Xin， DU Qian-sheng， TANG Fei-tai， LIU Ke-ke， DONG Yin-yu， WANG Xiao-li

（College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning? 530005， China）

Abstract： In order to investigate the effects of different concentrations （12.5， 25.0， 50.0， 100.0， 200.0 μg/mL） of Gynostemma pentaphyllum polysaccharides （GPP） on mouse peritoneal macrophages， and to explore the regulatory effect of GPP on immunologic function and its possible mechanisms， the neutral red method， Griess method， CCK8 method， ELISA method， and fluorescence quantitative PCR method to detect the phagocytic ability， proliferation， the secretion of cytokines（NO，LDH，TNF-α，IL-1β）， and CaM， and GSα gene expression level of mouse peritoneal macrophages. The results showed that GPP activated mouse peritoneal macrophages， and the proliferation ability of mouse peritoneal macrophages increased with the increase of GPP concentration. When the GPP concentration was 50.0， 100.0， and 200.0 μg/mL， the absorbance showed significant differences compared to the blank control treatment；after GPP stimulation， the phagocytic ability of mouse peritoneal macrophages was stronger than that of the blank control treatment. When the GPP concentration was 200.0 μg/mL， the phagocytic ability of mouse peritoneal macrophages was the strongest；GPP promoted the secretion of NO，LDH，TNF-α， and IL-1β in mouse peritoneal macrophages； GPP upregulated CaM and GSα gene expressions. When the GPP concentration was 100.0 and 25.0 μg/mL， CaM and GSα gene expression levels had reached their highest levels respectively.

Key words： Gynostemma pentaphyllum polysaccharides （GPP）； macrophages； phagocytosis； immunologic function；mouse；peritoneum

絞股藍［Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino］ 是一種多年生藥用草本植物，葫蘆科，又稱七葉膽、七葉參、甘茶蔓［1］。絞股藍是一種傳統(tǒng)的名貴中藥，具有降低膽固醇和甘油三酯水平、生津、調(diào)節(jié)血壓、增強免疫力、治療胃炎、減輕慢性支氣管炎和哮喘等功效［2，3］。絞股藍含有多種生物活性成分，絞股藍多糖（Gynostemma pentaphyllum polysaccharides，GPP）就是其中之一。近年來，已經(jīng)有越來越多的證據(jù)表明絞股藍多糖有降低患心血管疾病的風險，具有降低血糖、抗炎、抗癌、保護肝臟、低毒、抗胃潰瘍、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化活性和治療高脂血癥的作用［4，5］。

巨噬細胞是機體免疫系統(tǒng)的一種重要免疫細胞，它存在于機體的幾乎所有組織中，是宿主防御外來病原體入侵和抵抗癌細胞生長的第一道防線，具有很強的吞噬功能及抗原提呈作用，在特異性免疫和非特異免疫中都發(fā)揮作用［6］。已有大量研究證實，從自然資源中分離出來的多種多糖物質(zhì)對免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的一個重要機制就是它們影響了巨噬細胞的免疫功能［7，8］，然而關(guān)于絞股藍多糖對于巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其作用機制還鮮有報道。本研究為探索不同濃度絞股藍多糖（GPP）對小鼠腹腔巨噬細胞的影響，觀察了GPP對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬、增殖能力的影響，以及對細胞因子（NO、LDH、TNF-α、IL-1β）分泌量和CaM、GSα基因表達的影響，為絞股藍多糖的新型抗炎及免疫調(diào)節(jié)的藥物開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與腹腔巨噬細胞的制備

SPF級健康昆明系小白鼠（許可證編號：SYXK桂2014-0001）70只，4～5周齡，體重（18±1）g，雌雄各占50%，購于廣西醫(yī)科大學動物實驗中心。適應性飼養(yǎng)3 d后將小鼠處死，使用75%乙醇浸泡消毒，腹腔注入5 mL PBS緩沖液，輕揉腹部1～2 min后收集腹腔液，1 000 r/min離心 5 min，棄上清液收集巨噬細胞，臺盼藍染色活細胞數(shù)>95%，用含10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2×109個/L。以每孔100 μL加樣于96孔板中，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后用PBS洗去未貼壁的細胞，即得純化的小鼠腹腔巨噬細胞。

1.2 試驗分組

1）空白對照組：培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，不加脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）和GPP。

2）LPS處理（陽性對照）：以含10.0 μg/mL LPS的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞。

3）GPP處理：分成5個梯度組，GPP濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL。

1.3 巨噬細胞吞噬功能檢測

每組細胞設(shè)6個復孔，置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，每孔加入0.1%中性紅溶液100 μL后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄上清液，用PBS洗3次，每孔加入100 μL細胞溶解液，4 ℃冰箱過夜，待細胞溶解后在酶標儀492 nm處測定吸光度（A）［9］。

1.4 巨噬細胞增殖檢測

每組細胞6復孔，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK8，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后取出培養(yǎng)板，在酶標儀492 nm處測定吸光度［10］。

1.5 巨噬細胞NO含量檢測

每組細胞設(shè)6個復孔，按照Griess法繪制亞硝酸鹽與吸光度的標準曲線，吸取上清液檢測NO分泌情況，在酶標儀540 nm波長處測吸光度，通過標準曲線計算各處理組培養(yǎng)液中上清液的NO含量［11］。

1.6 巨噬細胞LDH、TNF-α、IL-1β含量檢測

每組細胞設(shè)6個復孔，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，吸取上清液，以雙抗夾心ELISA法測定培養(yǎng)上清液中LDH、TNF-α和IL-1β的含量，操作步驟按檢測試劑盒的說明書進行。

1.7 巨噬細胞CaM、GSα基因的表達

根據(jù)TransZol說明書提取巨噬細胞總RNA。通過吸光度比（260 nm/280 nm）評估RNA的數(shù)量和質(zhì)量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）合成互補DNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。使用CFX96TM實時系統(tǒng)（美國BIO-RAD）通過定量實時PCR（qPCR）評估基因表達。qPCR引物參照Davis等［12］、郭文瑞等［13］的文獻，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，β-肌動蛋白管家基因被用作qPCR反應的內(nèi)部對照，如表1所示。采用以2-△△ct分析法進行目的基因相對表達量的計算。

1.8 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差（x±s）表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析法（ANOVA），應用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GPP對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

采用中性紅吞噬法對不同濃度GPP處理的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能進行檢測，結(jié)果如表2所示。LPS處理和GPP處理的腹腔巨噬細胞吞噬能力均有所增加，LPS處理與空白對照處理相比吸光度差異顯著（P<0.05）。GPP濃度為200.0 μg/mL時，小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力最強，其吸光度與空白對照處理及其他GPP處理相比差異顯著（P<0.05），濃度為12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL的GPP處理間吸光度無顯著差異，且不同濃度的GPP對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力無明顯的量效關(guān)系。

2.2 GPP對小鼠腹腔巨噬細胞增殖的影響

為了探究不同濃度GPP對小鼠腹腔巨噬細胞增殖的影響，本研究用CCK8測定巨噬細胞的增殖能力，結(jié)果如表3所示。LPS處理和不同濃度的GPP處理均可以促進小鼠腹腔巨噬細胞的增殖，且隨著GPP濃度的增加，小鼠腹腔巨噬細胞增殖能力增強。其中LPS處理與空白對照處理相比吸光度差異顯著（P<0.05）；當GPP的濃度為50.0、100.0、200.0 μg/mL時，吸光度與空白對照處理相比差異顯著（P<0.05），但這3個處理間差異不顯著。

2.3 GPP對小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子的影響

巨噬細胞在LPS和GPP處理培養(yǎng)48 h后，取細胞培養(yǎng)上清液，測定NO、LDH、TNF-α和IL-1β的含量，結(jié)果如圖1所示。GPP促進巨噬細胞NO、LDH、TNF-α和IL-1β的分泌。GPP處理的NO含量均顯著低于LPS處理（P<0.05），GPP處理的NO含量均顯著高于空白對照處理（P<0.05），且NO含量隨著GPP濃度的增加而增加。當GPP濃度達25.0 μg/mL時，巨噬細胞分泌的LDH趨于穩(wěn)定，GPP濃度為50.0、100.0 μg/mL時，LDH含量均顯著高于空白對照處理（P<0.05）。當GPP濃度為25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL時，巨噬細胞TNF-α、IL-1β的含量均顯著高于空白對照處理（P<0.05），且TNF-α、IL-1β含量隨著GPP濃度的增加而增加，當濃度達100.0 μg/mL時達到最大值，此時與LPS處理的TNF-α、IL-1β含量相當，當GPP濃度繼續(xù)增加時，TNF-α、IL-1β含量下降。

2.4 GPP對小鼠腹腔巨噬細胞CaM、GSα基因表達的影響

為探究不同濃度GPP對小鼠腹腔巨噬細胞CaM、GSα基因mRNA表達的影響，將巨噬細胞在不同濃度GPP或LPS中培養(yǎng)48 h，提取細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用熒光定量PCR法檢測CaM、GSα基因的表達量，結(jié)果如圖2所示。GPP和LPS處理均可以顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞CaM基因的表達，GPP處理（25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL）的CaM基因表達量顯著高于空白對照處理（P<0.05），其中GPP濃度為100.0 μg/mL時CaM基因表達量達到最大值，隨著GPP濃度的增加，CaM基因表達量降低。GPP和LPS處理均可以顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞GSα基因的表達（P<0.05），GPP濃度在25.0 μg/mL時小鼠腹腔巨噬細胞GSα基因的表達量最高。

3 討論

已有研究表明多糖具有促進機體免疫器官生長、激活免疫細胞和補體系統(tǒng)、釋放免疫功能因子等免疫調(diào)節(jié)活性，是天然的免疫調(diào)節(jié)劑［14］。巨噬細胞是免疫系統(tǒng)的重要效應細胞，在宿主免疫應答和抵抗多種病原體感染中發(fā)揮著重要作用［15］。一方面，它具有抗原提呈、吞噬病原體、分泌多種細胞因子、激活免疫應答等生物活性；另一方面，它會釋放多種炎癥因子、參與炎癥反應、加重炎癥。

多糖主要通過影響巨噬細胞活性氧和細胞因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)［16，17］。細胞因子是眾所周知的免疫因子，一旦被誘導，可以觸發(fā)免疫系統(tǒng)的疾病反應，并有助于增強免疫反應。已有研究表明，茶多糖可促進小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能，提高腹腔巨噬細胞上調(diào)iNOS、TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平［18］；脹果甘草多糖能增強RAW 264.7巨噬細胞增殖率和吞噬能力，促進TNF-α、IL-1β、NO及NOS釋放，上調(diào)iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA水平，從而增強RAW 264.7巨噬細胞的免疫功能［19］；荊芥多糖可以增強巨噬細胞的胞飲和吞噬活性，促進炎癥因子（ROS、PTGS2、iNOS、IL-6、IL-10和TNF-α）和趨化因子（CCL2和CXCL10）的表達和分泌［20］；玉米須多糖能抑制LPS誘導的ROS和NO積累，減少促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-18）的產(chǎn)生和炎性介質(zhì)（iNOS）的表達，具有改善炎癥反應的作用［21］。此外，滸苔多糖［22］、防風多糖［23］、霍山石斛多糖［24］及松花粉硫酸多糖［25］均可顯著促進巨噬細胞分泌炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-12。而本研究結(jié)果也表明，GPP可提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能和增殖能力，促進NO、IL-1β、TNF-α和LDH的分泌，從而增強巨噬細胞的免疫功能。GPP可以激活巨噬細胞并產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，但其激活巨噬細胞的具體機制有待進一步研究。

CaM和GSα的生理功能已被廣泛研究，CaM參與的生理過程包括酶活性調(diào)節(jié)、細胞分裂和分化、細胞骨架和細胞運動、細胞核內(nèi)酶系統(tǒng)和基因表達等［26］。細胞內(nèi)CaM含量的變化及其結(jié)構(gòu)和功能的異常與某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［27］。G蛋白信號通路是介導炎癥反應許多信號的關(guān)鍵“網(wǎng)關(guān)”［13］，從細胞外到細胞內(nèi)的免疫反應、炎癥介質(zhì)和蛋白酶合成。郭文瑞等［28］發(fā)現(xiàn)牛磺膽酸顯著促進小鼠腹腔巨噬細胞中CaM和GSα基因的表達。本研究結(jié)果表明，不同濃度GPP作用于小鼠腹腔巨噬細胞后，CaM和GSα mRNA水平顯著升高，提示GPP可能通過上調(diào)CaM和GSα的mRNA水平來影響巨噬細胞增殖和細胞因子分泌。本研究結(jié)果為進一步研究GPP抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用機制奠定了良好的試驗基礎(chǔ)。

綜上所述，GPP可刺激小鼠腹腔巨噬細胞增殖，從而提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，GPP促進巨噬細胞NO、LDH、TNF-α和IL-1β的分泌，可上調(diào)CaM和GSα基因的表達，從而增強巨噬細胞的免疫功能。

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