蔣玲艷 王林果 張在 于樂 秦張善

摘要：為研究雞新城疫滅活疫苗免疫后抗體消長規(guī)律及血清抗體穩(wěn)定性，采用血凝抑制試驗方法測定新城疫病毒-禽流感病毒（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗免疫雞血清新城疫抗體效價及經(jīng)室溫、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃反復凍融和加熱等不同方式處理的血清中新城疫抗體效價。結果表明，試驗雞于1日齡和21日齡用滅活疫苗免疫兩次后，在第二次免疫后14 d新城疫抗體平均效價達到8.1 log2，35 d達到最高值為8.9 log2；免疫后70 d抗體效價保持在7.8 log2，且自二免后14～70 d，新城疫抗體效價維持在7.8 log2～8.9 log2。血清新城疫抗體在室溫和4 ℃相對穩(wěn)定，室溫下放置13 d對新城疫抗體效價幾乎無影響；但4 ℃保存9 d，對新城疫抗體效價有一定影響，且差異顯著（P<0.05）；56 ℃下30 min對新城疫抗體效價無影響；反復凍融3次對新城疫抗體效價影響極顯著（P<0.01）。肉雞于1日齡和21日齡用滅活疫苗免疫兩次后，新城疫抗體水平高，且高水平抗體維持時間長。雞血清新城疫抗體可耐56 ℃加熱，室溫保存活性穩(wěn)定，反復凍融則影響其效價。

關鍵詞：雞新城疫；HI試驗；抗體效價；滅活疫苗；抗體穩(wěn)定性；血清保存

中圖分類號：S831.1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）06-0137-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.022 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Regularity of antibody fluctuation of Newcastle disease and serum antibody stability

JIANG Ling-yan1， WANG Lin-guo2， ZHANG Zai1， YU Le1， QIN Zhang-shan1

（1.College of Animal Science and Technology， Guangxi Vocational University of Agriculture， Nanning? 530007， China；

2. PuLike Bio-Engineering Co.， LTD.， Luoyang? 471000， Henan， China）

Abstract： In order to study the rule of antibody fluctuation and stability of Newcastle disease antibody activity in serum after immunization with inactivated Newcastle disease vaccine， the hemagglutination inhibition test was used to determine the titers of Newcastle disease antibody in serum of chickens immunized with Newcastle disease virus and avian influenza virus （H9 subtype） dual inactivated vaccine. The titers of Newcastle disease antibody in serum treated by different methods such as room temperature， 4 ℃ storage，? ? ? -20 ℃， -80 ℃ freeze-thaw and heating were determined. The results showed that the average titer of Newcastle disease antibody reached 8.1 log2 at 14 d and 8.9 log2 at 35 d after the second immunization. The antibody titer remained 7.8 log2 at 70 d after immunization， and the antibody titer was 7.8 log2 to 8.9 log2 from 14 d to 70 d after the second immunization. The serum Newcastle disease antibody was relatively stable at room temperature and 4 ℃， and the titer of Newcastle disease antibody was almost not affected by room temperature for 13 days. However， the titer of Newcastle disease antibody was affected by 4 ℃ for 9 days， and the difference was significant （P<0.05）. The titer of Newcastle disease antibody was not affected by 56 ℃ for 30 min. Repeated freeze-thaw for three times had a significant effect on the antibody titer of Newcastle disease （P<0.01）. The results showed that the level of Newcastle disease antibody was high and the maintenance time of the high level of Newcastle disease antibody was long after the broilers were immunized with inactivated vaccine twice at 1 and 21 days of age. Newcastle disease antibody of chicken blood could resist heating at 56 ℃， and its activity was stable at room temperature. Repeated freezing and thawing could affect its titer.

Key words： Newcastle disease； hemagglutination inhibition test； antibody titer； inactivated vaccine； antibody stability； preservation of serum

雞新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的嚴重威脅養(yǎng)雞生產(chǎn)的主要疫病。雞新城疫抗體（Newcastle disease antibody，ND Ab）水平的檢測既是雞場ND免疫效果監(jiān)測和制定ND免疫方案的主要參考依據(jù)，也是臨床NDV感染診斷的輔助手段［1］。血清是臨床雞ND抗體水平檢測最常見的送檢樣品。送檢血清樣品的保存方法、保存時間和運輸方式直接影響樣品質量及檢測結果。因此，送檢樣品的保存方法、保存時間和運送方式是檢測人員十分重視的問題。

雞ND母源抗體的消長規(guī)律已有不少研究報道［2，3］，而雞ND滅活疫苗免疫后抗體消長因飼養(yǎng)方式、品種、疫苗類型和免疫方案不同而具有顯著差異。掌握針對雞品種、飼養(yǎng)方式的新城疫免疫后抗體消長規(guī)律，對于制定科學的ND免疫方案尤為重要。本研究結合慢速型肉雞生產(chǎn)實際需要，采用血凝抑制（HI）試驗，對雛雞新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗免疫后血清中ND Ab的消長規(guī)律及雞血清中ND Ab活性的穩(wěn)定性進行研究，可為養(yǎng)雞生產(chǎn)中科學合理地制定ND的免疫防控方案及ND Ab檢測中選擇送檢血清樣品的保存與運輸方式提供參考，也可為抗體結構分析、相關功能的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1日齡健康肉雛雞（麻黃土雞）105只，購自廣西富鳳農牧集團，采用籠養(yǎng)方式飼養(yǎng)在廣西農業(yè)職業(yè)技術大學動物養(yǎng)殖場。

1.2 疫苗和試劑

新城疫病毒（LaSota株）-禽流感病毒（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗（批號為160022133），購自普萊柯生物工程有限公司；新城疫血凝抑制試驗用抗原、陽性血清與陰性血清（批號為154028082），購自青島立見生物科技有限公司。

1.3 免疫

105只1日齡肉雛雞苗，隨機選取5只測定母源抗體；其余100只肉雛雞頸部皮下接種新城疫病毒（LaSota株）-禽流感病毒（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗0.3 mL/只。21日齡時用同樣方式第二次接種新城疫病毒（LaSota株）-禽流感病毒（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗0.5 mL/只。

1.4 血清分離

二免后3周開始，每周固定時間隨機采集21只雞翅靜脈血，待血液凝固后收集血清，于3 000 r/min離心5 min，取上清液保存，用于ND Ab效價測定，連續(xù)測定9周。1日齡雛雞通過頸靜脈收集血清。

1.5 ND Ab效價測定

ND Ab效價采用血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI）進行測定，按照國家標準《新城疫診斷技術》（GB/T16550—2020）執(zhí)行。記錄測定數(shù)據(jù)，計算HI（log2）結果平均值?？贵w活性穩(wěn)定性試驗：取HI測定為ND Ab陽性且HI效價為10log2血清樣品5個，用2 mL離心管分裝，進行ND Ab穩(wěn)定性試驗。設置室溫放置、4 ℃存放、-20 ℃反復凍融、-80 ℃反復凍融和56、65、72 ℃加熱等不同條件處理血清，然后用HI試驗測定ND Ab效價。

1.6 數(shù)據(jù)處理

雞ND Ab效價HI測定值采用Excel 表格整理，采用GraphPad Prism 6.01軟件進行統(tǒng)計分析，結果以HI（log2）平均值±標準差表示，差異顯著性分析采用t檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 雛雞母源抗體效價的測定結果

隨機取1日齡雛雞5只，頸靜脈放血收集血清后，HI試驗測定ND母源抗體效價，結果分別為? ? ? ?2 log2、3 log2、4 log2、4 log2、6 log2，平均效價為3.8 log2。

2.2 雞滅活疫苗免疫后ND Ab效價的測定結果

二免后，分別于14、21、28、35、42、49、56、63、70 d隨機采集21只雞靜脈血，采用HI測定ND Ab效價，并計算HI（log2）平均值。結果表明，二免后14 d 雞35日齡時，雞ND Ab效價HI測定平均值達到8.1 log2，二免后35 d左右達到最高水平8.9 log2，二免后70 d時ND Ab效價HI測定平均值仍保持在7.8 log2（表1）。但在91 d的試驗期，并未發(fā)現(xiàn)新城疫滅活疫苗免疫后抗體消長的規(guī)律，隨日齡的增加，ND Ab效價表現(xiàn)出一定的無規(guī)則波動性。二免后14 d時有9.5%（2/21）的個體ND Ab效價低于保護臨界值4 log2，隨后每周檢測雞的ND Ab效價HI測定值均分布在5 log2～10 log2，新城疫個體免疫合格率和群體免疫合格率均達到100%。雞ND免疫后抗體消長規(guī)律及個體ND Ab效價HI測定值分布范圍見表1。

2.3 抗體穩(wěn)定性測定

2.3.1 室溫放置和4 ℃保存對血清ND Ab效價的影響 將血清首次測定ND Ab效價后，取HI測定值為10 log2的5個血清樣品，每個血清樣品分裝后分別于室溫（25～35 ℃）和4 ℃放置不同時間，測定抗體效價，計算平均值。結果表明，雞血清ND Ab在室溫下很穩(wěn)定，夏季炎熱天氣，室溫放置6 d對ND Ab效價幾乎沒有影響，室溫13 d對ND Ab效價僅有輕微影響（P>0.05），HI測定平均值僅降低0.4 log2；雞血清ND Ab在4 ℃保存相對穩(wěn)定，反復從4 ℃拿出室溫放置后進行HI測定，對ND Ab效價有顯著影響（P<0.05），但HI測定平均值僅降低0.6 log2，結果見表2。

2.3.2 -20 ℃反復凍融和-80 ℃反復凍融對血清ND Ab效價的影響 用HI試驗測定血清中ND Ab效價，取效價為10 log2的血清樣品5個，分裝后于4 ℃保存24 h后分別轉至-20 ℃和-80 ℃超低溫保存。將-20 ℃保存的樣品分別于保存1、2、4 d取出融解后，測定ND Ab效價，共反復凍融3次；-80 ℃保存的樣品分別于6、8、9 d后拿出室溫融解后測定ND Ab效價。測定5個血清樣品反復凍融后的ND Ab效價。結果表明，反復凍融對ND Ab效價有顯著影響；-20 ℃和-80 ℃反復凍融3次以上對雞ND Ab效價有極顯著的影響（P<0.01），-20 ℃反復凍融3次ND Ab HI平均值降低1.6 log2；? -80 ℃凍融2次對ND Ab效價影響顯著（P<0.05），反復凍融3次對ND Ab效價影響極顯著（P<0.01），ND Ab HI平均值降低1.2 log2，結果見表3。

2.3.3 加熱對血清ND Ab效價的影響 分離血清測定ND Ab效價后，隨機取不同效價的6個樣品，將血清樣品等量分裝后，分別進行56 ℃下30 min、65 ℃下30 min、72 ℃下1 min、72 ℃下5 min、72 ℃下10 min水浴處理，然后測定ND Ab效價。結果表明，56 ℃水浴加熱30 min對血清中ND Ab效價完全無影響；65 ℃水浴30 min對ND Ab效價影響極顯著（P<0.01），ND Ab效價平均值由原來的8.7 log2降低到6.2 log2，降幅明顯。血清ND Ab對72 ℃水浴敏感，72 ℃水浴1 min可使其效價平均值明顯下降，72 ℃水浴5 min使ND Ab效價由8.7 log2下降到4.7 log2，影響極顯著（P<0.01）；72 ℃水浴5 min以上，血清出現(xiàn)果凍樣凝固，很難吸出液體狀血清，結果見表4。

3 小結與討論

3.1 雞ND滅活疫苗免疫后抗體消長規(guī)律

對于無ND母源抗體的SPF雞，利用ND滅活疫苗免疫，通常在免疫后4～7 d可檢測到抗體上升，且抗體產(chǎn)生速度受首免日齡和疫苗種類的影響較小，免疫后2周內抗體效價平均每日上升0.40 log2［4，5］。

然而，ND是雞場常規(guī)免疫防控的重要疾病，種雞、肉雞均按照免疫方案進行免疫。因此，雛雞均具有一定水平的ND母源抗體，母源抗體的高低與種雞免疫程序及種雞日齡有關。出殼后雛雞ND母源抗體的自然消長規(guī)律主要有下坡勢和單峰勢，以下坡式為主，在21日齡以內，母源抗體的自然消退速度為平均每日下降約0.3 log2［4，6］。母源抗體可能導致疫苗免疫后效果不一，因此合理制定疫苗免疫方案非常重要。一般母源抗體效價越高，對免疫效果影響越大，免疫后21 d的抗體效價越低［4，7，8］。研究表明，ND母源抗體水平低于5log2的雛雞，對ND弱毒疫苗的免疫效果影響不顯著［2］。母源抗體一般在14～21日齡時降至3log2以下［9-13］，對ND疫苗免疫效果無明顯影響，且不能保護雞群受強毒的攻擊［9］。而滅活疫苗中的抗原被油佐劑包被，受母源抗體的干擾較小，在雞體內可緩慢釋放持續(xù)剌激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體，且維持時間長。

3.2 ND抗體活性穩(wěn)定性

雞血清ND Ab在室溫和低溫環(huán)境中穩(wěn)定性較高，室溫放置13 d對ND Ab效價影響較小，而4 ℃保存9 d對ND Ab效價的影響具有統(tǒng)計學差異，但實際HI平均值變化不超過１log2。因此，臨床送檢ND Ab的血液樣品，待血清分離后，可常溫運輸。雞血清4 ℃保存測定結果與李愛敏等［14］報道新冠病毒總抗體4 ℃保存30 d對抗體檢測結果沒有影響的結論基本一致，但4 ℃保存9 d時ND Ab效價HI平均值降低0.6 log2，可能與反復將樣品從4 ℃取出測定造成的較大溫度變化及檢測加樣時血清是否回溫到室溫有關。加樣時血清溫度高低對測定結果有輕微影響，加樣時血清溫度低時，HI測定結果偏低，部分樣品約有1log2的差異。因此，血清ND Ab效價的穩(wěn)定性與保存血清的溫度是否恒定密切相關，血清樣品保存溫度穩(wěn)定可以使抗體活性更持久穩(wěn)定。

凍融對血清中ND Ab效價HI測定值有較大影響，凍融次數(shù)越多，HI測定值越低。-20 ℃和-80 ℃反復凍融3次以上，對ND Ab效價有十分顯著的影響。江雅平等［15］報道低溫凍融對丙型肝炎病毒抗體檢測結果有明顯影響，該結果與本研究基本一致，可能凍融對抗體活性結構域的結構有影響，其確切機理有待進一步研究。

水浴加熱對雞血清ND Ab效價的影響與加熱溫度密切相關，常見的牛奶消毒溫度56 ℃下30 min對ND Ab效價完全沒有影響。當溫度升高到65 ℃時加熱30 min對ND Ab效價有顯著影響。72 ℃加熱1 min，抗體HI效價明顯下降，72 ℃水浴5 min以上時，則血清變成果凍樣，說明72 ℃高溫可使血清中蛋白質變性凝固?？贵w是免疫球蛋白，其免疫保護作用和活性穩(wěn)定結構具有廣泛的應用價值［16］。

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