摘 要 貓兒山小鯢（Hynobius maoershanensis）已知僅分布于廣西貓兒山國家級自然保護(hù)區(qū)。2022 年3 月，在廣西壯族自治區(qū)桂林市全州天湖國家濕地公園（26°6'21″ N，110°54'14″ E；1 680 m）采集到小鯢標(biāo)本，經(jīng)鑒定為貓兒山小鯢，這是繼2006年于貓兒山保護(hù)區(qū)首次發(fā)現(xiàn)后的第2處分布新紀(jì)錄?；诰€粒體16S rRNA基因和COI基因片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，表明新紀(jì)錄所采小鯢標(biāo)本與貓兒山原產(chǎn)地標(biāo)本相聚構(gòu)成單系，遺傳距離0. 5%，進(jìn)一步更新了貓兒山小鯢的分布海拔范圍，較之前記錄的分布海拔1 966 m以上降至1 680 m，提示該種有更廣闊的生態(tài)位，這一發(fā)現(xiàn)對今后該物種的科學(xué)管理及保護(hù)具有重要意義。

關(guān)鍵詞：貓兒山小鯢；DNA條形碼技術(shù)；新紀(jì)錄

中圖分類號：Q958. 1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2310 - 1490（2024）- 02 - 0441 - 07

DOI：10.12375/ysdwxb.20240226

小鯢屬（Hynobius）是亞洲特有的有尾兩棲動物，現(xiàn)已知31種，占全科物種數(shù)（65種）的47. 7％［1?3］，我國現(xiàn)有小鯢屬物種12種，包括東北小鯢（H. leechii）、中國小鯢（H. chinensis）、楚南小鯢（H. sonani）、臺灣小鯢（H. formosanus）、觀霧小鯢（H. fucus）、阿里山小鯢（H. arisanensis）、義烏小鯢（H. yiwuensis）、安吉小鯢（H. amjiensis）、掛榜山小鯢（H. guabangshanensis）、貓兒山小鯢（H. maoershanensis）、南湖小鯢（H. gla?cialis）和虛竹小鯢（H. bambusicolus）［3］，其中，貓兒山小鯢為廣西壯族自治區(qū)的特有種［4］，分布十分狹窄，僅分布于廣西貓兒山國家級自然保護(hù)區(qū)海拔2 000 m的森林沼澤地及周邊地區(qū)，附近的植被多為鐵杉（Tsuga chinensis）和南方山頂矮林，棲息地植被繁茂。該物種對繁殖棲息地要求嚴(yán)格，僅在水質(zhì)清澈的靜水潭中繁殖產(chǎn)卵［5］。該物種頭較大，略扁；頭長大于寬；吻端圓，無唇褶；犁骨齒為“V”形；頭體光滑，頸褶明顯；背部中央從頭至尾基部有縱行嵴溝；掌和指、踱和趾均無掌突和踱突；前足4 指，后足5趾；體背面顏色一般為黑色或淺紫棕色，無斑紋；體腹、側(cè)呈灰色，散布許多白色小斑點(diǎn)；雄性肛部隆起，前緣有小乳突，肛孔縱裂，雌性肛孔呈圓形［5?7］。

2022年3月，在廣西桂林市全州天湖國家濕地公園湖泊淺水區(qū)采集到小鯢標(biāo)本（圖1）（標(biāo)本號TH22001，雌性）。由于小鯢屬物種均有其獨(dú)特的形態(tài)學(xué)特征，且變態(tài)發(fā)育過程中幼體與成體的形態(tài)特征差異較大，常因形態(tài)特征不穩(wěn)定等主觀因素影響鑒別［8?9］。鑒于DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定方面的準(zhǔn)確有效性［10］，通過擴(kuò)增和測序COI和16S rRNA兩種DNA條形碼序列，對全州天湖新紀(jì)錄物種進(jìn)行鑒定，同時結(jié)合形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定，確定新紀(jì)錄種為貓兒山小鯢，這是繼2006年于廣西貓兒山國家級自然保護(hù)區(qū)首次發(fā)現(xiàn)貓兒山小鯢后的第2 處分布新紀(jì)錄。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

標(biāo)本采自廣西全州天湖國家濕地公園湖泊淺水區(qū)（26°6'21″ N，110°54'14″ E）。標(biāo)本采用斷尾法取樣，保存在100%乙醇中用于DNA提取，剩余標(biāo)本固定在10% 福爾馬林中，隨后轉(zhuǎn)移至75% 乙醇溶液中，現(xiàn)保存于廣西師范大學(xué)廣西珍稀瀕危動物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1. 2 DNA 提取、擴(kuò)增及測序

采用Sanger測序法，利用Ezup柱式動物組織基因組DNA抽提試劑盒對樣品進(jìn)行DNA提取，通過對樣品的16S rRNA 基因序列（5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3'）、COI 基因序列（5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3'）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［11］，1% 瓊脂糖電泳檢測、膠回收等步驟，對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測及純化，使用3730XL測序儀對PCR產(chǎn)物測序，將獲得的COI基因序列在GenBank中進(jìn)行BLAST［12］比對，所得序列已上傳到GenBank（16S rRNA序列：OQ586670；COI基因：OQ587615）。

1. 3 系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank中下載小鯢屬部分物種的16S rRNA及COI基因序列，所有分析物種的序列相關(guān)信息如表1所示，以商城肥鯢（Pachyhynobius shangchengen?sis）、極北鯢（Salamandrella keyserlingii）為外群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。序列在BioEdit［13］中采用ClustalW比對。在PhyloSuite［14］中選擇ModelFinder模型進(jìn)行優(yōu)化。使用MrBayes 3. 2. 6［15］在GTR+1+F模型（2個馬爾可夫鏈并行運(yùn)行，2×105代）下構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹，每100代對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行抽樣，其中初始25% 的采樣數(shù)據(jù)被丟棄。使用MEGA X［16］中的Kimura雙參數(shù)模型計算小倪屬物種間的遺傳距離。

2 結(jié)果

2. 1 形態(tài)特征

標(biāo)本TH22001體型中等偏??；頭體略長于尾；頭大略扁，頭寬略小于頭長；吻端鈍圓，無唇褶，眼徑略大于鼻間距，鼻孔近吻端；舌橢圓形；犁骨齒呈“V”

形；體表光滑，頸褶明顯，背部有縱行嵴溝，體側(cè)溝肋；軀干及尾根部呈圓柱形，向后逐漸由側(cè)面變扁，尾末端鈍圓，背面體色呈黑色；腹部扁平，腹面及體側(cè)面呈灰色，散布密集白灰色小斑點(diǎn)；掌和指、踱和趾均無掌突和踱突，前足4指，指長順序：Ⅰlt;Ⅳlt;Ⅲlt;Ⅱ，后足5趾，趾長順序：Ⅰlt;Ⅴlt;Ⅱlt;Ⅳlt;Ⅲ；肛孔呈圓形（圖1）。

2. 2 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用的16S rRNA基因片段長度為609 bp，比對修剪后長度為436 bp，COI基因片段長度為709 bp，比對修剪后長度為567 bp。16S rRNA和COI基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對，均與貓兒山小鯢序列相似性最高，其中16S rRNA 序列比對相似度為99. 49%，COI序列比對相似度為99. 41%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征初步確定該物種為貓兒山小鯢。

分別利用表1 中相關(guān)物種的16S rRNA 序列和COI基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），兩種系統(tǒng)進(jìn)化樹都表明本研究所采小鯢標(biāo)本與貓兒山原產(chǎn)地標(biāo)本相聚構(gòu)成單系。分子系統(tǒng)發(fā)育分析支持采集于全州天湖的小鯢標(biāo)本為貓兒山小鯢。

2. 3 遺傳距離

基于Kimura 雙參數(shù)模型，分別用16S rRNA 和COI基因序列計算部分小鯢屬物種的遺傳距離，利用16S rRNA序列計算的結(jié)果表明，本研究所采用的小鯢屬物種間遺傳距離為0. 9%～7. 6%（表2），全州天湖的貓兒山小鯢標(biāo)本與貓兒山小鯢原產(chǎn)地標(biāo)本的遺傳距離為0. 5%，小于小鯢屬物種間的遺傳距離。表3顯示COI基因的部分小鯢屬物種間遺傳距離為3. 5%～15. 1%，全州天湖的貓兒山小鯢標(biāo)本與貓兒山小鯢原產(chǎn)地標(biāo)本的遺傳距離為0. 5%，同樣小于小鯢屬物種間的遺傳距離。

研究結(jié)果表明，16S rRNA和COI基因序列計算的遺傳距離結(jié)果與上述構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果一致，同樣支持采集于全州天湖的小鯢標(biāo)本為貓兒山小鯢。

3 討論

貓兒山小鯢現(xiàn)有記錄僅發(fā)現(xiàn)于廣西貓兒山國家級自然保護(hù)區(qū)海拔1 966 m以上的森林沼澤地及周邊地區(qū)，棲息范圍十分狹小，野外種群數(shù)量極低［5，21?22］，為貓兒山國家級自然保護(hù)區(qū)特有種。本研究新增記錄點(diǎn)為全州天湖國家濕地公園（26°6'21″ N，110°54'14″ E；1 680 m），該記錄分布海拔范圍較之前記錄的1 966 m有所擴(kuò)大，提示該種有更廣闊的生態(tài)位，隨著生物多樣性調(diào)查和研究不斷深入，新的分布區(qū)有望被發(fā)現(xiàn)。貓兒山和全州天湖國家濕地公園同屬于越城嶺山脈（圖3），越城嶺山脈是云貴高原的東南端、南嶺山系的西北支，高山地區(qū)，土壤肥沃，植被繁茂，水資源豐富，常年大霧，相對濕度大［23］，兩處記錄分布點(diǎn)的生境特點(diǎn)尤為相似，因而兩地可能有著相似的物種組成，其獨(dú)特的山地環(huán)境和適宜氣候也為貓兒山小鯢提供了良好的棲息庇護(hù)場所。同時也提示該區(qū)域兩棲動物多樣性此前可能被低估，該區(qū)域也許有著較高的兩棲動物多樣性［24?25］。

我國有尾兩棲類物種的遺傳多樣性水平普遍比較低，主要原因?yàn)樵摲N類物種進(jìn)化緩慢，適應(yīng)性差，因而許多物種數(shù)量驟減，甚至瀕臨滅絕［26］，與此同時，人類活動的日益頻繁，導(dǎo)致自然棲息地大面積縮小，環(huán)境污染、自然資源過度開發(fā)等也是造成小鯢科（Hynobiidae）動物衰退和滅絕的重要原因［27］。貓兒山小鯢遷移距離短，對環(huán)境依賴性強(qiáng)，適應(yīng)力弱，近年來，由于人類活動的影響和全球氣候的變化，導(dǎo)致其種群數(shù)量也在不斷減少［22］，而貓兒山與全州天湖國家濕地公園均屬于旅游景區(qū)，人為活動頻繁，旅游設(shè)施的建設(shè)等因素對棲息地環(huán)境的破壞力度不容小覷，隨著人類活動等因素影響的持續(xù)惡化，貓兒山小鯢的生存狀況堪憂。此次在全州天湖國家濕地公園發(fā)現(xiàn)該物種，填補(bǔ)了貓兒山小鯢現(xiàn)有紀(jì)錄單一分布的空缺，對今后研究貓兒山小鯢的地理分布和演化具有重要意義。

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