章力 魏凱 李珊珊 寧宇 路菲菲 王孝宣 國艷梅 劉磊 李鑫 杜永臣 李君明 黃澤軍

摘要：轉(zhuǎn)基因技術(shù)有助于番茄基因功能研究和遺傳改良，其中轉(zhuǎn)基因后代的篩選是一個(gè)非常重要但工作量大的環(huán)節(jié)。本研究基于番茄油體蛋白基因家族序列分析和番茄基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫SCN-TEA搜索結(jié)果，克隆了一個(gè)種子特異且高水平表達(dá)的油體蛋白基因SIOLEI（Solyc06g034040）。利用無縫克隆的方法將紅色熒光蛋白基因TagRFP的編碼區(qū)序列插入到SIOLE1基因的終止密碼子前，形成一個(gè)嵌合基因SIOLEl-TagRFP。將嵌合基因插入到pBI121雙元載體，構(gòu)建植物表達(dá)載體pSIOLEl-TagRFP，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄品種‘Money Maker，To代植株的自交種子在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出明亮紅色熒光或無熒光。PCR分子標(biāo)記進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，紅色熒光種子萌發(fā)的幼苗均存在TagRFP序列，表明在種子階段檢測紅色熒光篩選轉(zhuǎn)基因番茄后代的準(zhǔn)確率為100%。由此，本研究建立了一種利用SIOLEl-TagRFP嵌臺(tái)基因，可以通過種子紅色熒光可視化分析，簡單快速、低成本地鑒定轉(zhuǎn)基因番茄后代的方法。

關(guān)鍵詞：番茄；種子；紅色熒光蛋白；油體蛋白；轉(zhuǎn)基因鑒定

中圖分類號(hào)：S641.2：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）04-0001-08

轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及借助轉(zhuǎn)基因的基因編輯技術(shù)，促進(jìn)了植物基因功能研究，而且有助于改良植物性狀和培育優(yōu)良新品種。植物遺傳轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)化植株及其后代中外源DNA的檢測是一個(gè)十分必要的環(huán)節(jié)，但工作量大、效率有待提高。在植物的遺傳轉(zhuǎn)化工作中，常借助選擇基因和報(bào)告基因篩選轉(zhuǎn)基因植株。以卡那霉素（nptll）和潮霉素（hpt）等抗生素或者EPSPS和Bw等除草劑抗性基因作為選擇基因進(jìn)行篩選，不同植物材料對(duì)篩選劑所需的最適濃度差別較大，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，甚至有時(shí)會(huì)影響植株的正常生長。利用cus作為報(bào)告基因篩選時(shí)，需要對(duì)轉(zhuǎn)基因植株組織進(jìn)行GUS染色檢測，會(huì)破壞植物組織。

FAST（fluorescence accumulating seed technology）是一種通過種子特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光融合蛋白表達(dá)，利用種子熒光快速篩選轉(zhuǎn)基因植株的方法，最早應(yīng)用于模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）。熒光蛋白是一類在特定波長下激發(fā)強(qiáng)烈熒光的蛋白質(zhì)，可作為報(bào)告基因用于檢測基因特異性表達(dá)和融合蛋白分子的定位、遷移、構(gòu)象變化以及分子間的相互作用。紅色熒光蛋白（red fluorescem protein，RFP）是從海葵（Discosomasp sp.）中分離出的與綠色熒光蛋白（Ween fluorescent protein，GFP）同源的熒光蛋白，激發(fā)波長和發(fā)射波長均較長，其中，TagRFP的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為555 nm和584 nm，其亮度大約是mCherry蛋白的3倍，具有高pH穩(wěn)定性和熒光壽命長等特點(diǎn)，是目前所報(bào)道的相對(duì)較亮的單體紅色熒光蛋白。FAST技術(shù)將熒光蛋白作為可視化篩選標(biāo)記直接鑒定轉(zhuǎn)基因種子，方法簡便且不會(huì)對(duì)植株產(chǎn)生破壞，能夠降低大面積種植的成本，有效提高篩選效率。

油體蛋白（oleosin）是一類特殊的貯藏蛋白，有些油體蛋白在植物種子中特異表達(dá)。當(dāng)外源小分子量蛋白插入到油體蛋白的N端或C端后不會(huì)影響其表達(dá)和定位，且融合蛋白非常穩(wěn)定。番茄（Solcumm lycopersicum）是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蔬菜作物，也是果實(shí)發(fā)育基礎(chǔ)研究的模式植物。轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)已經(jīng)大量應(yīng)用于番茄基礎(chǔ)研究和性狀改良，然而傳統(tǒng)的方法無法在種子階段區(qū)分轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因材料，轉(zhuǎn)基因后代鑒定效率比較低。本研究參考FAST技術(shù)，利用番茄種子特異且高水平表達(dá)的油體蛋白基因StOLEI啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)TagRFP融合蛋白表達(dá)，利用種子紅色熒光快速有效篩選番茄轉(zhuǎn)基因后代，為后續(xù)的基因功能研究和性狀改良帶來便利。

1材料與方法

1.1植物材料與菌株

番茄品種‘Rio Grande來自美國俄亥俄州立大學(xué)Esther van der Knaap實(shí)驗(yàn)室，于2020年種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南區(qū)溫室。番茄品種‘Money Maker（MM）的種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所番茄遺傳育種課題組擴(kuò)繁保存。大腸桿菌DH5a和農(nóng)桿菌GV3101購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2番茄油體蛋白的鑒定與分析

根據(jù)擬南芥油體蛋白研究結(jié)果，從TAIR（the arabidopsis information resource）數(shù)據(jù)庫下載17個(gè)擬南芥油體蛋白序列。以擬南芥油體蛋白序列為查詢序列，采用BLASTP（e-value<1E-5）在茄科基因組數(shù)據(jù)庫SGN（solanaceae genomics network）中檢索番茄油體蛋白。從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得水稻（Oryza sativa，）油體蛋白序列。利用ClustaIW軟件進(jìn)行番茄、擬南芥和水稻油體蛋白多序列比對(duì)，使用MEAG-X軟件、采用最大似然法（maximum likelihood）構(gòu)建油體蛋白序列的進(jìn)化樹。利用番茄果實(shí)發(fā)育成熟高分辨率時(shí)空轉(zhuǎn)錄圖譜數(shù)據(jù)庫SGN-TEA（https：//tea.sgn.cornell.edu/）分析油體蛋白基因在成熟期果實(shí)組織的表達(dá)模式。

1.3TagRFP和番茄油體蛋白基因的克隆

以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所張金喆老師惠贈(zèng)的含紅色熒光蛋白基因TagRFP編碼序列的番茄DNA為模板，使用引物ZP311，利用高保真聚合酶預(yù)混液Apex HF FL PCR Master Mix（艾科瑞生物），對(duì)TagRFP進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃1min；98℃10 s，60℃15 s，68℃1 min，35個(gè)循環(huán)。以CTAB法提取的番茄品種Rio Grande幼嫩葉片的基因組DNA為模板，使用引物Ole002擴(kuò)增番茄油體蛋白基因SlOLEI（Solyc069034040）全長序列。引物序列見表1。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用EasyPure@ Quick Gel Extraction Kit（全式金）進(jìn)行膠回收純化。TagRFP和StOLEI的回收產(chǎn)物均與Blunt Zero克隆載體（全式金）連接，轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4種子StOLEI-TagRFP紅色熒光表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)研OLEJ克隆載體序列和TagRFP編碼序列，采用軟件CE Design設(shè)計(jì)無縫克隆引物（表2）。無縫克隆采用ClonExpressll One Step Ooning Kit（諾唯贊），反應(yīng)條件為37℃連接30 min。以slOLEI基因克隆載體為模板，使用引物L(fēng)ine005進(jìn)行反向PCR；以TagRFP克隆載體為模板，使用引物Insen005擴(kuò)增TagRFP編碼序列。分別對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，然后進(jìn)行無縫克隆，將TagRFP編碼序列插入到SloLEI基因終止密碼子前面，構(gòu)建SlOLEI-TagRFP嵌合基因克隆載體Blunt-OR，嵌合基因序列中僅保留1個(gè)終止密碼子。使用EcoRI和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對(duì)pBI121植物雙元表達(dá)載體（華越洋）進(jìn)行雙酶切，以克隆載體Blunt-OR為模板，使用引物Insert010擴(kuò)增SlOLEl-TagRFP嵌合基因片段，膠回收純化后與pB1121雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行無縫克隆，構(gòu)建表達(dá)載體pSIOLEl-TagRFP。

1.5種子SIOLEI-TagRFP紅色熒光表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化

利用凍融法將表達(dá)載體pSIOLEl-TagRFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行番茄MM子葉的遺傳轉(zhuǎn)化。遺傳轉(zhuǎn)化方案參照文獻(xiàn)[18]，將MM的種子消毒后置于1/2MS培養(yǎng)基，待子葉展開且真葉尚未長出時(shí)剪下子葉，在A1培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2d后進(jìn)行侵染，侵染的子葉繼續(xù)在A1培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d，經(jīng)A2培養(yǎng)基誘導(dǎo)得到愈傷組織和分化的芽，A3培養(yǎng)基分化培養(yǎng)得到小苗，最后由A4培養(yǎng)基生根培養(yǎng)得到生根小苗后移栽至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所北圃場玻璃溫室。

1.6轉(zhuǎn)基因番茄的PCR檢測和種子熒光鑒定

提取轉(zhuǎn)基因番茄植株的DNA，根據(jù)表達(dá)載體中TagRFP兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物O+R-7（F：GGTA-AGCGTG17ATCGTGGA：R：ATGAAGACGAGCCTCG-TAGC），PCR檢測To代植株中是否插入TagRFP基因序列。將To代陽性轉(zhuǎn)基因植株自交授粉收獲的干燥種子，置于徠卡體視熒光顯微鏡（Leica MZ10F）下進(jìn)行熒光成像和拍照。挑選呈現(xiàn)熒光和無熒光的種子分別催芽，真葉長出后提取DNA，進(jìn)一步通過PCR驗(yàn)證番茄轉(zhuǎn)基因后代中是否含有TagRFP基因。

2結(jié)果與分析

2.1番茄油體蛋白基因分析

在SGN數(shù)據(jù)庫中檢索到番茄中有9個(gè)油體蛋白編碼基因，分別是Solyc029086490、Solyc039112440、Solyc039119820、Solyc069034040、Solyc069060840、Solyc069069260、Solyc089066040、Solyc089078160和Solyc129010920。在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到6個(gè)水稻油體蛋白編碼基因：Os0190643900、Os03949190、Os0490546500、Os0590576700、Os0690473800和Os0990324000。

為了明確番茄、擬南芥和水稻油體蛋白之間的親緣關(guān)系，對(duì)番茄9個(gè)、擬南芥17個(gè)和水稻6個(gè)的油體蛋白構(gòu)建分子進(jìn)化樹（圖1A）。在進(jìn)化樹中，番茄油體蛋白基因Solyc069034040與擬南芥中的AT4G25140（AtOLEI）和AT5G51210基因以及水稻的Os0990324000（OsoLE4）和Os0490546500（OsOLE3）基因親緣關(guān)系最近。AT4G25140（AtOLEl）是擬南芥種子中最豐富的油體蛋白。利用自身啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)AT4G25140（AtOLEI）、Os0990324000（OsOLE4）基因與GFP基因的融合蛋白基因表達(dá)，可使轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻的種子呈現(xiàn)出綠色熒光。隨后檢索番茄基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫SGN-TEA（https：//tea.sgn.cornell.edu/），發(fā)現(xiàn)Solyc039112440、Sotyc129010920和Solyc069034040基因在紅熟期種子中的表達(dá)量居前三，RPM值分別為2114.94、1719.41和1185.15。由于Sotyc069034040在番茄紅熟期果實(shí)的其他組織中幾乎不表達(dá)（圖1B），且其編碼蛋白與擬南芥AT4G25140（ AtOLEl）和水稻Os0990324000（OsOLE4）蛋白序列相似性最高，因此，推測Solyc069034040基因（以下簡稱SIOLEJ）啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)融合蛋白在番茄種子中表達(dá)。

2.2種子紅色熒光表達(dá)載體pSlOLEl-TagRFP構(gòu)建

以番茄‘Rio Grande的DNA為模板，經(jīng)引物Ole002擴(kuò)增得到長度為4004 bp的SlOLE1基因全長片段（圖2A），其中含啟動(dòng)子和終止子序列長度各約1.7 kb。利用引物ZP311擴(kuò)增TagRFP編碼區(qū)序列（715 bp，圖2B）。PCR擴(kuò)增片段分別連人Blunt Zero克隆載體，測序后獲得序列正確的克隆載體Blunt-SIOLEl和Blunt-TagRFP。

將質(zhì)粒Blunt-SIOLEl通過反向PCR線性化（引物L(fēng)ine005，表2），與質(zhì)粒Blunt-TagRFP為模板的PCR產(chǎn)物的膠回收純化產(chǎn)物（引物Insen005，表2）進(jìn)行無縫克隆，成功在SlOLE1基因終止密碼子前面插入TagRFP編碼區(qū)序列，獲得重組質(zhì)粒Blunt-OR。

將pB1121雙元載體的EcoR I和HindⅢ雙酶切產(chǎn)物，與質(zhì)粒Blunt-OR為模板的PCR產(chǎn)物的膠回收純化產(chǎn)物無縫克?。ㄒ颕nsert010，表2）。無縫克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，利用引物ZP311進(jìn)行菌液PCR鑒定，以Blunt-TagRFP質(zhì)粒為陽性對(duì)照，有9份菌液擴(kuò)增出條帶，大小約為715 bp，其中菌液SIOLEl-TagRFP-14的測序結(jié)果完全正確，成功構(gòu)建種子紅色熒光表達(dá)載體pSlOLEl-TagRFP（圖2C、圖3）。

2.3SlOLEl-TagRFP轉(zhuǎn)基因陽性番茄植株獲得

將pSIOLEl-TagRFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，以番茄MM的子葉為外植體進(jìn)行侵染，經(jīng)組織培養(yǎng)共獲得45個(gè)再生植株。以轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板，使用引物O+R-7對(duì)TagRFP基因進(jìn)行PCR檢測。以pSIOLEl-TagRFP質(zhì)粒為陽性對(duì)照，野生型MM為陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照，結(jié)果（圖4）顯示，有8株To代番茄植株的擴(kuò)增產(chǎn)物與野生型MM一致，為單一條帶，表明沒有插入TagRFP基因；其余37株均擴(kuò)增出雜合條帶，表明成功插入了TagRFP編碼區(qū)序列，遺傳轉(zhuǎn)化效率達(dá)到82.22%。

2.4轉(zhuǎn)基因番茄后代種子紅色熒光觀察及PCR鑒定

挑選9株生長健壯的SlOLEl-TagRFP陽性轉(zhuǎn)基因番茄幼苗，移栽至玻璃溫室，振蕩自交授粉。將To代植株自交種子干燥后置于徠卡體視熒光顯微鏡下，以野生型MM的種子為陰性對(duì)照，分別在明場和熒光光源下檢測TagRFP信號(hào)。結(jié)果（圖5）顯示，在明場下，野生型MM和轉(zhuǎn)基因干燥種子顏色無明顯差異：在熒光下，野生型種子均無紅色熒光，轉(zhuǎn)基因種子部分呈現(xiàn)明亮紅色熒光。表明TagRFP可以作為一種標(biāo)記篩選出轉(zhuǎn)基因番茄后代中的紅色熒光種子。

為了驗(yàn)證通過種子紅色熒光檢測番茄轉(zhuǎn)基因后代的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步播種轉(zhuǎn)基因植株的紅色熒光種子和無熒光種子各96粒，使用引物O+R-7進(jìn)行PCR，鑒定后代植株是否存在TagRFP序列。結(jié)果表明，96株紅色熒光種子萌發(fā)的幼苗擴(kuò)增產(chǎn)物均為雜合條帶，表明含有TagRFP編碼區(qū)序列，而96株無熒光種子萌發(fā)的幼苗擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶，表明不含TagRFP編碼區(qū)序列。熒光種子和無熒光種子各12粒萌發(fā)的幼苗PCR檢測結(jié)果如圖6所示，表明通過種子紅色熒光鑒定番茄轉(zhuǎn)基因后代的準(zhǔn)確率達(dá)100%。

3討論與結(jié)論

熒光蛋白有多種類型，其中，綠色熒光蛋白（GFP）、藍(lán)色熒光蛋白（BFP）、青色熒光蛋白（CFP）和黃色熒光蛋白（YFP）等的發(fā)射波長局限在440-529nm，在細(xì)胞內(nèi)成像時(shí)會(huì)激發(fā)某些內(nèi)源物質(zhì)產(chǎn)生熒光，對(duì)結(jié)果造成不同程度的干擾。本研究所使用的TagRFP的發(fā)射波長為584 nm，細(xì)胞內(nèi)成像背景低，更容易檢測。通過PCR分子標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)，利用TagRFP作為篩選標(biāo)記，區(qū)分轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因種子的準(zhǔn)確率可達(dá)100%。此外，使用熒光蛋白標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)基因種子時(shí)，可利用熒光種子分選設(shè)備進(jìn)一步提高鑒定效率。

種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光蛋白基因，可用于轉(zhuǎn)基因種子的可視化鑒定。在擬南芥中使用種子儲(chǔ)藏蛋白基因napin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光蛋白進(jìn)行表達(dá)，可以在熒光顯微鏡下識(shí)別轉(zhuǎn)基因種子。擬南芥和水稻油體蛋白基因AtOLEI、Os-OLE4與GFP的融合蛋白基因表達(dá)，可使轉(zhuǎn)基因種子呈現(xiàn)綠色熒光，從而實(shí)現(xiàn)快速簡便鑒定轉(zhuǎn)基因后代。本研究發(fā)現(xiàn)SlOLE1（Solyc069034040）是擬南芥AtOLE1基因和水稻OsOLE4基因的同源基因，而且在番茄種子中特異、高水平表達(dá)。利用SlOLE1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SlOLEl-TagRFP融合蛋白表達(dá)，成功實(shí)現(xiàn)了通過種子紅色熒光快速簡便鑒定轉(zhuǎn)基因番茄后代的目的。由此推測，利用植物自身種子特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)油體蛋白與熒光蛋白融合基因的表達(dá)，可以應(yīng)用于其他含油體蛋白種子植物的轉(zhuǎn)基因后代鑒定。

種子熒光標(biāo)記系統(tǒng)已經(jīng)逐步應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和育種領(lǐng)域?；蚓庉嬐ǔ＝柚€(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化，需要對(duì)陽性轉(zhuǎn)基因植株和不舍轉(zhuǎn)基因成分的突變后代進(jìn)行篩選，工作量大，費(fèi)用高。玉米種子熒光報(bào)告系統(tǒng)輔助的CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)通過胚中的紅色熒光標(biāo)記準(zhǔn)確鑒別轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因籽粒，顯著提高了基因編輯工作效率。水稻智能不育育種技術(shù)將育性恢復(fù)基因、花粉失活基因和種子特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的紅色熒光蛋白基因串聯(lián)，一起導(dǎo)入到水稻雄性不育突變體中，自交可產(chǎn)生無熒光的雄性不育種子和有熒光的可育種子。玉米雄性不育制種新技術(shù)也可根據(jù)紅色熒光實(shí)現(xiàn)不育系和保持系種子的分選。利用單倍體誘導(dǎo)系的單倍體育種技術(shù)可以加快純系選育進(jìn)程，提高育種效率。然而單倍體誘導(dǎo)效率一般不高，鑒別也較為困難。利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制擬南芥、玉米和馬鈴薯等植物的單倍體誘導(dǎo)系，結(jié)合種子熒光標(biāo)記，提高了單倍體鑒別效率。Zhong等報(bào)道的番茄單倍體熒光鑒別技術(shù)體系中使用的是擬南芥FAST-Red標(biāo)記。

本研究克隆了番茄自身的種子特異性表達(dá)基因StOLEJ，并構(gòu)建了StOLEl-TagRFP嵌合基因。穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化SIOLEI-TagRFP嵌合基因的番茄種子在激發(fā)光照射下發(fā)出明亮的紅色熒光，準(zhǔn)確率可達(dá)100%。該種子紅色熒光標(biāo)記篩選體系將有望應(yīng)用于番茄基因編輯、智能雄性不育系創(chuàng)制和單倍體鑒別等領(lǐng)域，具有一定基礎(chǔ)研究和育種應(yīng)用價(jià)值。