摘" " 要：為探究不同氮濃度和光照強(qiáng)度對嗜碳杜氏鹽藻HTBS生長的影響，通過設(shè)置培養(yǎng)基中不同的硝酸鈉濃度（0、7.5、75、750、500 mg·L-1）和光照強(qiáng)度（20、80、140 μmol·m-2·s-1）對HTBS培養(yǎng)過程中細(xì)胞密度、生物量、色素含量、熒光參數(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：750 mg·L-1硝酸鈉能夠有效促進(jìn)HTBS生長，對HTBS光合系統(tǒng)促進(jìn)作用效果最明顯，細(xì)胞密度和生物量增長最大，分別增長62.6%和33.4%；葉綠素含量增長44.5%；β-胡蘿卜素降低19%；Qp增加，NPQ下降，F(xiàn)v/Fm提升44.59%，ΦPSII提升125.00%。光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1和20 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度條件成長的HTBS相比，細(xì)胞密度和生物量分別增長21.5%和19.6%，藻體細(xì)胞葉綠素含量、β-胡蘿卜素含量分別降低28.3%和19%，rETR值增加165.12%，F(xiàn)v/Fm值、ΦPSII、NPQ、Qp呈下降趨勢，化合效率降低?？傊?，光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1、硝酸鈉為750" mg·L-1時，能促進(jìn)嗜碳杜氏鹽藻HTBS細(xì)胞密度和生物量的增長。

關(guān)鍵詞：杜氏鹽藻；嗜碳藻；氮源；光照強(qiáng)度

中圖分類號：Q89" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " " " "DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.04.001

Effects of Nitrogen Concentration and Light Intensity on the Growth of Carbophilic Dunaliella salina HTBS

LUO Chen1，2， GUO Zhile1， YAO Yuanjiang1，2， LU Sihan1，2， HOU Yuyong2， WANG Weijie1

（1. School of Life Sciences， North China University of Science and Technology， Tangshan， Hebei 063210， China；2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology， Chinese Academy of Sciences， Tianjin 300308， China）

Abstract： To investigate the effects of different nitrogen concentrations and light intensities on the growth of high bicarbonate tolerance strain Dunaliella salina HTBS， the cell density， biomass， pigment content， and fluorescence parameters during HTBS cultivation by varying nitrate concentrations （0 mg·L-1， 7.5 mg·L-1， 75 mg·L-1， 750 mg·L-1， 500 mg·L-1） and light intensities （20 μmol·m-2·s-1， 80 μmol·m-2·s-1， 140 μmol·m-2·s-1） were examined. The results showed that 750 mg·L-1 sodium nitrate could effectively promote the growth of HTBS with the most pronounced effect on the HTBS photosynthetic system. The most significant increases were observed in cell density and biomass growth， with increases of 62.6% and 33.4% respectively. The chlorophyll content increased by 44.5%， while the β-carotene content decreased by 19%. Qp increased， while NPQ decreased. Furthermore， Fv/Fm increased by 44.59%， and ΦPSII increased by 125.00%. In comparison to 20 μmol·m-2·s-1， 80 μmol·m-2·s-1 increased cell density and biomass by 21.5% and 19.6% respectively， while the chlorophyll content and β-carotene content decreased by 28.3% and 19% respectively. The rETR value exhibited a 165.12% increase， while the Fv/Fm value， ΦPSII， NPQ and Qp demonstrated a downward trend， accompanied by a decline in chemical efficiency. In conclusion， it could be concluded that a light intensity of 80 μmol·m-2·s-1 and a nitrogen concentration of 750 mg·L-1 of sodium nitrate were optimal for the growth of the high bicarbonate tolerance microalga strain Dunaliella salina HTBS.

Key words： Dunaliella salina; carbon-loving algae; nitrogen sources; light intensity

微藻是一種生長快速、繁殖能力強(qiáng)的藻類植物，通過光合作用將二氧化碳轉(zhuǎn)化為有機(jī)物，光合效率遠(yuǎn)高于陸生植物，在碳減排和環(huán)境保護(hù)方面具有重要的應(yīng)用價值。

微藻種類繁多，生長習(xí)性和生理特性多樣。杜氏鹽藻（Dunaliella salina）是一種能在高鹽度極端環(huán)境條件下生長的真核單細(xì)胞綠藻，同時細(xì)胞會產(chǎn)生大量β-胡蘿卜素，占干質(zhì)量的14%，在制藥、衛(wèi)生、食品等行業(yè)廣泛應(yīng)用[1]。在高碳低溫的極端環(huán)境下，嗜碳杜氏鹽藻HTBS胞內(nèi)花生四烯酸（AA）和二十二碳六烯酸（DHA）含量可達(dá)脂肪酸含量的8.2%，花生四烯酸和二十二碳六烯酸是2種重要的多不飽和脂肪酸，具有多種生物活性，在營養(yǎng)健康領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價值。此外，嗜碳杜氏鹽藻HTBS脂質(zhì)的積累在生物能源領(lǐng)域也具有較高的應(yīng)用前景。

影響嗜碳杜氏鹽藻生長的因素較多，包括光照強(qiáng)度、培養(yǎng)基組成、pH值等[2]。

氮濃度和光照強(qiáng)度是影響嗜碳杜氏鹽藻生長的重要因素，在較高的光照強(qiáng)度下，藻類油脂含量較高，C18和單不飽和脂肪酸組分占比增加[3]。不同氮濃度會影響微藻脂質(zhì)積累[4-5]和生物量產(chǎn)值[6]。

本研究探索不同氮（硝酸鈉）濃度和光照強(qiáng)度對嗜碳杜氏鹽藻HTBS在生長過程中細(xì)胞密度、生物量、色素含量、光合效率的影響，為嗜碳杜氏鹽藻HTBS的推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，對嗜碳杜氏鹽藻HTBS在“雙碳”經(jīng)濟(jì)背景下發(fā)揮固碳作用具有積極作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料、試劑、儀器

1.1.1 試驗藻種 嗜碳杜氏鹽藻HTBS由中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所植物細(xì)胞工程與代謝研究組提供。

1.1.2 試驗培養(yǎng)基 f/2培養(yǎng)基的組成如表1所示。

配制培養(yǎng)基母液：f/2培養(yǎng)基的主要成分如表1所示，按照表格要求準(zhǔn)確稱取所需的各個試劑，將其溶解完全，用純水定容，最后將配制好的培養(yǎng)基母液轉(zhuǎn)移至試劑瓶后備用。

配制培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取所需的培養(yǎng)基母液試劑，與定量的純水混合、攪拌均勻，用1 mol·L-1 NaOH和1 mol·L-1 HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至7.2～7.5，高壓滅菌后自然冷卻至室溫。

1.1.3 儀器設(shè)備 DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LI-250A照度計，廣州市宏誠集業(yè)電子科技有限公司；AP110手持式藻類熒光測量儀，易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司；MY-20手持高速研磨儀，上海拓赫機(jī)電科技有限公司；UV-1800PC紫外-可見光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；PHS-25 pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 HTBS培養(yǎng)方法 HTBS細(xì)胞培養(yǎng)使用f/2培養(yǎng)基，80 μmol·m-2·s-1連續(xù)光照強(qiáng)度，溫度保持在25 ℃條件下，培養(yǎng)藻細(xì)胞經(jīng)過4 d，進(jìn)入對數(shù)生長期，完成種子培養(yǎng)階段。

1.2.2 HTBS光氮試驗設(shè)計 首先，以光照強(qiáng)度為考察因素，按照表2設(shè)置不同的光照強(qiáng)度，在250 mL三角瓶中接入藻種和新鮮無菌f/2培養(yǎng)基150 mL，在無添加硝酸鈉情況下，HTBS在680 nm處的初始OD680值控制在0.4，25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

其次，以硝酸鈉為考察因素，按照表3配制不同濃度硝酸鹽，在250 mL三角瓶中接入藻種和新鮮無菌f/2缺氮培養(yǎng)基150 mL，HTBS在680 nm處的初始OD680值控制在0.4，在試驗確定的最佳光照強(qiáng)度下，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 測定指標(biāo)

取8 mL HTBS藻體懸液置于10 mL離心管中，5 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入無菌f/2新鮮培養(yǎng)基重懸，清洗2次。將離心清洗后的HTBS藻體液氮研磨后，加入3∶1丙酮和無水乙醇混合液于5 mL離心管中定容至3 mL，旋渦混合后，在避光條件下，4 ℃靜置24 h至藻體呈現(xiàn)白色，5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，用于色素含量測定。

1.3.1 葉綠素含量測定 取上清液置于光徑1 cm的比色皿中，用紫外-可見光分光光度計來分別測量上清液在波長為645、663 nm處的吸光度值，分別標(biāo)記為A645和A663，按公式（1）、公式（2）計算葉綠素含量[7]。

Ca（mg·L-1）=12.7A663-2.69A645

Cb（mg·L-1）=22.9A645-4.68A663

A（mg·L-1）=Ca×3÷8

B（mg·L-1） =Cb×3÷8

C（mg·L-1）=A+B" （1）

式中，Ca、Cb、C分別代表葉綠素 a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量，單位為mg·L-1。

葉綠素含量（%干質(zhì)量）=葉綠素含量（mg·L-1）/DW（g·L-1）（2）

1.3.2 β-胡蘿卜素含量測定" "取上清液置于光徑1 cm的比色皿中，用紫外-可見光分光光度計測定上清液在450 nm處的吸光度值進(jìn)行測定，按照公式（3）、公式（4）計算β-胡蘿卜素的含量[8]。

β-胡蘿卜素含量（mg·L-1）=（3×10×A450）×1 000÷（2 500×8） （3）

β-胡蘿卜素含量（%干質(zhì)量）=β-胡蘿卜素含量（mg·L-1）/DW（g·L-1）（4）

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 取2 mL藻液置于離心管中，調(diào)節(jié)OD680的值為1，樣品暗適應(yīng)20 min，使用AquaPen手持式葉綠素?zé)晒鈪?shù)分析儀，項目參數(shù)可直接從熒光儀上獲取，選定程序“NPQ1”進(jìn)行檢測。數(shù)據(jù)通過機(jī)器配套軟件導(dǎo)出最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm、實際光化學(xué)量子產(chǎn)量ΦPSⅡ、光化學(xué)淬滅系數(shù)Qp、非光化學(xué)淬滅NPQ，其中實際光化學(xué)電子傳遞速率rETR按公式（5）計算[9]。為確保數(shù)據(jù)的可靠性，對每個處理組進(jìn)行3次重復(fù)測量。

rETR=ΦPSⅡ×光照強(qiáng)度×0.5 （5）

1.3.3 細(xì)胞光密度、細(xì)胞干質(zhì)量（生物量）的測定方法 使用OD680表示藻液的光密度。每日定時取樣，取藻液2 mL，充分搖勻置于比色皿，以蒸餾水作為參比液，使用分光光度計在680 nm處測定吸光度，每個樣本進(jìn)行3次平行檢測。

采用0.22 μm纖維濾膜，105 ℃烘箱烘干后稱質(zhì)量，記錄初始質(zhì)量W1。每日定時取藻液10 mL，充分搖勻置于15 mL離心管，藻液體積記為V。對藻液進(jìn)行抽濾，用ddH2O清洗濾膜3次后，將濾膜在105 ℃的烘箱中烘干12 h，收集至干燥皿中穩(wěn)定至室溫再次稱質(zhì)量，記錄質(zhì)量W2。每個樣本進(jìn)行3次平行檢測，根據(jù)式（3）計算干質(zhì)量（DW，Dry weight；生物量）。

DW（g·L-1）＝（W2－W1）÷V（6）

式中，W1為烘干后濾膜質(zhì)量，mg；W2為經(jīng)抽濾并烘干后濾膜質(zhì)量，mg；V為藻液體積，mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均設(shè)置3個平行試驗，每個處理組均有3批重復(fù)樣品進(jìn)行測量，試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。試驗使用Origin 2022b軟件進(jìn)行圖表繪制，應(yīng)用SPSS 25.0軟件中的LSD進(jìn)行單因素ANOVA方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照強(qiáng)度和硝酸鈉對鹽藻細(xì)胞生長的影響

采用分光光度計對HTBS生長過程中的細(xì)胞密度進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在硝酸鈉濃度為750 mg·L-1的條件下，對HTBS的生長和生物量積累有顯著的促進(jìn)作用。第8天，細(xì)胞密度增長了62.6%，生物量增加了33.4%（圖1-A和圖1-C）。這說明在這種濃度的硝酸鈉條件下，HTBS的生長狀況和生物量顯著提高。當(dāng)光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1時，對細(xì)胞密度和生物量的影響最明顯（圖1-B和圖1-D），與光照強(qiáng)度為20 μmol·m-2·s-1和140 μmol·m-2·s-1組相比，細(xì)胞密度分別增長21.5%和15.3%，生物量分別增長19.6%和19.6%。

2.2 光照強(qiáng)度和硝酸鈉對細(xì)胞色素含量的影響

隨著硝酸鈉濃度升高，β-胡蘿卜素先升高后降低（圖2-A），在75、750、1 500 mg·L-1硝酸鈉條件下，分別增長32.9%、44.5%、37.4%，對HTBS類胡蘿卜素積累有顯著促進(jìn)作用，葉綠素含量也隨著硝酸鈉濃度的增加而升高。

β-胡蘿卜素是維生素A的主要來源，在微藻抗氧化系統(tǒng)中起重要作用[10]。隨著光照強(qiáng)度的增加，HTBS細(xì)胞中的胡蘿卜素和葉綠素含量均呈下降的趨勢，如圖2-B和圖2-D所示。當(dāng)光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1和140 μmol·m-2·s-1時，相較于20 μmol·m-2·s-1時，微藻細(xì)胞中β-胡蘿卜素分別降低了19%和40%；當(dāng)光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1和140 μmol·m-2·s-1時，相較于20 μmol·m-2·s-1時，微藻細(xì)胞中葉綠素含量分別降低了28.3%和58.9%。光照強(qiáng)度降低，細(xì)胞內(nèi)色素含量增加，從而提高光合電子捕捉效率，儲備光合作用原料，以調(diào)節(jié)細(xì)胞生理狀態(tài)。

2.3 光照強(qiáng)度和硝酸鈉對葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

微藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)極易受溫度影響，通過調(diào)節(jié)PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度來調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝從而適應(yīng)外界溫度變化[12]。Fv/Fm表示植物在理想條件下的最大光能轉(zhuǎn)換效率；NPQ衡量植物對過多光能進(jìn)行熱耗散的能力，定量植物對光能的保護(hù)作用；rETR代表相對電子傳遞快慢；Qp反映植物光合活性的高低。

由圖3-A、圖3-C可知，和對照組（CK）相比，750 mg·L-1硝酸鈉濃度使HTBS的Fv/Fm提升44.59%，NPQ下降了66.67%，Qp提升了43.16%，ΦPSII提升了125.00%，對于HTBS光合系統(tǒng)促進(jìn)作用效果明顯。相對于20 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度，80 μmol·m-2·s-1和140 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下，光合參數(shù)均有不同程度下降，其中140 μmol·m-2·s-1下降最明顯，F(xiàn)v/Fm、NPQ、Qp、ΦPSII分別下降了18.49%、145.45%、72.09%、60.61%。

不同培養(yǎng)條件下，微藻細(xì)胞的生理生化測定結(jié)果表明，低光照強(qiáng)度的光合效率最大，在低光條件下，藻體光系統(tǒng)II的最大光化學(xué)效率Fv/Fm值相較于中、高光出現(xiàn)升高趨勢，而NPQ值隨光照強(qiáng)度減小而增加，強(qiáng)光保護(hù)能力最弱，rETR隨著光照強(qiáng)度的增加出現(xiàn)不同的變化，在中等光照強(qiáng)度80 μmol·m-2·s-1條件下，rETR較低光條件上升了165.12%（圖3-D）。在一定濃度范圍內(nèi)，硝酸鈉濃度的增高，提升了HTBS光合效率，降低了熱耗散，光合相對電子傳遞速率升高。硝酸鈉濃度為750 mg·L-1時，rETR較對照組上升了125%。硝酸鈉濃度1 500 mg·L-1時，光合相對電子傳遞速率降低，和藻體葉綠素含量一致（圖2-C）。這說明在不同濃度的硝酸鈉條件下，低光提升了藻體的硝酸鈉利用能力。

3 討論與結(jié)論

本文研究不同氮濃度和光照強(qiáng)度對嗜碳杜氏鹽藻HTBS生長的影響，考察細(xì)胞密度、生物量、色素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，旨在推進(jìn)微藻在生物固碳領(lǐng)域的應(yīng)用，促進(jìn)“雙碳”經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

3.1 氮濃度對嗜碳藻杜氏鹽藻HTBS生長的影響

氮濃度是影響微藻生長狀態(tài)和生物質(zhì)積累的重要因素[13]。氮源是微藻培養(yǎng)過程中合成蛋白質(zhì)、核酸和色素的基礎(chǔ)營養(yǎng)元素之一，氮源不足會導(dǎo)致微藻色素含量降低，光合效率下降，從而影響微藻的生長和繁殖[14]。本研究以硝酸鈉為氮源，探索0 mg·L-1（對照）、7.5 mg·L-1、75 mg·L-1、750 mg·L-1、1 500 mg·L-1硝酸鈉濃度梯度對杜氏鹽藻HTBS生長的影響。結(jié)果表明，硝酸鈉對HTBS的細(xì)胞密度和生物量積累有促進(jìn)作用。硝酸鈉濃度為750 mg·L-1時，細(xì)胞密度和生物量增長最大，分別增長了62.6%和33.4%；硝酸鈉也促進(jìn)HTBS色素含量的增加，葉綠素含量也隨著硝酸鈉濃度的增加而升高，β-胡蘿卜素先升高后降低，在750 mg·L-1硝酸鈉條件下，β-胡蘿卜素含量最大，相比對照組增長44.5%；750 mg·L-1硝酸鈉濃度對HTBS光合系統(tǒng)促進(jìn)作用效果最明顯，Qp增加，NPQ下降，F(xiàn)v/Fm提升44.59%，ΦPSII提升125.00%。夏建榮等[15]研究發(fā)現(xiàn)，隨著氮濃度增加至880 μmol·L-1，小新月菱形藻細(xì)胞增殖和光合效率也隨之增加，同時ΦPSII與Fv/Fm均與生長趨勢一致，適宜的氮濃度有利于細(xì)胞生長和生物質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果表明，最高生物量并非在最高初始氮濃度下達(dá)到，硝酸鹽濃度過高，可能會使硝酸還原酶的活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致亞硝酸鹽在胞內(nèi)積累，阻礙藻細(xì)胞正常代謝[16]。本研究確定的嗜堿藻HTBS的最適氮濃度培養(yǎng)條件，有利于后期的工業(yè)化推廣和藻體的進(jìn)一步開發(fā)利用。

3.2 光照對嗜碳藻杜氏鹽藻HTBS生長的影響

光照強(qiáng)度是影響嗜碳杜氏鹽藻HTBS生長和生物質(zhì)轉(zhuǎn)換的重要因素，藻體細(xì)胞中色素含量、脂類含量、脂肪酸種類等均與光照強(qiáng)度有直接的關(guān)系[17]。本文研究3個不同光照強(qiáng)度20、80、140 μmol·m-2·s-1對HTBS生長的影響。當(dāng)光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1時，藻細(xì)胞密度和生物量增長最大，較20 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度條件成長的HTBS細(xì)胞密度和生物量分別增長21.5%和19.6%，這與張港生等[18]的研究結(jié)果一致，同時光照強(qiáng)度過高，會使微藻進(jìn)入光抑制階段，生物量下降[17]；隨著光照強(qiáng)度的增加，HTBS色素含量逐漸降低，光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1時，藻體細(xì)胞葉綠素含量、β-胡蘿卜素含量較20 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度條件下分別降低28.3%和19%；隨著光照強(qiáng)度的增加，嗜碳杜氏鹽藻HTBS的光合效率呈下降趨勢，NPQ值隨光強(qiáng)減小而增加，光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1和光照強(qiáng)度為20 μmol·m-2·s-1相比，rETR值增加165.12%，F(xiàn)v/Fm值、ΦPSII、NPQ、Qp呈下降趨勢，化合效率降低。

研究結(jié)果顯示，不同氮濃度和光照強(qiáng)度對嗜碳杜氏鹽藻HTBS生長過程中生物量的積累、色素生成、光合作用效率的影響較大。嗜碳杜氏鹽藻HTBS在強(qiáng)光條件下和弱光強(qiáng)度相比，會有生物量積累增加、色素含量降低、光合作用減弱現(xiàn)象。原因可能是嗜碳杜氏鹽藻HTBS在強(qiáng)光條件下通過細(xì)胞快速分裂和增殖，提高了藻細(xì)胞的密度，從而加大了細(xì)胞之間的阻擋效應(yīng)，弱化了單個細(xì)胞受到的光照效果，與強(qiáng)光誘發(fā)光抑制有關(guān)，但具體作用機(jī)制面尚待深入研究。

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