王曉慶 賀燕 袁鳳君 歐陽(yáng)慶

摘 要：基于銅綠假單胞菌中高度保守的外毒素A基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立并優(yōu)化重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）條件，并評(píng)價(jià)該方法的靈敏度和抗干擾能力。結(jié)果顯示，RPA反應(yīng)體系能夠在40 ℃等溫條件下，20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的擴(kuò)增，檢出銅綠假單胞菌的靈敏度為102 CFU·mL-1，抗干擾能力與GB 8538—2022相一致。經(jīng)培養(yǎng)優(yōu)化后，銅綠假單胞菌的最低檢出限可達(dá)

10 CFU·mL-1，且重復(fù)性良好。本研究探索的銅綠假單胞菌RPA擴(kuò)增檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速、抗干擾能力強(qiáng)，為食品中銅綠假單胞菌的快速識(shí)別提供了新的方向與參考。

關(guān)鍵詞：重組酶聚合酶擴(kuò)增；銅綠假單胞菌；快速檢測(cè)

Study on a Recombinase Polymerase Amplification Assay for Rapid Detection of Pseudomonas aeruginosa

WANG Xiaoqing1，2， HE Yan1，2*， YUAN Fengjun1，2， OUYANG Qing1，2

（1.Key Laboratory of Food Safety Monitoring and Early Warning of Hunan Province， Changsha 410117， China;

2.Hunan Institute of Commodity Quality Inspection， Changsha 410117， China）

Abstract： Based on the highly conserved exotoxin A gene in Pseudomonas aeruginosa， specific primers were designed to establish and optimize the amplification conditions of recombinase polymerase amplification （RPA）， the sensitivity and anti-interference ability of the method were evaluated. The results showed that the RPA reaction system could achieve the amplification of the target gene within 20 minutes under the isothermal condition of 40 ℃， and the sensitivity of detecting Pseudomonas aeruginosa was 102 CFU·mL-1， and the anti-interference ability was consistent with GB 8538—2022. After culture optimization， the minimum detection limit of Pseudomonas aeruginosa could reach 10 CFU·mL-1， and the repeatability was good. The RPA amplification detection method of Pseudomonas aeruginosa established in this study has the advantages of simple operation， rapid response and strong anti-interference ability， which provides a new direction and reference for the rapid detection of Pseudomonas aeruginosa in food.

Keywords： recombinase polymerase amplification; Pseudomonas aeruginosa; rapid detection

近年來(lái)，隨著現(xiàn)代化進(jìn)程的加快，包裝飲用水因其便利、不含雜質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，頗受消費(fèi)者的青睞。隨著消費(fèi)量不斷上升，桶裝水中銅綠假單胞菌的檢出率一直居高不下，成為食品安全和公共衛(wèi)生的重要隱患[1]，也成為消費(fèi)者和諸多研究者們重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。鑒于銅綠假單胞菌具有較大的危害性，加拿大、美國(guó)、巴西、歐洲各國(guó)及世界衛(wèi)生組織等國(guó)家和國(guó)際組織對(duì)飲用水中銅綠假單胞菌含量進(jìn)行了限定，限定標(biāo)準(zhǔn)為每250 mL不得檢出[2]。我國(guó)也制定了《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》（GB 19298—2014），該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)銅綠假單胞菌限量指標(biāo)做了明確規(guī)定，并要求每批次成品出廠前進(jìn)行銅綠假單胞菌檢測(cè)，且每

250 mL樣品中不得檢出銅綠假單胞菌（采用二級(jí)取樣方案，n=5，c=0，m=0，單位為CFU/250 mL）[3]。

一旦檢出，則判定該產(chǎn)品為不合格。

檢測(cè)銅綠假單胞菌的方法有多種，目前最常用的是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，需要進(jìn)行分離培養(yǎng)及后續(xù)的生化鑒定，操作時(shí)間長(zhǎng)，過(guò)程相對(duì)復(fù)雜導(dǎo)致檢測(cè)效率低。隨著分子技術(shù)的迅猛發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于銅綠假單胞菌等食源性致病菌的檢測(cè)[4]。但是，熒光PCR技術(shù)需要設(shè)施完善的實(shí)驗(yàn)室條件、精準(zhǔn)控溫的熒光PCR儀以及經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員，很大程度上限制了該方法在現(xiàn)場(chǎng)及基層的應(yīng)用。因此，如何快速、簡(jiǎn)便、有效檢出銅綠假單胞菌越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注。

作為一種新型恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）反應(yīng)模式與PCR相似，不同的是RPA不需要初始的加熱變性步驟，而是利用重組酶形成引物復(fù)合物識(shí)別特異性位點(diǎn)，在37～42 ℃條件下，30 min內(nèi)便可完成目的片段的特異性擴(kuò)增。近年來(lái)，RPA技術(shù)由于其反應(yīng)迅速、操作方便及設(shè)備要求低等明顯優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)學(xué)診斷、動(dòng)植物病原學(xué)以及食源性致病菌的分子檢測(cè)領(lǐng)域得到了快速發(fā)展[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、熒光假單胞菌（ATCC 13525）、大腸埃希氏菌（AATCC 25922）標(biāo)準(zhǔn)菌株，均來(lái)源于美國(guó)菌種保藏中心。

1.1.2 儀器與試劑

HVA-85高壓滅菌鍋（日本平山Hirayama）；MIR-254培養(yǎng)箱（日本三洋電機(jī)株式會(huì)社）；EZ-Fit六聯(lián)不銹鋼過(guò)濾系統(tǒng)（默克密理博）；CFX96 Touch熒光定量PCR儀（美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad）。

銅綠假單胞菌RPA恒溫?zé)晒鈾z測(cè)試劑盒（安普未來(lái)生物科技有限公司）；細(xì)菌基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；0.45 ?m濾膜（美國(guó)Millipore公司）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、腦心浸出液營(yíng)養(yǎng)肉湯（Brain-Heart Infusion Broth，BHI）、胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptone Soy Agar，TSA）、CN瓊脂均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，且在有效期內(nèi)使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

將銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、大腸埃希氏菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株從超低溫冰箱中取出，劃線接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面進(jìn)行活化，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h。連續(xù)轉(zhuǎn)接2代，恢復(fù)菌種活力。

挑取活化好的純菌落接種于BHI培養(yǎng)基，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h。將培養(yǎng)的菌懸液取出后于3 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入相同體積的無(wú)菌生理鹽水，振蕩混勻，重復(fù)操作2次后，加入生理鹽水，混勻即菌懸液。分別對(duì)菌懸液進(jìn)行

10倍系列稀釋?zhuān)x取適宜稀釋倍數(shù)的菌懸液1 mL加入無(wú)菌平皿中，每個(gè)濃度梯度3個(gè)平板，傾注TSA培養(yǎng)基，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，計(jì)算3塊平板上菌落平均值，確定各菌懸液的菌濃度。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA的提取，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。提取獲得的所有基因組置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RPA恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法

按照RPA實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。根據(jù)待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照的數(shù)量準(zhǔn)備凍干粉，每個(gè)干粉反應(yīng)管加入37.5 μL E buffer，待干粉完全溶解后，加入10 μL核酸模板，再加入2.5 μL B buffer（對(duì)于多個(gè)反應(yīng)，可將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)），轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。將反應(yīng)管上下顛倒8～

10次使各組分充分混合，混勻后，將反應(yīng)液快速離心至管子底部，反應(yīng)管放入熒光檢測(cè)設(shè)備中并記錄樣本放置順序開(kāi)始擴(kuò)增。熒光檢測(cè)程序：恒溫39～

42 ℃，每30 s采集一次FAM通道熒光值，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判定，陽(yáng)性對(duì)照有典型“S”形擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35；陰性對(duì)照未檢出，無(wú)Ct值，則實(shí)驗(yàn)成立，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。在實(shí)驗(yàn)成立條件下，有明顯擴(kuò)增曲線且Ct值≤35，判斷為陽(yáng)性；若35＜Ct≤40，則為可疑，復(fù)檢后結(jié)果仍為35＜Ct≤40且曲線呈“S”形，可判斷為陽(yáng)性，否則為陰性；未出現(xiàn)“S”形擴(kuò)增曲線，無(wú)Ct值，判斷為陰性。

1.2.4 RPA檢測(cè)方法的靈敏度

以檢出銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低濃度評(píng)價(jià)RPA反應(yīng)的靈敏度。取經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的不同稀釋度的菌懸液1 mL分別添加到250 mL桶裝水樣中（樣品預(yù)先按照GB 8538—2022檢測(cè)，未檢出銅綠假單胞菌），用拍擊式均質(zhì)器連續(xù)均質(zhì)1～2 min混勻，用孔徑為0.45 ?m的濾膜過(guò)濾，將濾膜轉(zhuǎn)移至CN平板上（36±1）℃培養(yǎng)48 h，觀察計(jì)數(shù)。同時(shí)另取1 mL樣品稀釋液按1.2.2提取基因組作為DNA模板，進(jìn)行RPA擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2.5 RPA檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度

RPA檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度可以理解為該方法檢測(cè)目標(biāo)微生物的抗干擾能力。在GB 8538—2022和RPA技術(shù)最低檢出限基礎(chǔ)上分別按1倍、2倍、

10倍、100倍濃度添加熒光假單胞菌、大腸埃希氏菌菌懸液以及熒光假單胞菌和大腸埃希氏菌混合菌懸液，充分混合，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法和提取基因組模板進(jìn)行RPA檢測(cè)，比較兩種方法的抗干擾能力，評(píng)價(jià)RPA檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度。

1.2.6 RPA檢測(cè)方法的優(yōu)化

在RPA方法最低檢出限基礎(chǔ)上，將102 CFU·mL-1

銅綠假單胞菌菌懸液分別進(jìn)行2倍、5倍、10倍、100倍稀釋?zhuān)囵B(yǎng)6 h后取菌懸液提取基因組進(jìn)行RPA擴(kuò)增檢測(cè)。探討菌濃度與培養(yǎng)時(shí)間的相關(guān)規(guī)律，優(yōu)化檢測(cè)方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌懸液濃度

如圖1所示，過(guò)夜培養(yǎng)的菌懸液經(jīng)平板計(jì)數(shù)，計(jì)算獲得銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌的濃度、大腸埃希氏菌的濃度分別為3×108 CFU·mL-1、4×108 CFU·mL-1、3×109 CFU·mL-1。

2.2 RPA檢測(cè)方法的靈敏度

分別取不同濃度的銅綠假單胞菌菌懸液提取基因組作為模板，進(jìn)行RPA擴(kuò)增檢測(cè)。RPA擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果如圖2所示，當(dāng)濃度≥102 CFU·mL-1時(shí)，可得到單一擴(kuò)增曲線且Ct值＜35，而當(dāng)菌懸液濃度＜102 CFU·mL-1時(shí)，未出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，無(wú)Ct值，表明該方法檢測(cè)銅綠假單胞菌的最低檢出限為102 CFU·mL-1。重復(fù)檢測(cè)3次均取得一致性結(jié)果。

1～6表示稀釋濃度為3×105～3×100 CFU·mL-1。

圖2 各稀釋度菌懸液RPA擴(kuò)增反應(yīng)曲線

2.3 RPA檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度

熒光假單胞菌、大腸埃希氏菌是常見(jiàn)的與銅綠假單胞菌同時(shí)存在于水體中的微生物，本實(shí)驗(yàn)在

102 CFU·mL-1銅綠假單胞菌菌懸液中按1倍、2倍、10倍、100倍濃度分別添加熒光假單胞菌、大腸埃希氏菌菌懸液、熒光假單胞菌和大腸埃希氏菌混合菌懸液，然后按照GB 8538—2022進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)和提取基因組進(jìn)行RPA擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4、圖5。從擴(kuò)增結(jié)果中可以清晰地看出，改變菌種添加種類(lèi)及比例的混合菌懸液經(jīng)RPA擴(kuò)增反應(yīng)后，均可得到特異性的單一擴(kuò)增曲線，且Ct值＜35，重復(fù)檢測(cè)3次均取得一致性結(jié)果，表明該方法與傳統(tǒng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法同樣具有很好的抗干擾能力。

1為銅綠假單胞菌純菌液，2～5分別為銅綠假單胞菌與大腸埃希氏菌1倍、2倍、10倍、100倍混合菌液。

圖3 銅綠假單胞菌與大腸埃希氏菌混合擴(kuò)增反應(yīng)曲線

2.4 RPA檢測(cè)方法的優(yōu)化

將最低檢出限的銅綠假單胞菌菌懸液分別進(jìn)行

2倍、5倍、10倍、100倍稀釋?zhuān)囵B(yǎng)6 h后進(jìn)行RPA擴(kuò)增檢測(cè)。擴(kuò)增結(jié)果表明，最低檢出限的銅綠假單胞菌菌懸液經(jīng)2倍、5倍、10倍稀釋液后培養(yǎng)

6 h，通過(guò)RPA方法進(jìn)行檢測(cè)可獲得單一擴(kuò)增曲線，且Ct值＜35（圖6），重復(fù)檢測(cè)3次均取得一致性結(jié)果。由此可以看出，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)使目標(biāo)微生物增殖，可提高RPA擴(kuò)增方法的靈敏度。

1為銅綠假單胞菌純菌液，2～5分別為銅綠假單胞菌與熒光假單胞菌1倍、2倍、10倍、100倍混合菌液。

圖4 銅綠假單胞菌與熒光假單胞菌混合擴(kuò)增反應(yīng)曲線

1為銅綠假單胞菌純菌液，2～5分別為銅綠假單胞菌與大腸埃希氏菌、熒光假單胞菌1倍、2倍、10倍、100倍混合菌液。

圖5 銅綠假單胞菌與大腸埃希氏菌、熒光假單胞菌混合擴(kuò)增反應(yīng)曲線

1～4分別為102 CFU·mL-1銅綠假單胞菌2倍、5倍、10倍、100倍稀釋培養(yǎng)。

圖6 不同稀釋倍數(shù)菌懸液培養(yǎng)后RPA擴(kuò)增反應(yīng)曲線

3 結(jié)論與討論

銅綠假單胞菌生存能力強(qiáng)、適應(yīng)力強(qiáng)、分布范圍廣、對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求低，可通過(guò)氣溶膠或水流進(jìn)行傳播，對(duì)公眾健康存在很大的安全隱患。近年來(lái)，成品水中銅綠假單胞菌檢出的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。因此，如何快速識(shí)別水中銅綠假單胞菌污染情況，對(duì)保障公眾飲水安全尤為重要。RPA擴(kuò)增技術(shù)作為一門(mén)新型分子檢測(cè)技術(shù)，目前不僅在醫(yī)學(xué)診斷和動(dòng)植物疫病防御方面應(yīng)用較多，也逐步延伸至食源性致病菌檢測(cè)方面[6]。本研究根據(jù)銅綠假單胞菌保守序列設(shè)計(jì)引物探針，初步建立了銅綠假單胞菌特異性快速檢測(cè)的RPA方法，該方法能夠在40 ℃等溫條件下，

20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因組的擴(kuò)增且具有良好的靈敏性和特異性。與ANUJ等[7]建立的real-time PCR法靈敏性一致。

總之，本研究建立的RPA檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏性高、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)高效，不需要裝備完善的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，為生產(chǎn)企業(yè)出廠檢驗(yàn)和食品監(jiān)管部門(mén)提供了一種快速準(zhǔn)確篩查銅綠假單胞菌的有效工具，更為人們飲水安全提供了有效保障。

參考文獻(xiàn)

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