程曉芳 鄒貴香 周寧菱 劉思萌 黃永芳 馮超義

摘 要：建立一種快速檢測(cè)堿水粑中脫氫乙酸含量的高效液相色譜方法。方法：稱(chēng)取5 g樣品，經(jīng)10%乙醇溶液提取、硫酸鋅溶液+氫氧化鈉溶液沉淀蛋白質(zhì)，定容至25 mL，高速離心后取上層清液過(guò)濾膜，經(jīng)高效液相色譜儀在293 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：脫氫乙酸濃度在1.00～200.00 μg·mL-1時(shí)與峰面積呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8；方法檢出限為0.001 3 g·kg-1，定量限為0.004 g·kg-1；經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為92.42%～98.65%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%～2.50%。結(jié)論：本方法能夠快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)出堿水粑中脫氫乙酸的含量，適合在基層檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)推廣普及，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；脫氫乙酸；堿水粑

Determination of Dehydroacetic Acid in Alkaline Water Cake by HPLC

CHENG Xiaofang1， ZOU Guixiang2， ZHOU Ningling1， LIU Simeng1， HUANG Yongfang1， FENG Chaoyi1

（1.Jingdezhen Market and Quality Supervision and Management Comprehensive Inspection and Testing Center， Jingdezhen 333000， China; 2.Ganzhou Shangyou County Military Grain Supply Station， Ganzhou 341200，China）

Abstract： A high performance liquid chromatography method for dehydroacetic acid in alkaline water was established. Method： 5 g of samples were weighed， extracted by 10% ethanol solution， zinc sulfate solution+sodium hydroxide solution， and settled to 25 mL. After centrifugation， the supernatwas filtered and tested at 293 nm by high-performance liquid chromatography. Result： Dehydroacetic acid concentration was from 1.00 to 200.00 μg·mL-1， the correlation coefficient R2=0.999 8， the detection limit of the method was 0.001 3 g·kg-1， the quantification limit was 0.004 g·kg-1; the recovery rate was 92.42%～98.65% and relative standard deviation ?was 1.32%～2.50%. Conclusion： This method can quickly and accurately detect the content of dehydroacetic acid in the alkaline water cake， which is suitable for the popularization in the basic inspection and testing institutions， and has certain practical application value.

Keywords： high performance liquid chromatography; dehydroacetic acid; alkali water cake

堿水粑又稱(chēng)“灰水糕”“灰水果”，是江西景德鎮(zhèn)市的一種本土特色美食，由大米磨漿后加入堿水，通過(guò)特制的粑篩猛火蒸煮而成，厚度一般10 cm左右[1]。隨著景德鎮(zhèn)市旅游業(yè)的發(fā)展，堿水粑這一傳統(tǒng)美食也受到了越來(lái)越多外地旅客的歡迎，其生產(chǎn)需求量也日益增大。許多不法商販為延長(zhǎng)堿水粑的保質(zhì)期，常會(huì)在生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)加入過(guò)量的防腐劑，特別是脫氫乙酸。脫氫乙酸（Dehydroacetic Acid，DHA）又稱(chēng)脫氫醋酸，常溫下呈白色或淡黃色的結(jié)晶性粉末，不易溶于水，易溶于堿性溶液，是一種低毒高效的新型防腐、防霉劑，其抑菌的效果基本不受食品酸堿度的影響，對(duì)霉菌、酵母菌等真菌以及細(xì)菌等微生物的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用[2-5]。人體若攝入過(guò)多的DHA則會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生一定危害，可能會(huì)出現(xiàn)腸胃不適、代謝紊亂、過(guò)敏反應(yīng)等一系列副作用[6]。因此，準(zhǔn)確且快速地檢測(cè)食品中DHA的含量對(duì)DHA這一防腐劑的使用管控具有非常重要的意義。

目前，測(cè)定DHA含量的方法主要有液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[7-11]，參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）中的前處理方法，本文對(duì)國(guó)標(biāo)方法中提取劑、蛋白沉淀劑、流動(dòng)相及流動(dòng)相比例等條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高檢驗(yàn)檢測(cè)效率，以期建立一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定堿水粑中脫氫乙酸含量的檢測(cè)方法，為更多基層檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)測(cè)定堿水粑中脫氫乙酸含量提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品：堿水粑，購(gòu)自景德鎮(zhèn)市本地市場(chǎng)。試劑：脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，含量100 mg，純度99.9%，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇、乙腈，色譜純，上海捷世凱生物科技有限公司；乙酸銨、硫酸鋅、氫氧化鈉，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；無(wú)水乙醇，分析純，鎮(zhèn)江久億化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Arc HPLC液相色譜儀，配置2998二極管陣列檢測(cè)器；ChromCore C18-AC色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；超純水機(jī)（Millipore EXPRESS40）；

萬(wàn)分之一電子天平（PX-224ZH/E）；十萬(wàn)分之一電子天平（CPA225D）；臺(tái)式離心機(jī)（DT45H），湖南可成儀器設(shè)備有限公司；多管渦旋儀（KN-026S），北京科德諾思技術(shù)有限公司；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE），昆山市超聲儀器有限公司（舒美）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）：稱(chēng)取1.54 g乙酸銨，溶于水并稀釋至1 L；氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）：稱(chēng)取20 g氫氧化鈉，溶于水并稀釋至1 L；硫酸鋅溶液（120 g·L-1）：稱(chēng)取120 g硫酸鋅，溶于水并稀釋至1 L；乙醇溶液（10%）：50 mL無(wú)水乙醇用水稀釋至500 mL。

1.3.2 建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品50.05 mg于50 mL容量瓶中，用10 mL的NaOH溶液溶解，加水定容得到DHA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1.0 mg·mL-1）。分別吸取DHA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.10 mL、1.00 mL、5.00 mL、10.00 mL和20.00 mL于100 mL容量瓶中，加水定容。配制成濃度為1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1、100.0 μg·mL-1和200.0 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 液相色譜條件

本實(shí)驗(yàn)選擇ChromCore C18-AC色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇+0.02mol·L-1乙酸銨（體積比為10∶90，）；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：293 nm；柱溫：30 ℃。

1.3.4 樣品前處理

稱(chēng)取粉碎、均質(zhì)后的樣品約5 g（精確至0.001 g），置于50 mL離心管中，加入10 mL乙醇溶液（10%）、5 mL硫酸鋅溶液（120 g·L-1）、1 mL氫氧化鈉溶液

（20 g·L-1），渦旋振搖5 min，加水稀釋至25 mL刻度線(xiàn)，4 000 r·min-1離心5 min。取上清液過(guò)0.45 ?m水相濾膜，供高效液相色譜測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

選用甲醇+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液、乙腈+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液、甲醇+水以及乙腈+水4種流動(dòng)相進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用乙腈+水和甲醇+水這兩種流動(dòng)相時(shí)，脫氫乙酸的峰型拖尾十分嚴(yán)重，保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，分離效果并不理想；而甲醇+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液和乙腈+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)脫氫乙酸峰型對(duì)稱(chēng)性較好，拖尾現(xiàn)象得到明顯改善，出峰時(shí)間也較為合適，同時(shí)考慮到甲醇與乙腈相比價(jià)格更加實(shí)惠，故最終選擇甲醇+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，以降低基層檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)成本。

2.2 流動(dòng)相比例的選擇

在脫氫乙酸經(jīng)高效液相色譜測(cè)定分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中甲醇的比例對(duì)脫氫乙酸峰型及保留的時(shí)間長(zhǎng)短影響很大，若色譜峰分離的效果不好、拖尾的現(xiàn)象嚴(yán)重就會(huì)導(dǎo)致最終測(cè)定含量的不準(zhǔn)確。因此，比較了不同流動(dòng)相比例（甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸銨溶液=5∶95、甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸銨溶液=10∶90、甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸銨溶液=15∶85）的脫氫乙酸的色譜圖，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相中甲醇比例為5%時(shí)，脫氫乙酸出峰時(shí)間為9.213 min，峰型存在明顯的拖尾，保留時(shí)間將近3 min；當(dāng)流動(dòng)相中甲醇比例為10%時(shí)，脫氫乙酸出峰時(shí)間提前至7.568 min，保留時(shí)間也大大縮短，峰型拖尾現(xiàn)象得到明顯改善，對(duì)稱(chēng)性較好；當(dāng)流動(dòng)相中甲醇比例為15%時(shí)，脫氫乙酸出峰時(shí)間為

5.725 min，保留時(shí)間縮短至1 min左右，峰型對(duì)稱(chēng)性與流動(dòng)相中甲醇比例為10%時(shí)差不多，考慮到出峰時(shí)間過(guò)早可能會(huì)導(dǎo)致樣品中雜質(zhì)分離效果不理想，因此，為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)提高基層檢驗(yàn)檢測(cè)效率，最終選擇流動(dòng)相比例為甲醇+0.02 mol·L-1乙酸銨=10∶90進(jìn)行脫氫乙酸含量測(cè)定分析。

2.3 蛋白沉淀劑的選擇

由于堿水粑中含有豐富的蛋白質(zhì)，因此在前處理過(guò)程中必須進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，常見(jiàn)的蛋白沉淀劑有乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉和硫酸鋅，本實(shí)驗(yàn)對(duì)3種不同蛋白沉淀組合劑（亞鐵氰化鉀+乙酸鋅、亞鐵氰化鉀+硫酸鋅、氫氧化鈉+硫酸鋅）回收率情況進(jìn)行比較。由表1可知，氫氧化鈉+硫酸鋅組合作為測(cè)定蛋白沉淀劑時(shí)回收率最高，同時(shí)考慮到脫氫乙酸易溶于堿性溶液，且配制脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)也需用氫氧化鈉溶液進(jìn)行溶解，故最終決定選用氫氧化鈉+硫酸鋅作為本次實(shí)驗(yàn)的蛋白沉淀劑。

2.4 提取劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇水、乙醇、甲醇、10%乙醇溶液和10%甲醇溶液這5種溶液分別作為提取劑提取樣品中的脫氫乙酸。2種不同加標(biāo)濃度（0.05 g·kg-1和

0.50 g·kg-1）的樣品經(jīng)5種提取劑提取后回收率結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10%乙醇溶液提取的脫氫乙酸回收率最高，故最終選擇10%乙醇溶液作為提取劑。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.5.1 脫氫乙酸線(xiàn)性范圍

將1.3.2配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按1.3.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以脫氫乙酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，如圖2所示。結(jié)果顯示脫氫乙酸濃度在1.0～200.0 μg·mL-1時(shí)，線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為y=20 289x+12 291，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

2.5.2 檢出限、定量限

以S/N=3計(jì)算檢出限，S/N=10計(jì)算定量限，當(dāng)取樣量為5 g時(shí)，脫氫乙酸最低檢出限為0.001 3 g·kg-1，定量限為0.004 g·kg-1。優(yōu)于《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）中對(duì)檢出限和定量限的要求。

2.5.3 方法回收率、精密度

以空白堿水粑為基底，按0.05 g·kg-1，0.25 g·kg-1，0.50 g·kg-1共3個(gè)水平加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算脫氫乙酸回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值。由表3可知，在本研究條件下堿水粑中脫氫乙酸的加標(biāo)回收率為92.42%～98.65%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%～2.50%，結(jié)果符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，因此，本研究方法滿(mǎn)足日常對(duì)堿水粑中脫氫乙酸含量的測(cè)定。

3 結(jié)論

本研究探討了檢測(cè)堿水粑中脫氫乙酸含量的方法。實(shí)驗(yàn)表明，選擇甲醇+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，且甲醇+0.02 mol·L-1乙酸銨=10∶90時(shí)，脫氫乙酸峰型對(duì)稱(chēng)性最好，拖尾現(xiàn)象得到改善；氫氧化鈉+硫酸鋅作為蛋白沉淀劑，10%乙醇溶液作為提取劑時(shí)，堿水粑中脫氫乙酸含量測(cè)定的回收率最高，確保了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。以空白堿水粑作為底物，添加不同濃度水平脫氫乙酸做方法學(xué)驗(yàn)證，得到的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果都符合標(biāo)準(zhǔn)要求。綜上所述，本文建立的高效液相色譜測(cè)定堿水粑中的脫氫乙酸含量的方法具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性較好，適合在基層檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)推廣普及，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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