摘 要 本文介紹近年來利用以甾醇脫氫酶為核心元件的生物合成法制備熊去氧膽酸的研究進展，并提出了該技術(shù)進一步發(fā)展所面臨的挑戰(zhàn)和未來的研究方向，旨在為熊去氧膽酸的生物合成研究提供參考。

關(guān)鍵詞 熊去氧膽酸 甾醇脫氫酶 生物合成

中圖分類號：Q81； Q819 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）07-0016-08

引用本文 游智能， 張仙， 李春秀， 等. 甾醇脫氫酶的基因挖掘、分子改造及其催化合成熊去氧膽酸[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（7）： 16-23.

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（21871085、31971381）

Gene mining and molecular modification of hydroxysteroid dehydrogenase and its catalytic synthesis of ursodeoxycholic acid

YOU Zhineng1， ZHANG Xian1， LI Chunxiu2， XU Jianhe2

（1. Shanghai Bioforany Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 200030， China； 2. School of Biotechnology， East China University of Science and Technology， Shanghai 200237， China）

ABSTRACT The research progress in the biosynthesis of ursodeoxycholic acid with hydroxysteroid dehydrogenase as the core element in recent years is reviewed， and the challenges and future research directions for further development of this technology are proposeed， aiming to provide reference for the ursodeoxycholic acid biosynthesis.

KEY WORDS ursodeoxycholic acid； hydroxysteroid dehydrogenase； biosynthesis

熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid， UDCA）是傳統(tǒng)名貴中藥熊膽粉的主要活性成分，其化學(xué)名為3α，7β-二羥基-5β-膽甾烷-24-酸。UDCA由于藥用價值高、安全性好，廣泛用于利膽溶石和治療各種肝膽疾病[1]，臨床需求量日漸增大，致使對其藥理機制和合成制備相關(guān)的研究也趨增多。1997年，UDCA還成為第一個被美國FDA批準用于治療原發(fā)性膽汁性肝硬化的藥物[2]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，UDCA類藥物可通過其本身具有的抑制轉(zhuǎn)錄因子法尼醇受體的作用來關(guān)閉血管緊張素轉(zhuǎn)化酶受體通道，而該通道是新型冠狀病毒及其各種變體感染人體細胞的主要通道。換言之，UDCA類藥物在預(yù)防新型冠狀病毒感染方面也有很大的臨床應(yīng)用潛力[3]。

當(dāng)前，UDCA主要有3個來源，分別是“活熊取膽”、化學(xué)合成和生物合成。其中，“活熊取膽”是從飼養(yǎng)的黑熊或棕熊體內(nèi)抽取熊膽汁并提取天然UDCA的方法，這種方法既違背自然倫理且不可持續(xù)，也不利于國家對于瀕危動物（黑熊是國家二級保護動物）的保護。利用化學(xué)方法人工合成UDCA的原料主要有2類：一類是來源于動物的膽汁酸類化合物，包括鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid， CDCA）、膽酸（cholic acid， CA）、石膽酸（lithocholic acid， LCA）、豬膽酸（hyocholic acid， HCA）和豬去氧膽酸（hyodesoxycholic acid， HDCA）；另一類是來源于植物的非膽汁酸類化合物，主要包括黃體酮和雄甾烯二酮。然而，化學(xué)合成方法通常需要進行多個保護與脫保護反應(yīng)步驟，且化學(xué)反應(yīng)條件相對苛刻，并會用到有毒和危險試劑（如CrO3和吡啶）。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，利用生物方法合成UDCA的研究越來越多。

生物催化和生物轉(zhuǎn)化具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點，是最有望拓展化學(xué)工業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的技術(shù)，而酶則是生物催化技術(shù)的核心元件[4-5]。如圖1所示，當(dāng)前工業(yè)上以CDCA為起始原料全酶法合成 UDCA和以CA為起始原料化學(xué)-酶法合成UDCA過程中均要用到甾醇脫氫酶（hydroxysteroid dehydrogenases， HSDHs）。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在對UDCA酶法合成過程中所需關(guān)鍵酶HSDHs的基因挖掘、分子改造及其合成應(yīng)用等方面進行了大量的研究，并取得了一些可喜的研究進展。

1 HSDHs的分類與反應(yīng)機制

HSDHs屬于NAD（P）H依賴型氧化還原酶，可催化膽汁酸甾體結(jié)構(gòu)骨架上羰基的還原或羥基的氧化，二者互為可逆過程[6]。HSDHs具有很好的立體選擇性和區(qū)域選擇性，故通常按照它們作用的選擇性來進行分類，如7α-HSDH能夠?qū)Ｒ恍缘貙⒛懼徵摅w結(jié)構(gòu)骨架上的7α-羥基氧化為羰基或?qū)7位羰基還原為7α-羥基，7β-HSDH則可專一性地將膽汁酸甾體結(jié)構(gòu)骨架上的C7位羰基還原為7β-羥基或?qū)?β-羥基氧化為羰基[7]。UDCA酶法合成過程中所需的關(guān)鍵酶主要有3α-HSDH（EC 1.1.1.50）、12α-HSDH（EC 1.1.1.176）、7α-HSDH（EC 1.1.1.159）和7β-HSDH（EC 1.1.1.201）。

3α-HSDH最早發(fā)現(xiàn)于哺乳動物細胞中，后在腸道細菌中也檢測到了3α-HSDH活性[6]。目前，來源于大鼠肝臟、Comamonas testosteroni和Eggerthella sp. CAG： 298的3α-HSDH的基因序列已被成功克隆并異源表達[8-9]。大鼠肝臟來源的3α-HSDH屬于醛酮還原酶超家族（aldoketo reductase superfamily， AKR）[10]。His-Tyr-Lys是AKR的催化三聯(lián)體，它們位于AKR的N端，Tyr和Lys為催化殘基，Asp負責(zé)降低催化殘基的酸度系數(shù)，His接收來自于Tyr的電子[10]。AKR在Lys和Tyr的作用下將底物醇的[H]傳遞給NAD（P）+，即可完成底物醇氧化轉(zhuǎn)化為酮的過程[10]。

除了大鼠肝臟來源的3α-HSDH屬于AKR，來源于Comamonas testosteroni的3α-HSDH以及12α-HSDH、7α-HSDH和7β-HSDH均屬于短鏈脫氫酶超家族（shortchain dehydrogenase/reductase superfamily， SDR）[11]。SDR的催化三聯(lián)體是Ser-Tyr-Lys，其催化的反應(yīng)過程遵循順序Bi-Bi機制，即輔酶NAD（P）H先與酶蛋白結(jié)合，隨后底物再進入酶的活性口袋中；Ser通過與底物形成氫鍵識別并穩(wěn)定底物，NAD（P）H的[H]轉(zhuǎn)移至底物的羰基碳上形成中間態(tài)，同時Tyr作為催化酸將[H]轉(zhuǎn)移至底物的羰基氧上形成產(chǎn)物醇，失去的[H]將從溶劑中獲取，Lys則通過靜電相互作用降低Tyr的酸度系數(shù)；反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物醇從酶的活性口袋中被釋放出來，隨即NAD（P）+與酶分離[12]。

2 HSDHs的基因挖掘

盡管許多HSDHs已被發(fā)現(xiàn)并初步應(yīng)用于UDCA的酶法合成研究，但具有基因序列報告的HSDHs依然較少。不少研究致力于發(fā)現(xiàn)新的HSDHs基因，以期獲得性能更優(yōu)的天然HSDHs。傳統(tǒng)的從土壤中篩選具有相應(yīng)催化能力的目標野生型菌株，再從中獲取酶基因的方法，不僅步驟多、周期長，而且效率低下，不能滿足當(dāng)前的快速發(fā)掘生物催化劑的要求。隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展以及基因與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的快速擴容，利用已報告的有活性的功能序列作為探針，在宏大的基因組數(shù)據(jù)中搜索并釣取潛在的目標酶基因，隨后將其克隆表達獲得酶制劑，再通過功能檢測即可望篩選得到具有相關(guān)催化活性的目標酶。這種基于公開數(shù)據(jù)庫的基因組挖掘技術(shù)具有操作簡便、周期短等優(yōu)點，在工業(yè)用新酶開發(fā)中得到了廣泛應(yīng)用。

2015年，Zheng等[13]利用來源于Collinsella aerofaciens和Clostridium absonum的2種7β-HSDH的蛋白序列作為探針，在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行Blastp比對分析，最終從Ruminococcus torques挖掘得到1種新的Rt7β-HSDH，后者的比活性為8.6 U/mg。這是第一次利用數(shù)據(jù)庫挖掘方法發(fā)現(xiàn)的新型HSDH。2017年，Song等[14]利用宏基因組技術(shù)，在黑熊的排泄物中鑒定出5種新型7α-HSDH（S1-a-1、S1-a-2、H1-a-1、H1-a-2和Y1-a-1）和1種新型7β-HSDH（Y1-b-1），它們均來源于黑熊的腸道微生物，豐富了7α/7β-HSDH酶庫。

2019年，Tonin等[15]利用數(shù)據(jù)庫挖掘方法，分別從Stenotrophomonas maltophilia和Lactobacillus spicheri中克隆出Sm7α-HSDH和Ls7β-HSDH，它們的比活性分別為430和3.1 U/mg。值得一提的是，Ls7β-HSDH是第一種具有基因序列報告的天然NADH依賴型7β-HSDH。在這之前，所有具有基因序列報告的7β-HSDH均為NADPH依賴型。此外，雖然來源于Xanthomonas maltophilia的7β-HSDH和7α-HSDH均從野生菌株中被分離、純化出來并被表征為NADH依賴型，但它們的基因序列并未公開[16]。

2019年，Chen等[17]利用Ec7α-HSDH和Cae7β-HSDH的蛋白序列作為探針，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索，最終挖掘得到來源于Brevundimonas sp.的Bs7α-HSDH和來源于Clostridium sp. Marseille的Cm7β-HSDH，它們的比活性分別為471和26.5 U/mg。

2020年，Bertuletti等[18]利用宏基因組技術(shù)，從極端微生物中克隆出8種新型HSDHs，包括1種12α-HSDH、3種7α-HSDH和4種7β-HSDH，并研究了這些酶的底物混亂性。研究結(jié)果不僅擴大了HSDHs酶庫，而且拓展了HSDHs的應(yīng)用范圍（不再局限于膽汁酸類化合物的生物合成）。

相較于7α-HSDH和7β-HSDH，對12α-HSDH的基因挖掘研究則較少。2019年，Tonin等[19]從Eggerthella lenta挖掘到一種新的El12α-HSDH，后者是第一種有蛋白序列報告的NADH依賴型12α-HSDH，其比活性達到76 U/mg。同年，Shi等[20]提出了一種結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的基因挖掘（structure-guided genome mining， SGGM）策略：首先通過分析比較NADPH依賴型Cl12α-HSDH（圖2A）和NADH依賴型El12α-HSDH（圖2B）的輔酶結(jié)合口袋空間結(jié)構(gòu)的差異，并對保守的輔酶結(jié)合基序進行比對，解析比較12α-HSDH與NADP+和NAD+的作用機制，再基于此從NCBI數(shù)據(jù)庫中定向挖掘到一種來源于Rhodococcus ruber的NADH依賴型Rr12α-HSDH（圖2C），其比活性達289 U/mg，為目前報告的活力最高的12α-HSDH。

SGGM策略較傳統(tǒng)的基因挖掘方法更加理性，準確性也更高。基于SGGM策略，2023年，Huang等[21]從Candidatus Ligilactobacillus excrementigallinarum挖掘到一種新的NADH依賴型Cle7β-HSDH，其比活性達9.6 U/mg，是當(dāng)時已報告的活力最高的NADH依賴型7β-HSDH。

3 HSDHs的分子改造

天然酶分子往往不能耐受工業(yè)反應(yīng)器中苛刻的操作環(huán)境，高溫、高pH、高濃度的底物或產(chǎn)物和有機溶劑等均可能會抑制酶的催化性能[22]。因此，需要對天然酶進行分子改造，以獲得符合工業(yè)應(yīng)用要求的優(yōu)良突變體。

目前，對HSDHs的分子改造研究主要集中在對7α-HSDH和7β-HSDH的改造方面。2017年，Bakonyi等[23]通過定點突變（A37D），將來源于Clostridium difficile的Cd7α-HSDH的輔酶偏好性由NADP+改造為NAD+，但酶活性下降了近10倍。這是首次對HSDHs的輔酶特異性實施改造。2019年，Huang等[24]對來源于Clostridium absonum的Cab7α-HSDH進行定向進化，所獲雙突變體（Q255L/C260S）的比活性由母本的5.7 U/mg提高至36.8 U/mg，且突變體對底物的耐受性也有很大的提高。2021年，Liu等[25]發(fā)現(xiàn)，對于來源于Brucella melitensis的Bm7α-HSDH，一個點突變（I258M）就可同時提高酶的催化效率、對輔酶的親和力和熱穩(wěn)定性。Liu等[26]隨后還研究了末端修飾對Bm7α-HSDH的催化效率和熱穩(wěn)定性的影響，為HSDHs的分子改造提供了新的思路。2023年，Pan等[27]對St-2-2 7α-HSDH的255位異亮氨酸的改造研究亦發(fā)現(xiàn)，僅這一個點的突變就可以改變酶的底物偏好、催化活性和熱穩(wěn)定性。

2017年，Zheng等[28]首次提出了多目標協(xié)同進化（multiobjective directed evolution）策略，對來源于Ruminococcus torques的Rt7β-HSDH的活性、熱穩(wěn)定性和最適pH同時進行進化，所獲雙突變體（T189V/ V207M）的比活性較母本提高5.5倍，熱穩(wěn)定性提高3倍，且最適pH從6.5轉(zhuǎn)變?yōu)?.5。隨后，You等[29]又通過對Rt7β-HSDH輔酶保守結(jié)構(gòu)域的序列比對和輔酶結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)分析，建立了快速、定向創(chuàng)制NADH依賴型HSDHs的輔酶特異性反轉(zhuǎn)之小巧突變庫設(shè)計（cofactor specificity reversal： small-and-smart library design）方法，實現(xiàn)了Rt7β-HSDH輔酶偏好性由NADPH到NADH約953 000倍的理性反轉(zhuǎn)，將酶對NADH的比活性提高了223倍，由此獲得了第一種NADH依賴型非天然7β-HSDH工程酶。

2019年，Tonin等[15]利用定點飽和突變技術(shù)，通過對來源于Clostridium absonum的Cab7β-HSDH的T17、E18、G39、R40和R41 5個位點進行突變分析，最終得到一種四重突變體（T17A/G39D/R40L/R41N），該突變體的輔酶偏好性由母本的NADPH依賴型被改造為 NADH依賴型，但其比活性下降了3.2倍。

迄今為止，尚未見有對3α-HSDH和12α-HSDH的分子改造研究報告。

4 HSDHs在UDCA合成中的應(yīng)用

通過對HSDHs的基因挖掘和分子改造，研究人員得到了一系列具有一定工業(yè)應(yīng)用潛力的酶催化劑，并將它們應(yīng)用于UDCA及其衍生物的酶法合成。2019年，Tonin等[15]和Zhang等[30]各自將7α-HSDH催化的氧化反應(yīng)和7β-HSDH催化的還原反應(yīng)耦聯(lián)起來，構(gòu)建成一個氧化還原自給自足的雙酶“借氫”級聯(lián)反應(yīng)，實現(xiàn)了輔酶的內(nèi)部自循環(huán)而不需要額外構(gòu)建輔酶循環(huán)系統(tǒng)，可將CDCA直接轉(zhuǎn)化為UDCA（圖3）。Xu等[31]和Ji等[32]則分別利用這一氧化還原自給自足的雙酶“借氫”級聯(lián)反應(yīng)體系，將來源于雞膽粉的?；蛆Z去氧膽酸直接轉(zhuǎn)化為?；切苋パ跄懰?。但是，由于受到化學(xué)平衡的限制，最終的轉(zhuǎn)化率只能達到70%～92%，產(chǎn)物分離純化的難度較大。

為了將CDCA完全轉(zhuǎn)化為UDCA，通常需要構(gòu)建兩步輔酶相互獨立的酶法級聯(lián)反應(yīng)體系，每一步都耦聯(lián)合適的輔酶再生系統(tǒng)，以促進輔酶的循環(huán)再生和底物的完全轉(zhuǎn)化。2015年，Zheng等[13]通過構(gòu)建兩步輔酶相互獨立的酶法級聯(lián)反應(yīng)體系，成功地將底物CDCA轉(zhuǎn)化為UDCA：如圖4A所示，選用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）/丙酮酸作為氧化反應(yīng)的輔酶再生系統(tǒng)，CDCA在7α-HSDH的作用下完全轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物7-羰基-LCA；同時，以葡萄糖脫氫酶（glucose dehydrogenase， GDH）/葡萄糖作為還原反應(yīng)的輔酶循環(huán)系統(tǒng)，中間產(chǎn)物7-羰基-LCA在7β-HSDH的作用下轉(zhuǎn)化為UDCA。2018年，Zheng等[33]又進一步地將氧化反應(yīng)過程中的2種酶（7α-HSDH和LDH）和還原反應(yīng)過程中的2種酶（7β-HSDH和GDH）分別共固定化，進而設(shè)計出一種填充床式串聯(lián)反應(yīng)器，實現(xiàn)了從CDCA到UDCA的連續(xù)酶法轉(zhuǎn)化，UDCA的時空產(chǎn)率（space-time yield， STY）達到88.5 g/（L·d）（圖4B）。

2019年，Chen等[17]報告了一種通過“一鍋”級聯(lián)反應(yīng)體系將CDCA轉(zhuǎn)化為UDCA的方法，即利用黃素還原酶（flavin reductase， FR）/黃素單核苷酸（flavin mononucleotide， FMN）和醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase， ADH） /異丙醇系統(tǒng)分別再生NAD+和NADPH，二者互不干擾。如圖5所示，以“一鍋兩步”反應(yīng)模式，可以將30 mmol/L CDCA完全轉(zhuǎn)化為UDCA，分離得率為92%；以“一鍋一步”反應(yīng)模式，只能將 12.5 mmol/L CDCA完全轉(zhuǎn)化為UDCA，分離得率為78%。造成這種差異的原因可能是高濃度的產(chǎn)物對反應(yīng)體系中的酶產(chǎn)生了抑制作用。

2022年，Li等[34]將7α-HSDH催化的反應(yīng)中所使用的輔酶再生系統(tǒng)LDH/丙酮酸替換為更綠色清潔的NAD（P）H氧化酶/氧氣，同時通過構(gòu)建微反應(yīng)器系統(tǒng)提高反應(yīng)體系的供氧水平（圖6），由此強化NAD（P）H氧化酶的再生效率和7α-HSDH的反應(yīng)效率。當(dāng)?shù)孜镙d量為50 mmol/L時，該反應(yīng)體系可以在30 min內(nèi)將92%的CDCA轉(zhuǎn)化為7-羰基-LCA，STY達到862 g/（L·d），較攪拌式批反應(yīng)器提高約96倍，且輔酶的總轉(zhuǎn)換數(shù)也提高了10倍，酶消耗數(shù)降低7倍。同年，Li等[35]又構(gòu)建了一個填充床式連續(xù)流反應(yīng)器系統(tǒng)（圖7），利用共固定化的 7β-HSDH和異丙醇脫氫酶（isopropanol dehydrogenase， IPADH）將7-羰基-LCA轉(zhuǎn)化為UDCA，最終STY達到1 040 g/（L·d）。此外，通過輔酶的回收再利用，成功地將UDCA的生產(chǎn)成本降低了約21%。

迄今報告的以CDCA為底物經(jīng)過兩步酶法合成UDCA的研究，雖然最高STY可以達到942 g/（L·d），但底物CDCA的濃度最高只有100 mmol/L，導(dǎo)致輔酶的總轉(zhuǎn)換數(shù)較低，實際應(yīng)用時會出現(xiàn)輔酶NADP+所占成本過高等問題[28]。造成這種現(xiàn)象的原因是由于HSDHs在反應(yīng)條件下極其不穩(wěn)定，特別是膽汁酸類化合物會導(dǎo)致 HSDHs嚴重失活，使之無法實現(xiàn)高濃度的底物轉(zhuǎn)化[29]。

5 小結(jié)

UDCA既是傳統(tǒng)中藥熊膽粉的有效活性成分，也是臨床上用于治療膽固醇性結(jié)石和膽汁淤積性肝膽病的首選藥物。隨著全球?qū)DCA需求量的逐漸增大，從熊膽汁中獲取UDCA顯然已不能滿足市場的需求，更何況“活熊取膽”方法并不可?。ㄟ`背倫理、不可持續(xù)，且不利于黑熊、棕熊等瀕危動物保護）。利用化學(xué)方法合成UDCA需要經(jīng)過多個羥基保護/脫保護步驟，步驟繁瑣、條件苛刻、總收率不高，還會用到危險和有毒試劑，產(chǎn)生對環(huán)境有害的廢物。利用以酶為核心元件的生物方法替代或改進傳統(tǒng)的UDCA化學(xué)合成工藝，可以縮短合成路線，避免或減少有害且昂貴化學(xué)試劑的使用，降低能耗并減少污染物的排放。

目前，將HSDHs應(yīng)用于UDCA生物合成所用的原料主要為CDCA。以CDCA為底物，通過兩步酶法（7α-HSDH和7β-HSDH）就可以將其轉(zhuǎn)化為UDCA。然而，現(xiàn)已報告的HSDHs大多無法耐受高濃度的底物/產(chǎn)物，工業(yè)生產(chǎn)條件下容易失活，故反應(yīng)過程中往往需要添加大量的酶催化劑和輔酶以加快反應(yīng)速率，讓酶在較短時間內(nèi)將底物轉(zhuǎn)化完全，但這樣也就產(chǎn)生了生產(chǎn)成本過高的問題。由此可見，HSDHs在工業(yè)生產(chǎn)條件（高底物/產(chǎn)物濃度）下的不穩(wěn)定性是當(dāng)前酶法制備UDCA的關(guān)鍵限制性因素。

針對上述問題，未來應(yīng)從以下3個方面進行更為深入的研究：①解析HSDHs的晶體結(jié)構(gòu)，借助分子動力學(xué)模擬和光譜分析技術(shù)探索底物/產(chǎn)物使酶失活的機制，分析酶在高底物/產(chǎn)物濃度下維持穩(wěn)定構(gòu)象的關(guān)鍵性殘基和結(jié)構(gòu)域，揭示酶耐受性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子作用機制；②對酶分子中的關(guān)鍵殘基或結(jié)構(gòu)域進行（半）理性設(shè)計，并對其應(yīng)用性能進行研究，創(chuàng)制新型高耐受性HSDHs，為UDCA的生物合成提供高效的工業(yè)酶元件；③利用創(chuàng)制的優(yōu)質(zhì)酶突變體，為UDCA的生物合成構(gòu)建一個綠色、高效、經(jīng)濟的酶催化生產(chǎn)工藝體系，從而為最終實現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅實的基礎(chǔ)。

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