摘 要 目的：探討CARD6在膿毒癥心肌損傷中的調(diào)節(jié)機制。方法：將C57BL/6小鼠隨機分為對照組與模型組。采用LPS腹腔注射法構(gòu)建膿毒癥心肌損傷小鼠模型，RT-qPCR檢測小鼠心肌組織中CARD6、caspase-1的mRNA水平。體外實驗則采用LPS刺激轉(zhuǎn)染CARD6過表達質(zhì)粒的H9C2細(xì)胞，檢測caspase-1、細(xì)胞活力、CK-MB水平。結(jié)果：與對照組相比，模型組小鼠心肌組織中LDH、CK-MB含量，caspase-1表達水平上升，提示膿毒癥導(dǎo)致小鼠心肌損傷，而CARD6表達水平明顯降低。體外實驗發(fā)現(xiàn)CARD6表達水平呈下降趨勢，轉(zhuǎn)染含有CARD6的過表達質(zhì)粒后細(xì)胞釋放CK-MB的水平降低、細(xì)胞活力增加、caspase-1水平降低。結(jié)論：CARD6可改善膿毒癥所致心肌損傷，其機制可能與caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相關(guān)。

關(guān)鍵詞 CARD6 caspase-1 細(xì)胞焦亡 膿毒癥 心肌損傷

中圖分類號：R363.21； R542.2 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）05-0039-04

引用本文 李一民， 石寧寧， 曲央旺姆， 等. CARD6在膿毒癥心肌損傷中的機制研究[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（5）： 39-42； 69.

基金項目：西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金聯(lián)合項目（XZ202101ZR0011G）；西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金組團式醫(yī)學(xué)援藏項目[XZ2020ZR-ZY40（Z）]

Study on the role of CARD6 in the sepsis-induced myocardial injury

LI Yimin1， SHI Ningning1， QU Yangwangmu1， XIN Yong1， ZHOU Wugang2

（1. Department of Intensive Care Unit， Shigatse People’s Hospital， Shigatse 857000， China； 2. Department of Emergency， Shanghai Ninth People’s Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200011， China）

ABSTRACT Objective： To explore the regulatory mechanism of CARD6 in sepsis-induced myocardial injury. Methods： C57BL/6 mice were randomly divided into a control group and a sepsis model group. A mouse model of sepsis-induced myocardial injury was constructed using LPS intraperitoneal injection method， and the mRNA expression levels of CARD6 and caspase-1 in mouse myocardial tissue were detected by RT-qPCR. In vitro， H9C2 cells were stimulated by LPS and transfected with overexpression plasmid containing CARD6， and the levels of caspase-1， cell viability and CK-MB content were detected. Results： Compared with the control group， the contents of LDH and CK-MB in myocardial tissue of mice increased in the model group， suggesting that sepsis can cause myocardial damage in mice. In addition， the expression level of CARD6 in the cardiac tissue of the model group was significantly reduced. The intracellular CARD6 expression level in the LPS-treated H9C2 cell also showed a downstream trend. After transfection with the overexpression plasmid containing CARD6， the release of CK-MB levels in H9C2 cells decreased， cell viability increased and the expression level of caspase-1 decreased. Conclusion： CARD6 can ameliorate myocardial injury caused by sepsis and its mechanism may be related to caspase-1 mediated pyroptosis.

KEY WORDS CARD6； caspase-1； pyroptosis； sepsis； myocardial damage

膿毒癥是由感染誘發(fā)的患者機體反應(yīng)失調(diào)狀態(tài)，若不能及時進行治療會導(dǎo)致患者循環(huán)功能障礙及器官功能損害[1-2]。膿毒癥最常引起的器官功能障礙是心臟功能異常[3]，至少有40%的膿毒癥患者患有突發(fā)性心悸等心功能障礙，但目前膿毒癥誘發(fā)的心功能障礙的病理生理學(xué)機制尚不明確[4]。

胱天蛋白酶募集域蛋白6（caspase recruitment domain family member 6，CARD6）是CARDs家族的成員，該家族的蛋白成員都具有一個CARD結(jié)構(gòu)域。有研究表明CARD6可與受體相互作用蛋白（RIP）激酶家族成員形成復(fù)合體，作為NOD樣受體（NOD-like receptors， NLRs）及TLR樣受體（Toll-like receptor，TLRs）通路的重要介導(dǎo)途徑，激活NF-kB等信號通路，在機體先天性及后天性免疫反應(yīng)和炎癥應(yīng)答等方面起重要調(diào)控作用，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[5]。但CARD6在膿毒癥心肌損傷中的作用機制研究目前尚未見相關(guān)報告。本研究將分析并闡述CARD6 在膿毒癥所致心肌損傷中的分子機制，旨在為膿毒癥心肌損傷的臨床防治提供新的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物，細(xì)胞及相關(guān)試劑

實驗所需6～8周齡C57BL/6J 雄性小鼠（18～23 g，SPF級）由上海交通大學(xué)實驗動物中心提供；心肌細(xì)胞H9C2購于上海引昊生物科技有限公司；caspase-1購自英國Abcam公司；CARD6引物、過表達質(zhì)粒（LVCARD6）均由上海引昊生物科技有限公司構(gòu)建合成。脂多糖（lipopolysaccharides， LPS）購自美國Sigma公司；肌酸激酶同功酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒均購自上海爵文生物科技有限公司。

1.2 構(gòu)建LPS膿毒癥心肌損傷小鼠模型

將C57BL/6J小鼠隨機分成假手術(shù)組（對照組，n=6）和膿毒癥心肌損傷組（模型組，n=6）。模型組在腹腔注射LPS（10 mg/kg）0.2～0.25 mL，籠養(yǎng)24 h，構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的膿毒癥造成的心肌損傷模型。對照組腹腔注射與LPS等量的生理鹽水。造模成功后，處死小鼠，分離小鼠心肌組織并冷凍在液氮中備用。

1.3 H9C2及過表達CARD6后LPS刺激的細(xì)胞實驗分組

H9C2細(xì)胞在含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液、于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)1 d后換液，隨后2～3 d根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)換液后繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)?；駽ARD6過表達質(zhì)粒后培養(yǎng)24 h，加入LPS（終濃度為 10 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后進行相對表達量的檢測。按照實驗?zāi)康姆譃?組，即LPS組（體外膿毒癥心肌損傷模型，加入溶于PBS（0.01 mol/L pH 7.2 磷酸緩沖液）的LPS至終濃度10 μg/mL，培養(yǎng)24 h）、NC組（對照，加入與LPS等體積的生理鹽水常規(guī)培養(yǎng)24 h）、空載質(zhì)粒+LPS組（LPS+NC）和CARD6過表達質(zhì)粒+LPS組（LPS+CARD6）（參照LPS組處理）。

1.4 ELISA檢測LDH和CK-MB水平

依ELISA試劑盒說明書檢測兩組小鼠心肌組織或H9C2各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶同功酶（creatine kinase isoenzymes，CK-MB）水平。

1.5 細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法測定細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞，按每孔8×103細(xì)胞接種于96孔板中，每組3個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基。使用酶標(biāo)儀于450 nm波長下檢測各孔光密度（OD）值。

1.6 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR， RT-qPCR）法檢測CARD6、caspase-1 mRNA相對表達水平

利用TRIzol試劑提取心肌組織或H9C2細(xì)胞樣本中總RNA，根據(jù) PrimeScript RT Master Mix的說明書，使用引物從RNA中反轉(zhuǎn)錄提取 cDNA，所有 cDNA 在使用前保存在？80 ℃。反應(yīng)條件：變性95 ℃ 5 min，退火94 ℃ 30 s，延伸60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；熔解程序：按照儀器的默認(rèn)程序。完成后分析擴增曲線，計算Ct值，以U6為內(nèi)參，運用2-△△Ct法計算各組間mRNA相對表達量[6]，實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥和對照組小鼠心肌組織中CK-MB、LDH含量的比較

用ELISA試劑盒檢測對照組和模型組小鼠心肌組織中CK-MB、LDH含量，經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組小鼠心肌組織中CK-MB（圖1A，P=0.000 1）及LDH含量（圖1B，P=0.000 7）明顯增高。上述實驗結(jié)果證實，我們成功建立了膿毒癥心肌損傷模型。

2.2 膿毒癥和對照組小鼠心肌組織中CARD6、caspase-1 mRNA表達水平的比較

為了探究CARD6及caspase-1是否參與膿毒癥心肌損傷過程，我們采用RT-PCR檢測了上述指標(biāo)在對照組及模型組中mRNA 水平的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組中小鼠心肌組織中caspase-1 mRNA表達水平顯著上升（圖2A，P=0.003 0），而CARD6 mRNA表達水平顯著降低（圖2B，P=0.001 2）。上述結(jié)果表明，CARD6、caspase-1 均參與膿毒癥心肌損傷進程。

2.3 H9C2細(xì)胞過表達CARD6后，caspase-1 mRNA表達量、CK-MB含量和細(xì)胞活力水平的變化

為了進一步探究CARD6是否可調(diào)控caspase-1表達，并參與膿毒癥心肌損傷。我們采用CARD6過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，并采用RT-PCR檢測了caspase-1 mRNA的表達水平，ELISA實驗檢測了CK-MB表達量及CCK8實驗檢測了細(xì)胞活力。實驗結(jié)果顯示，與NC組相比，LPS組中caspase-1 mRNA表達量顯著上升（圖3A，P=0.007 7）、CK-MB含量明顯上升（圖3B，P=0.000 6）、細(xì)胞活性顯著下降（圖3C，P=0.009 1），表明在膿毒癥細(xì)胞模型中LPS刺激后，caspase-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷明顯增強。

過表達CARD后，再用LPS刺激H9C2細(xì)胞時，與LPS+NC組相比，LPS+ CARD6組caspase-1 mRNA表達量顯著下降（圖3A，P=0.003 4）、CK-MB含量明顯降低（圖3B，P=0.009 9）、細(xì)胞活力有顯著提高（圖3C，P=0.006 9）。上述結(jié)果提示，CARD6對LPS誘發(fā)的心肌損傷有保護作用，CARD6通過調(diào)控caspase-1，而參與膿毒癥心肌損傷進程。

3 討論

膿毒癥心肌損傷的發(fā)病機制至今仍未完全明了，目前存在多種假說，如細(xì)胞因子穩(wěn)態(tài)失衡[7-8]、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載[9]以及一氧化氮（NO）的影響[10]等。對膿毒癥心肌損傷的診斷及治療，雖存在多種治療方案，但依然不能很好地診斷及治療。因此，進一步探究膿毒癥心肌損傷可能的發(fā)生機制，對于減少患者的并發(fā)癥，改善患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。

本研究通過LPS誘導(dǎo)法建立膿毒癥小鼠心肌損傷模型，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中的CK-MB、LDH水平明顯升高（P<0.001），表明膿毒癥小鼠心肌損傷模型建立成功。在建立成功的小鼠模型組中進一步檢測并比較心肌組織中CARD6 mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組小鼠心肌組織中caspase-1 mRNA表達顯著上升，而CARD6 mRNA表達則顯著降低（P<0.01），提示CARD6在膿毒癥心肌損傷中可能具有一定的保護作用，其作用機制可能與caspase-1介導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)。為了進一步探討CARD6與膿毒癥心肌損傷的相關(guān)性，我們采用LPS處理H9C2細(xì)胞來構(gòu)建體膿毒癥心肌體外損傷模型，隨后向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CARD6過表達質(zhì)粒以做干預(yù)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了CARD6過表達質(zhì)粒后細(xì)胞的CK-MB含量明顯降低（P<0.01），caspase-1 mRNA表達量顯著下降（P<0.01），同時細(xì)胞活力有顯著上升（P<0.01），進一步表明CARD6對膿毒癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷起到了保護作用。上述結(jié)果表明，CARD6在膿毒癥心肌損傷過程中發(fā)揮保護作用，其機制可能與其抑制炎癥反應(yīng)及caspase-1引發(fā)的細(xì)胞焦亡相關(guān)。

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡方式，是一種特定的細(xì)胞程序性、炎性死亡方式[11]，其發(fā)生的過程依賴于半胱氨酸依賴性caspases家族的炎性蛋白酶的活性[12]，突出的特點是死亡細(xì)胞發(fā)生水腫，進而迅速地發(fā)生質(zhì)膜破裂，釋放出包括白介素-1b（IL-1b）、白介素-18（IL-18）及高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）等細(xì)胞內(nèi)容物和炎性介質(zhì)[13]，從而進一步加重宿主的炎癥反應(yīng)。

CARD6是CARDs家族的成員，在肺、脾、胃等多器官組織中高表達，能夠激活NF-κB等信號通路，從而廣泛參與炎癥和細(xì)胞凋亡等相關(guān)過程[14]。目前的研究表明，CARD6與RIP激酶家族成員蛋白RICK結(jié)合后可以招募蛋白NEMO，進而活化NF-κB，調(diào)控炎癥反應(yīng)。同時，RICK的激酶活性可以啟動p38-MAPK信號通路，進而也促進產(chǎn)生炎癥因子[15]。CARD6 是肝臟缺血再灌注損傷時體內(nèi)炎癥反應(yīng)和NF-kB信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子，其在肝臟缺血再灌注損傷中對缺血肝細(xì)胞具有保護作用[16]。還有研究顯示，過表達的CARD6可以抑制細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激等過程來發(fā)揮對受損脊髓的保護作用[17]。這些結(jié)果表明，CARD6在多種信號通路中作為關(guān)鍵信號發(fā)揮作用。但目前關(guān)于CARD6介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在膿毒癥引發(fā)的心肌損傷方面的機制研究尚不明確。既往研究顯示，LPS可與CARD結(jié)構(gòu)域相互作用，進而激活caspase引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)，促進炎性因子的成熟[18]。caspase-1是細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，與炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)[19]。敲除大鼠編碼caspase-1的基因后，可明顯緩解膿毒癥模型癥狀進展[20]。

綜上所述，我們的研究表明，促進CARD6的表達，可以抑制膿毒癥心肌損傷的進展，這一作用機制可能與caspase-1調(diào)控的炎癥因子成熟相關(guān)。本研究將為臨床膿毒癥心肌損傷的防控提供新的生物標(biāo)志物及治療靶點。

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