朱津宏 熊若男 楊思琪 高南 吳永紅 張振超 吳國平 申衛(wèi)收

摘要：復墾土地是重要的后備土地資源，但通常土壤結(jié)構(gòu)差、有機質(zhì)和養(yǎng)分含量低;增施有機肥是快速提升地力的關(guān)鍵途徑，但會造成溫室氣體如氧化亞氮（N2O）的大量排放．接種具有N2O還原功能的植物根際促生菌（PGPR）不僅能夠減少溫室氣體排放，還能促進作物生長．本研究以一株具有N2O還原功能的PGPR反硝化無色桿菌（Achromobacterdenitrificans）YSQ030為供試菌株，明確接種YSQ030對施用有機肥的復墾土壤N2O排放和氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因的影響．通過設(shè)置施用有機無機復混肥和羊糞有機肥的土壤微宇宙試驗，利用氣相色譜儀分析接種YSQ030后土壤N2O排放通量，進一步計算累積排放量;在試驗結(jié)束后分析土壤pH、EC（電導率）、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量，并利用實時熒光定量PRC分析土壤硝化功能基因（AOAamoA和AOBamoA）和反硝化功能基因（nirS、nirK、nosZⅠ和nosZⅡ）的豐度．結(jié)果顯示，施用有機無機復混肥和羊糞有機肥的土壤中接種YSQ030明顯減少復墾土壤N2O排放，N2O排放量最大減少分別達90.4％和30.6％．施用有機無機復混肥處理的N2O排放量遠高于施用羊糞有機肥處理，這可能是由于施用有機無機復混肥的土壤與施用羊糞有機肥的土壤相比，土壤中編碼反硝化細菌N2O還原酶基因nosZⅠ和非典型反硝化細菌N2O還原酶基因nosZⅡ基因豐度較低．施用有機無機復混肥均顯著降低土壤硝化和反硝化功能基因豐度，而施用羊糞有機肥對土壤硝化和反硝化功能基因豐度大多沒有明顯影響．本研究表明，接種YSQ030能夠減少施用有機肥土壤的N2O排放，將為復墾土壤地力提升和N2O減排提供科學依據(jù)，也將為研發(fā)新型微生物肥料或生物有機肥提供核心菌種資源．

關(guān)鍵詞微生物肥料;有機肥;氧化亞氮（N2O）;植物根際促生菌;溫室氣體減排

中圖分類號S144

文獻標志碼A

0引言

為了切實保護我國耕地資源，合理利用與開發(fā)復墾土地十分重要．復墾土地作為我國重要后備土地資源，存在土壤結(jié)構(gòu)差、抗侵蝕能力弱、養(yǎng)分含量低等問題［1］，導致農(nóng)作物生長發(fā)育不良、產(chǎn)量低下．增施有機肥可改善復墾土壤結(jié)構(gòu)，快速提升地力［2］，例如施用牛糞有機肥可以增加復墾土壤有機質(zhì)含量、提高作物存活率［3］．此外，施用化學肥料也可提高復墾土壤養(yǎng)分含量、保證作物生長．有機肥無機肥配施可以提高土壤肥力，同時促進作物增產(chǎn)［4］．然而，增施有機肥和施用化學氮肥，在提升地力的同時，也造成了大量的溫室氣體N2O排放．N2O是一種會破壞臭氧層且在大氣存留時間長的溫室氣體［5］．百年尺度下N2O的增溫潛勢約為CO2的273倍［6-7］．截至2018年，全球大氣中N2O質(zhì)量分數(shù)以每年1.83×10-9的速度增長，目前大氣中N2O質(zhì)量分數(shù)約為330×10-9［8］．農(nóng)業(yè)排放的N2O約占全球人為排放的52％［9］，其中農(nóng)業(yè)土壤源N2O是重要來源，因此減少農(nóng)業(yè)土壤N2O排放十分重要．

農(nóng)田土壤N2O的產(chǎn)生包括很多復雜的微生物過程，其中硝化過程中氨氧化微生物（AOA和AOB）和反硝化過程中含有nirS／K基因的反硝化微生物是產(chǎn)生N2O的主要微生物類群．微生物硝化作用的過程主要是將NH3氧化為NO2-，最終生成NO3-［10-12］，該過程主要是由含有amoA基因的氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB）進行．含有編碼氨單加氧酶的反硝化作用過程主要是將NO3-還原為NO2-、NO、N2O，最后還原成N2的過程［13-15］．nirS／K基因編碼的亞硝酸還原酶（NIR）將NO2-還原為NO，是反硝化過程的關(guān)鍵酶和限速酶［14］．含有nosZ基因的反硝化微生物將N2O還原為氮氣（N2），這是目前已知的生物途徑中N2O唯一的匯［16-18］．N2O還原細菌有兩種不同的類群，分別為典型的反硝化細菌（CladeⅠ）和非典型的反硝化細菌（CladeⅡ）．因此研究硝化功能基因（AOAamoA和AOBamoA）和反硝化功能基因（nirS、nirK、nosZⅠ和nosZⅡ）在農(nóng)田土壤中的豐度對N2O產(chǎn)生和消耗過程至關(guān)重要．

植物根際促生菌（PGPR）指能夠穩(wěn)定存活在植物根際周圍或土壤中并產(chǎn)生和分泌各種抑菌物質(zhì)［19-20］，從而直接或間接促進植物生長或防治植物病害、有效降低病原物對植物危害的一類有益微生物的總稱．利用PGPR制作而成的微生物肥料不僅能夠提高作物的存活率、增大作物產(chǎn)量和修復環(huán)境污染［21-23］，還能降低溫室氣體N2O的排放［24-26］．最新研究表明直接應(yīng)用N2O還原微生物可減少農(nóng)業(yè)土壤N2O的排放［15，27］．Gao等［28］在溫室盆栽試驗條件下向種植紅花苜蓿和梯牧草的土壤接種具有植物促生效應(yīng)的N2O還原細菌，大部分菌株同時具有減排土壤N2O和促進植物生長的雙重效應(yīng)．申衛(wèi)收等［25］將四株根際促生菌接種到農(nóng)田土壤，發(fā)現(xiàn)部分菌株能有效減少農(nóng)田土壤N2O的排放．因此，研究具有N2O減排效應(yīng)的植物根際促生菌對N2O減排和土壤地力提升具有重要意義．

在土壤微宇宙條件下以一株具有N2O還原功能的植物根際促生菌YSQ030為供試菌株，研究接種YSQ030對施用不同用量有機無機復混肥和羊糞有機肥的復墾土壤N2O排放的影響，并采用實時熒光定量PCR分析土壤中硝化功能基因（AOAamoA和AOBamoA）和反硝化功能基因（nirS、nirK、nosZⅠ和nosZⅡ）的豐度變化，探究接種YSQ030減少土壤N2O排放的微生物生態(tài)機理，為復墾土壤地力提升和固碳減排提供科學依據(jù)．

1材料和方法

1.1供試菌株

供試用的N2O還原細菌YSQ030為反硝化無色桿菌（Achromobacterdenitrificans），前期研究表明其具有還原N2O的能力［29］，從江蘇省南京市江北新區(qū)某水塘蘆葦根際土中分離獲得．該菌株不僅對N2O具有減排功效，而且對農(nóng)作物具有促生效應(yīng)［25］．開展土壤微宇宙試驗時，將菌株接種到改良的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（牛肉浸膏30g·L-1、多聚蛋白胨5.0g·L-1、硝酸鈉0.3mmol·L-1和琥珀酸鈉4.4mmol·L-1，溶劑為蒸餾水，簡稱NBNS培養(yǎng)基）中，置于28℃搖床中在180r·min-1振蕩培養(yǎng)約24h，用無菌的NBNS液體培養(yǎng)基在600nm紫外可見分光光度計測定下調(diào)節(jié)菌液濃度至OD600nm約為1.0備用．

1.2供試土壤

土壤微宇宙試驗供試土壤取自江蘇省鎮(zhèn)江市句容市白兔鎮(zhèn)復墾土地，土地原用于磚瓦廠的廠房地基，于2018年變更為農(nóng)業(yè)試驗用地，土壤為黃棕壤，土體深厚，質(zhì)地黏重，核狀和柱狀結(jié)構(gòu)發(fā)育，土壤肥力水平較低，難以發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)．土壤采集后，在自然條件下風干，過2mm篩，室溫條件下保存．

1.3供試有機肥

土壤微宇宙試驗所用有機肥為鎮(zhèn)江貝思特有機活性肥料有限公司所提供的有機無機復混肥（氮、磷、鉀質(zhì)量分數(shù)分別為9％、5％、6％，有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)大于等于20％）和江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所提供的羊糞有機肥（氮質(zhì)量分數(shù)為2.7％）．

1.4土壤微宇宙試驗設(shè)計

土壤微宇宙試驗共13個處理，每個處理4個重復，具體處理設(shè)置如表1所示．C1.6、C3.9、C7.8分別表示施用1.6、3.9和7.8g有機無機復混肥，同時按照質(zhì)量體積比1∶1加入無菌的NBNS液體培養(yǎng)基;IC1.6、IC3.9、IC7.8分別表示施用1.6、3.9和7.8g有機無機復混肥，同時按照質(zhì)量體積比1∶1接種YSQ030菌液;S3.7、S13、S26分別表示施用3.7、13和26g羊糞有機肥，同時按照質(zhì)量體積比1∶1加入無菌的NBNS液體培養(yǎng)基;IS3.7、IS13、IS26分別表示施用3.7、13和26g羊糞有機肥，同時按照質(zhì)量體積比1∶1接種YSQ030菌液;CK表示不施肥、不接種的對照．建立土壤微宇宙試驗具體過程：先稱取100g供試土壤放入約500mL的培養(yǎng)瓶中，加入有機肥、混合攪拌均勻;接著加入100g供試土壤，將培養(yǎng)瓶中的土壤壓實后，倒入YSQ030菌液或無菌的NBNS液體培養(yǎng)基;最后加入蒸餾水使得培養(yǎng)瓶中的土壤含水量達到最大田間持水量的80％．將處理完的培養(yǎng)瓶放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)，置于26℃暗培養(yǎng)．

1.5氣體采集與測定

采集氣樣時，每個培養(yǎng)瓶蓋上密封蓋，保持1h后采集氣體．在接種YSQ030菌液后的第2天開始采氣，采樣頻率為2d一次，共15次．采集后的氣體采用氣相色譜儀（Agilent7890A，USA）測定N2O濃度．氣相色譜儀分析柱為PoropakQ填充柱，柱箱溫度為60℃，載氣為99.999％的高純氮氣;后檢測器為微池電子捕獲檢測器（ECD），用于測定氣體樣品中N2O的濃度，工作溫度為400℃，尾吹氣為5％氬甲烷標準氣（99.999％），流量為2mL·min-1，最低檢測下限為32μg·kg-1．

1.6土壤樣品采集與分析

采集培養(yǎng)試驗結(jié)束時的土壤，每個試驗樣品采集2份：一份過2mm篩并儲藏于4℃冰箱，用于分析pH、EC（電導率），以及銨態(tài)氮、硝態(tài)氮等土壤理化性質(zhì);另一份保存到-80℃超低溫冰箱用于提取DNA．采用玻璃電極法測定土壤樣品的pH，利用電導率儀測定土壤樣品的EC，紫外分光光度法測定樣品的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量．

1.7提取土壤DNA與實時熒光定量PCR分析

利用HiPureSoilDNAMiniKit試劑盒（Magen，China）提取土壤樣品中的DNA，并使用超微量紫外可見分光光度計（LifeReal，China）測定DNA濃度．提取的土壤DNA樣品在實時熒光定量PCR儀（bio-rad，CFX96，China）上完成反應(yīng)，每個樣品3個重復．反應(yīng)體系為25μL，包括12.5μL的TBGreenPremixExTaqⅡ、1μL的正反引物、5.5μL雙蒸水以及5μL的DNA模板．本試驗設(shè)計的氮循環(huán)功能基因種類、引物序列以及反應(yīng)程序如表2所示．所有試驗結(jié)果的擴增效率均處于90.5％～95.5％之間，溶解曲線呈單峰．

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)用Origin2022和Excel2010軟件進行處理和繪圖，采用IBMSPSSStatistics軟件對不同試驗處理進行方差分析、最小顯著性檢驗（LSD）和相關(guān)性分析;不同處理間統(tǒng)計差異顯著性（P<0.05）用不同的小寫字母表示，相關(guān)性分析中以P<0.01表示極顯著相關(guān)，P<0.05表示顯著相關(guān)．

2結(jié)果與分析

2.1接種YSQ030對施用兩種有機肥土壤N2O排放的影響

等氮量條件下施用有機無機復混肥后土壤N2O排放通量遠高于施用羊糞有機肥．N2O排放通量在第2天達到排放峰值，2周后出現(xiàn)第2個峰值，但相對于第1次峰值大幅降低（圖1）．除了IC1.6處理相對于C1.6處理N2O排放量略微上升外，其余處理在接種YSQ030后均能有效降低N2O排放量（單位時間單位質(zhì)量干土所排放的N2O態(tài)氮的質(zhì)量）．雙因素方差分析結(jié)果顯示，接種YSQ030效應(yīng)極顯著，但施用有機無機復混肥的效應(yīng)不顯著，兩者交互作用的效應(yīng)顯著．施用較大量有機無機復混肥配施YSQ030的效果更加明顯，IC3.9、IC7.8與對應(yīng)的未接種YSQ030菌液的處理相比N2O累積排放量分別減少了75.4％和91.5％（圖2）．接種YSQ030的效應(yīng)不顯著，但施用羊糞有機肥的效應(yīng)顯著，兩者交互作用的效應(yīng)不顯著．施用羊糞有機肥后接種YSQ030，減排效果從大到小依次為IS3.7>IS26>IS13．IS3.7處理與S3.7處理相比N2O排放量降低了近30.9％．

2.2接種YSQ030對施用兩種有機肥土壤理化性質(zhì)的影響

施用有機無機復混肥相對于不施肥對照均顯著降低土壤pH值，而施用有機無機復混肥后接種YSQ030能明顯提高土壤pH．施用羊糞有機肥相對于不施肥對照顯著降低土壤pH，但隨著施用量增加，土壤pH值也隨之上升．施用有機肥與未施肥的對照相比均能夠顯著提升土壤的電導率，且電導率的增加隨施用量的增加而呈現(xiàn)上升趨勢．在等氮量條件下施用有機無機復混肥相對于羊糞有機肥，土壤電導率增加更快．施用有機無機復混肥和羊糞有機肥對于土壤中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮提升顯著，尤其是施用有機無機復混肥后，土壤中的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量遠遠高過施羊糞有機肥．施用有機無機復混肥后接種YSQ030，除IC1.6處理外，其余處理土壤中的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量均有不同程度的降低，并隨著肥料用量的增加而下降．施用羊糞有機肥后接種YSQ030，土壤中的銨態(tài)氮含量則無明顯變化，但硝態(tài)氮含量有所提升，并隨著肥料用量的增加而增大（表3、表4）．在施用有機無機復混肥的基礎(chǔ)上接種YSQ030能夠調(diào)節(jié)土壤pH、電導率，降低土壤中的硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量;在施用羊糞有機肥的基礎(chǔ)上接種YSQ030也能調(diào)節(jié)土壤pH、電導率，而且還能提升土壤中的硝態(tài)氮含量，增強土壤養(yǎng)分含量．

2.3接種YSQ030對施用兩種有機肥土壤硝化和反硝化功能基因豐度的影響

2.3.1硝化功能基因豐度

施用有機無機復混肥后接種YSQ030相對于不接種對照能夠增加土壤中AOAamoA基因豐度（單位質(zhì)量干土中基因的拷貝數(shù)），IC1.6處理相對于C1.6處理土壤中的AOAamoA基因豐度增長幅度最大（圖3a）;IC1.6和IC3.9處理能提升土壤中AOBamoA基因豐度（圖3c）．除IS3.7處理外，其他施用羊糞有機肥接種YSQ030的處理與對應(yīng)未接種處理相比，土壤中的AOAamoA基因豐度無顯著變化（圖3b）;除IS26處理外，其他接種YSQ030的處理與對應(yīng)未接種處理相比，土壤中的AOBamoA基因豐度無顯著變化（圖3d）．施用有機無機復混肥和羊糞有機肥均降低了土壤中AOAamoA基因豐度．施用有機無機復混肥的處理土壤AOAamoA基因豐度降低幅度從大到小依次為C1.6、C7.8、C3.9．施用羊糞有機肥的處理土壤AOAamoA基因豐度降低幅度從大到小依次為S26、S13、S3.7．施用有機無機復混肥后土壤中的AOBamoA基因豐度均顯著降低，但隨著施肥量的增加其豐度也顯著增加．除S26處理外施用羊糞有機肥接種YSQ030能顯著增加土壤中AOBamoA基因豐度（圖3）．

2.3.2反硝化功能基因豐度

施用有機無機復混肥后接種YSQ030相對于不接種處理能增加土壤nirS基因豐度（圖4a）．除IC7.8處理外，施用有機無機復混肥后接種YSQ030的處理與對應(yīng)未接種處理相比，土壤中的nirK基因豐度均有增加趨勢（圖4c）．施用羊糞有機肥后接種YSQ030處理與對應(yīng)未接種菌株的處理相比，土壤中nirS和nirK基因豐度均無明顯變化（圖4b和4d）．施用有機無機復混肥和羊糞有機肥與未施肥對照相比，均顯著降低了土壤nirS基因豐度．除IC7.8和C7.8處理外，施用有機無機復混肥與未施肥對照相比，顯著降低了土壤中nirK的基因豐度，但隨著有機無機復混肥的施用量增加，土壤中nirK基因豐度有增加的趨勢．施用羊糞有機肥的所有處理與未施肥對照相比，土壤中nirK的基因豐度均無顯著變化（圖4）．

施用有機無機復混肥后接種YSQ030處理與對應(yīng)未接種處理相比，土壤nosZⅠ和nosZⅡ基因豐度均呈增加趨勢．其中：IC1.6和IC3.9處理均顯著提高土壤中nosZⅠ基因豐度，分別增加了99.7％和75.4％;IC7.8處理的nosZⅡ基因豐度顯著增加（圖5a和5c）．施用羊糞有機肥后接種YSQ030，土壤中nosZⅠ基因豐度均呈現(xiàn)減少趨勢（圖5b）．除IS13處理能增加土壤5基因豐度外，IS3.7和IS26處理降低了土壤nosZⅡ基因豐度（圖5d）．施用有機無機復混肥的所有處理與未施肥對照相比，土壤nosZⅠ和nosZⅡ基因豐度均顯著降低，而且nosZⅡ基因豐度降低程度更大．隨著有機無機復混肥的用量增加，土壤nosZⅠ基因豐度逐漸增大;相對于C1.6處理，C3.9和C7.8處理土壤nosZⅠ基因豐度增量均為1倍以上（圖5a和5c）．施用羊糞有機肥的多數(shù)處理土壤中nosZⅡ基因豐度與未施肥對照相比均有增加趨勢，其中S3.7和S26處理顯著增加了土壤中nosZⅡ基因豐度（圖5d）．

2.4氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因、土壤理化性質(zhì)與N2O排放量的相關(guān)性分析

土壤氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因、土壤理化性質(zhì)與N2O排放量的相關(guān)性如表5所示．土壤N2O排放量與pH和AOAamoA、nosZⅡ基因豐度呈負相關(guān)關(guān)系（P<0.01），與EC、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系（P<0.01）．土壤pH與土壤中EC、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮呈負相關(guān)關(guān)系（P<0.01），與AOAamoA、AOBamoA、nirS、nirK、nosZⅠ、nosZⅡ基因豐度呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.01）．EC與土壤中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.01），與AOBamoA、nosZⅡ基因豐度呈負相關(guān)關(guān)系（P<0.01），與AOAamoA、nirS、nosZⅠ基因豐度呈負相關(guān)關(guān)系（P<0.05）．硝態(tài)氮與銨態(tài)氮呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.01），與土壤中AOBamoA、nosZⅡ基因豐度呈負相關(guān)關(guān)系（P<0.01），與AOAamoA基因豐度呈負相關(guān)關(guān)系（P<0.05）．銨態(tài)氮與AOBamoA、nosZⅠ、nosZⅡ基因豐度呈負相關(guān)關(guān)系（P<0.01），與AOAamoA、nirS基因豐度呈負相關(guān)關(guān)系（P<0.05）．AOBamoA基因豐度與AOBamoA、nirS、nirK、nosZⅠ、nosZⅡ基因豐度呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.01）.其余反硝化功能基因豐度之間呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.01）．

3討論

復墾土壤因其地力水平低、養(yǎng)分含量少，往往需要施用有機肥來改善土壤結(jié)構(gòu)、提升肥力水平．有研究表明：將木本泥炭制作成的有機肥施到黃河三角洲地區(qū)復墾土壤，能夠增加土壤有機質(zhì)含量［30］;將腐殖酸施用到由黃綿土組成的復墾土壤中，使得土壤孔隙度提升，從而有利于地力快速提升和農(nóng)業(yè)發(fā)展［31］;將改良的有機肥施用到露天煤礦區(qū)復墾土壤中，能夠提升土壤肥力［32］．但是施用有機肥會增加土壤N2O的排放，而且施用有機肥對于土壤N2O的排放比施用化肥更多［33］，所以在土地復墾的過程中很難兼顧地力提升和固碳減排．

PGPR作為絕大多數(shù)微生物肥料的重要菌種來源，不僅能夠影響土壤中氮素養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和供應(yīng)，減少農(nóng)田土壤N2O的排放，而且還能夠調(diào)節(jié)土壤理化性質(zhì)，保持和提高土壤肥力．PGPR的減排能力也成為國內(nèi)外許多學者的研究熱點．Gao等［26］將N2O還原菌接種至添加畜禽糞便有機肥的土壤中，發(fā)現(xiàn)能夠減排N2O;Itakura等［27］在田間原位條件和蛭石盆栽試驗體系中將含nosZ基因的大豆根瘤菌接種至大豆根部能夠有效減少N2O的排放;接種具有N2O還原功能的PGPR到牧草地土壤，不僅可以減少土壤N2O的排放，而且能夠促進牧草生長［28］．反硝化無色桿菌YSQ030在純培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出非常強的N2O還原能力，減排效率達66.3％;在田間原位條件下將該菌劑接種到施用尿素的設(shè)施栽培蔬菜地，顯著減少了土壤N2O累積排放量，同時顯著增加了作物的干重、葉面積以及葉片葉綠素含量［25］．

本研究在土壤微宇宙條件下，通過接種含有nosZ基因的YSQ030到施用有機無機復混肥和羊糞有機肥的丘陵地區(qū)復墾土壤，發(fā)現(xiàn)在施用有機無機復混肥和羊糞有機肥的土壤中接種YSQ030具有減少N2O排放的能力，最大減排效率分別達91.5％和30.9％．本試驗中接種YSQ030后表現(xiàn)出很明顯的N2O減排效應(yīng)，可能是接種的微生物本身能合成有活性的氧化亞氮還原酶（N2OR）或通過改變土著N2O還原細菌群落的組成和豐度以及代謝活性，從而實現(xiàn)農(nóng)業(yè)土壤N2O的減排．但接種微生物在環(huán)境中存活和定殖等情況尚不明確，監(jiān)測其在土壤中的存活和定殖情況至關(guān)重要．Gao等［34］基于菌株的全基因組序列設(shè)計菌株特異性引物，定量分析菌株在培養(yǎng)過程中的動態(tài)變化．本試驗中接種YSQ030菌劑后菌株的存活和定殖情況以及其他土著微生物群落組成和豐度變化，對揭示減少N2O排放的微生物機理十分必要．后續(xù)將設(shè)計菌株特異性引物，并結(jié)合功能基因的高通量測序更加深入地探討相應(yīng)的土壤微生物機理．

土壤中N2O的排放主要是由微生物的硝化和反硝化作用主導的，N2O的減排則要通過產(chǎn)生N2OR的反硝化微生物將N2O還原為N2，微生物產(chǎn)生N2OR主要是由nosZ基因編碼，因此土壤微生物種群的N2O還原能力將土壤中nosZ基因豐度作為評價指標［35-37］．這與本研究得出的結(jié)果相似，施用有機無機復混肥后接種YSQ030的土壤中N2O排放量下降，這得益于土壤中nosZ基因豐度的增加．在減排效果較好的IC3.9、IC7.8處理的土壤中，功能基因nosZⅠ和nosZⅡ基因豐度都有不同程度的提升．施用有機無機復混肥后土壤中N2O排放量顯著增加，這可能是因為土壤中功能基因nosZⅠ和nosZⅡ基因豐度下降．在等氮量條件下施用有機無機復混肥處理的N2O排放量遠高于施用羊糞有機肥處理，這可能是由于施用有機無機復混肥的土壤中nosZⅠ和nosZⅡ基因豐度均低于施用羊糞有機肥的土壤，尤其是nosZⅡ基因豐度降低更加明顯．本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)N2O排放量與nosZⅠ和nosZⅡ基因豐度均呈負相關(guān)，尤其是與nosZⅡ基因豐度呈極顯著負相關(guān)（P<0.01），表明nosZⅡ基因在減排農(nóng)田土壤N2O排放中具有更加重要的作用．這也是因為非典型的反硝化細菌大多僅含有nosZ基因，不含其他反硝化基因［38-39］．

N2O還原為N2的生物過程受諸多環(huán)境因子的影響，其中pH是最為關(guān)鍵的影響因素［40］．本研究中pH與N2O排放量、其他環(huán)境因子以及硝化和反硝化功能基因均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)．施用有機無機復混肥對土壤硝化和反硝化功能基因豐度均有明顯影響，而施用羊糞有機肥對土壤硝化和反硝化功能基因大多沒有顯著影響，這也意味著不同類型有機肥對氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因豐度的影響各不相同．此外，施用不同類型有機肥后接種YSQ030，其減少土壤N2O排放的效應(yīng)也各不相同，相應(yīng)的土壤微生物機理值得進一步研究．

4結(jié)論

無論施用有機無機復混肥還是羊糞有機肥都能提高土壤礦物氮含量，但也增加了土壤N2O排放量．等氮量條件下，施用有機無機復混肥處理的N2O排放量遠高于施用羊糞有機肥，這可能是由于施用有機無機復混肥的土壤中nosZⅠ和nosZⅡ基因豐度均低于施用羊糞有機肥的土壤，尤其是nosZⅡ基因豐度降低更為明顯．施用含氮量較高的有機無機復混肥并接種YSQ030能夠顯著降低土壤N2O的排放量，最高減少91.5％，而且與未接種的對照相比土壤中nosZⅠ和nosZⅡ基因豐度均明顯增加．施用含氮量較低的羊糞有機肥并接種YSQ030能有效降低土壤N2O的排放量，最高減少30.9％．研究結(jié)果將為研發(fā)具有地力提升和固碳減排協(xié)同的新型微生物肥料、生物有機肥提供核心菌種，也將為減少復墾土壤N2O排放提供科學依據(jù)．

參考文獻

References

［1］

李然，徐明崗，鄔磊，等.煤礦區(qū)復墾土壤中秸稈和生物炭的分解特征［J］.植物營養(yǎng)與肥料學報，2021，27（7）：1129-1140

LIRan，XUMinggang，WULei，etal.Decompositioncharacteristicsofstrawandbiocharinareclaimedsoilfromcoalminingarea［J］.PlantNutritionandFertilizerScience，2021，27（7）：1129-1140

［2］ZhangX，DavidsonEA，MauzerallDL，etal.Managingnitrogenforsustainabledevelopment［J］.Nature，2015，528（7580）：51-59

［3］郭龍，李陳，劉佩詩，等.牛糞有機肥替代化肥對茶葉產(chǎn)量、品質(zhì)及茶園土壤肥力的影響［J］.水土保持學報，2021，35（6）：264-269

GUOLong，LIChen，LIUPeishi，etal.Effectofreplacingchemicalfertilizerwithcowmanureorganicfertilizeronteayield，quality，andsoilfertilityinteagarden［J］.JournalofSoilandWaterConservation，2021，35（6）：264-269

［4］喬莎莎，張永清，楊麗雯，等.有機肥對鉛脅迫下小麥生長的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學報，2011，22（4）：1094-1100

QIAOShasha，ZHANGYongqing，YANGLiwen，etal.Effectsoforganicmanureonwheatgrowthunderleadstress［J］.ChineseJournalofAppliedEcology，2011，22（4）：1094-1100

［5］LiuX，ChenCR，WangWJ，etal.SoilenvironmentalfactorsratherthandenitrificationgeneabundancecontrolN2Ofluxesinawetsclerophyllforestwithdifferentburningfrequency［J］.SoilBiologyandBiochemistry，2013，57：292-300

［6］JonesCM，SporA，BrennanFP，etal.RecentlyidentifiedmicrobialguildmediatessoilN2Osinkcapacity［J］.NatureClimateChange，2014，4（9）：801-805

［7］ChenZM，DingWX，XuYH，etal.IncreasedN2Oemissionsduringsoildryingafterwaterloggingandspringthawinarecordwetyear［J］.SoilBiologyandBiochemistry，2016，101：152-164

［8］LiuG，MaJ，YangYT，etal.Effectsofstrawincorporationmethodsonnitrousoxideandmethaneemissionsfromawheat-ricerotationsystem［J］.Pedosphere，2019，29（2）：204-215

［9］TianHQ，XuRT，CanadellJG，etal.Acomprehensivequantificationofglobalnitrousoxidesourcesandsinks［J］.Nature，2020，586（7828）：248-256

［10］聶江文，王幼娟，吳邦魁，等.紫云英還田對早稻直播稻田溫室氣體排放的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2018，37（10）：2334-2341

NIEJiangwen，WANGYoujuan，WUBangkui，etal.EffectofChinesemilkvetchincorporationongreenhousegasemissionsfromearly-ricedirect-seedingpaddyfields［J］.JournalofAgro-EnvironmentScience，2018，37（10）：2334-2341

［11］李虎，邱建軍，王立剛，等.中國農(nóng)田主要溫室氣體排放特征與控制技術(shù)［J］.生態(tài)環(huán)境學報，2012，21（1）：159-165

LIHu，QIUJianjun，WANGLigang，etal.ThecharacterizationofgreenhousegasesfluxesfromcroplandsofChinaandmitigationtechnologies［J］.EcologyandEnvironmentalSciences，2012，21（1）：159-165

［12］胡玉麟，湯水榮，陶凱，等.優(yōu)化施肥模式對我國熱帶地區(qū)水稻-豇豆輪作系統(tǒng)N2O和CH4排放的影響［J］.環(huán)境科學，2019，40（11）：5182-5190

HUYulin，TANGShuirong，TAOKai，etal.EffectsofoptimizingfertilizationonN2OandCH4emissionsinapaddy-cowpearotationsysteminthetropicalregionofChina［J］.EnvironmentalScience，2019，40（11）：5182-5190

［13］KuypersMMM，MarchantHK，KartalB.Themicrobialnitrogen-cyclingnetwork［J］.NatureReviewsMicrobiology，2018，16（5）：263-276

［14］ProsserJI，HinkL，Gubry-RanginC，etal.Nitrousoxideproductionbyammoniaoxidizers：physiologicaldiversity，nichedifferentiationandpotentialmitigationstrategies［J］.GlobalChangeBiology，2020，26（1）：103-118

［15］申衛(wèi)收，熊若男，張歡歡，等.微生物介導的農(nóng)業(yè)土壤氧化亞氮減排研究進展［J］.土壤學報，2023，60（2）：332-344

SHENWeishou，XIONGRuonan，ZHANGHuanhuan，etal.Researchprogressonmicrobial-mediatedmitigationofnitrousoxideemissionsfromagriculturalsoils［J］.JournalofSoilScience，2023，60（2）：332-344

［16］SteinLY.Thelong-termrelationshipbetweenmicrobialmetabolismandgreenhousegases［J］.TrendsinMicrobiology，2020，28（6）：500-511

［17］PhilippotL，AndertJ，JonesCM，etal.ImportanceofdenitrifierslackingthegenesencodingthenitrousoxidereductaseforN2Oemissionsfromsoil［J］.GlobalChangeBiology，2011，17（3）：1497-1504

［18］張玉銘，胡春勝，張佳寶，等.農(nóng)田土壤主要溫室氣體（CO2、CH4、N2O）的源／匯強度及其溫室效應(yīng)研究進展［J］.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2011，19（4）：966-975

ZHANGYuming，HUChunsheng，ZHANGJiabao，etal.Researchadvancesonsource／sinkintensitiesandgreenhouseeffectsofCO2，CH4andN2Oinagriculturalsoils［J］.ChineseJournalofEco-Agriculture，2011，19（4）：966-975

［19］ShaoJH，XuZH，ZhangN，etal.Contributionofindole-3-aceticacidintheplantgrowthpromotionbytherhizosphericstrainBacillusamyloliquefaciensSQR9［J］.BiologyandFertilityofSoils，2014，51：321-330

［20］霍佳慧，畢少杰，于欣卉，等.植物根際促生菌作用機制研究進展［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2022（9）：90-96

HUOJiahui，BIShaojie，YUXinhui，etal.Researchprogressonthemechanismofplantgrowthpromotingrhizobacteria［J］.XiandaiNongyeKeji，2022（9）：90-96

［21］張瑞福.根際微生物：農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展中大有作為的植物第二基因組［J］.生物技術(shù)通報，2020，36（9）：1-2

ZHANGRuifu.Rhizospheremicroorganism：thesecondgenomeofplantswithgreatpotentialinthegreendevelopmentofagriculture［J］.BiotechnologyBulletin，2020，36（9）：1-2

［22］張藝燦，劉鳳之，王海波.根際溶磷微生物促生機制研究進展［J］.中國土壤與肥料，2020（2）：1-9

ZHANGYican，LIUFengzhi，WANGHaibo.Researchprogressonplant-growth-promotingmechanismsofphosphate-solubilizingrhizospheremicrobes［J］.SoilsandFertilizersSciencesinChina，2020（2）：1-9

［23］付嚴松，李宇聰，徐志輝，等.根際促生菌調(diào)控植物根系發(fā)育的信號與分子機制研究進展［J］.生物技術(shù)通報，2020，36（9）：42-48

FUYansong，LIYucong，XUZhihui，etal.Researchprogressinginsignalsandmolecularmechanismsofplantgrowth-promotingrhizobacteriatoregulateplantrootdevelopment［J］.BiotechnologyBulletin，2020，36（9）：42-48

［24］孫玉，邢瑜琪，王紅，等.西藏黃花草木樨根際溶磷菌篩選及其促生特性研究［J］.高原農(nóng)業(yè)，2020（5）：510-516

SUNYu，XINGYuqi，WANGHong，etal.IsolationandcharacterizationofPGPRfromMelilotusofficinalisinRenbucountyofXizang［J］.JournalofPlateauAgriculture，2020（5）：510-516

［25］申衛(wèi)收，楊思琪，張歡歡，等.四株植物根際促生菌對農(nóng)田土壤N2O排放的影響［J］.南京信息工程大學學報（自然科學版），2022，14（1）：32-39

SHENWeishou，YANGSiqi，ZHANGHuanhuan，etal.Effectsoffourplantgrowth-promotingrhizobacteriaonN2Oemissionfromfarmlandsoil［J］.JournalofNanjingUniversityofInformationScience＆Technology（NaturalScienceEdition），2022，14（1）：32-39

［26］GaoN，ShenWS，CamargoE，etal.Nitrousoxide（N2O）-reducingdenitrifier-inoculatedorganicfertilizermitigatesN2Oemissionsfromagriculturalsoils［J］.BiologyandFertilityofSoils，2017，53（8）：885-898

［27］ItakuraM，UchidaY，AkiyamaH，etal.MitigationofnitrousoxideemissionsfromsoilsbyBradyrhizobiumjaponicuminoculation［J］.NatureClimateChange，2013，3（3）：208-212

［28］GaoN，ShenWS，KakutaH，etal.Inoculationwithnitrousoxide（N2O）-reducingdenitrifierstrainssimultaneouslymitigatesN2Oemissionfrompasturesoilandpromotesgrowthofpastureplants［J］.SoilBiologyandBiochemistry，2016，97：83-91

［29］楊思琪，張歡歡，申衛(wèi)收，等.氧化亞氮還原細菌YSQ030的篩選、鑒定及植物促生特性［J］.中國土壤與肥料，2024（1）：210-217

YANGSiqi，ZHANGHuanhuan，SHENWeishou，etal.Isolation，identificationandplantgrowth-promotingcharacteristicsofanitrousoxide-reducingbacterium［J］.SoilandFertilizerSciencesinChina，2024（1）：210-217

［30］于彩虹，杜閆彬，鞠正山，等.不同改良材料對黃河三角洲耕層土壤理化性質(zhì)及微生物多樣性的影響［J］.土壤通報，2019，50（6）：1335-1342

YUCaihong，DUYanbin，JUZhengshan，etal.EffectsofdifferentmodifiedmaterialsonphysicalandchemicalpropertiesandmicrobialdiversityofcoastalsalinesoilintheYellowRiverDelta［J］.ChineseJournalofSoilScience，2019，50（6）：1335-1342

［31］曹麗花，劉合滿，趙世偉.不同改良劑對黃綿土水穩(wěn)性團聚體的改良效果及其機制［J］.中國水土保持科學，2011，9（5）：37-41

CAOLihua，LIUHeman，ZHAOShiwei.Effectofsoilconditionersonwaterstabilityofsoilaggregatesanditsmechanismsinloessalsoil［J］.ScienceofSoilandWaterConservation，2011，9（5）：37-41

［32］李華，李永青，沈成斌，等.風化煤施用對黃土高原露天煤礦區(qū)復墾土壤理化性質(zhì)的影響研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2008，27（5）：1752-1756

LIHua，LIYongqing，SHENChengbin，etal.Effectofweatheredcoalapplicationonphysicalandchemicalpropertiesofreclaimedsoilinopen-pitcoalminingareaofLoessPlateau［J］.JournalofAgro-EnvironmentScience，2008，27（5）：1752-1756

［33］武星魁，姜振萃，陸志新，等.有機肥部分替代化肥氮對葉菜產(chǎn)量和環(huán)境效應(yīng)的影響［J］.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2020，28（3）：349-356

WUXingkui，JIANGZhencui，LUZhixin，etal.Effectsofthepartialreplacementofchemicalfertilizerwithmanureontheyieldandnitrogenemissionsinleafyvegetableproduction［J］.ChineseJournalofEco-Agriculture，2020，28（3）：349-356

［34］GaoN，ZhangHH，XiongRN，etal.Differentstrategiesforcolonizationandprevalenceafterinoculationwithplantgrowth-promotingrhizobacteriarevealedbyamonitoringmethod［J］.SoilScienceandPlantNutrition，2022，68（4）：442-453

［35］秦紅靈，陳安磊，盛榮，等.稻田生態(tài)系統(tǒng)氧化亞氮（N2O）排放微生物調(diào)控機制研究進展及展望［J］.農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究，2018，39（6）：922-929

QINHongling，CHENAnlei，SHENGRong，etal.AreviewonthemicrobialregulationmechanismofN2Oproductionandemissionofricepaddyecosystems［J］.ResearchofAgriculturalModernization，2018，39（6）：922-929

［36］PauletaSR，CarepoMSP，MouraI.Sourceandreductionofnitrousoxide［J］.CoordinationChemistryReviews，2019，387：436-449

［37］HenryS，BruD，StresB，etal.QuantitativedetectionofthenosZgene，encodingnitrousoxidereductase，andcomparisonoftheabundancesof16SrRNA，narG，nirK，andnosZgenesinsoils［J］.AppliedandEnvironmentalMicrobiology，2006，72（8）：5181-5189

［38］HallinS，PhilippotL，LfflerFE，etal.GenomicsandecologyofnovelN2O-reducingmicroorganisms［J］.TrendsinMicrobiology，2018，26（1）：43-55

［39］JonesCM，GrafDR，BruD，etal.Theunaccountedyetabundantnitrousoxide-reducingmicrobialcommunity：apotentialnitrousoxidesink［J］.TheISMEJournal，2013，7（2）：417-426

［40］HuHW，ChenDL，HeJZ.Microbialregulationofterrestrialnitrousoxideformation：understandingthebiologicalpathwaysforpredictionofemissionrates［J］.FEMSMicrobiologyReviews，2015，39（5）：729-749

EffectsofinoculationwithN2O-reducingbacteriaYSQ030onsoilN2O

emissionandkeyfunctionalgenesinvolvedinnitrogencyclinginreclaimedsoil

ZHUJinhong1XIONGRuonan1YANGSiqi1GAONan2WUYonghong3ZHANGZhenchao4WUGuoping4SHENWeishou1

1SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering／JiangsuKeyLaboratoryofAtmosphericEnvironment

Monitoring＆PollutionControl／CollaborativeInnovationCenterofAtmosphericEnvironmentandEquipment

Technology，NanjingUniversityofInformationScience＆Technology，Nanjing210044，China

2CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering／NationalEngineeringResearch

CenterforBiotechnology，NanjingTechUniversity，Nanjing211816，China

3StateKeyLaboratoryofSoil＆SustainableAgriculture，InstituteofSoilScience，

ChineseAcademyofSciences，Nanjing210008，China

4ZhenjiangInstituteofAgriculturalSciencesinHillyAreaofJiangsuProvince，Zhenjiang212400，China

AbstractThoughthereclaimedlandisanimportantreservelandresource，itusuallyispoorinsoilstructureandlowinorganicmatterandnutrientcontent.Organicfertilizercanquicklyimprovesoilproductivity，yetitwillcauselargeemissionsofgreenhousegasessuchasNitrousOxide（N2O）.IthasbeenprovedthattheinoculationofPlantGrowth-PromotingRhizobacteria（PGPR）withN2Oreductionfunctionnotonlyreducesgreenhousegasemissionsbutalsopromotescropgrowth.Inthisstudy，aPGPRdenitrificansYSQ030withN2OreductionfunctionwasusedastheteststraintoclarifytheeffectofYSQ030onN2Oemissionandnitrogencyclingkeyfunctionalgenesinreclaimedsoilwithorganicfertilizerapplication.Soilmicrocosmicexperimentsweresetupforapplicationoforganic-inorganiccompoundfertilizerandsheepmanure，thenthesoilN2OemissionfluxesafterinoculationofYSQ030wereanalyzedbygaschromatography.Meanwhile，soilchemicalpropertieswereanalyzedattheendoftheexperiment，andtheabundanceofsoilnitrificationanddenitrificationfunctionalgenes（AOAamoAandAOBamoA;nirS，nirK，nosZⅠandnosZⅡ）wereanalyzedbyreal-timequantitativePRC.TheresultsshowedthatYSQ030significantlyreducedtheN2Oemissionofreclaimedsoilwithorganic-inorganiccompoundfertilizerorsheepmanure，withthemaximumreductionofN2Oemissionreaching91.5％and30.9％，respectively.TheN2Oemissionsoforganic-inorganiccompoundfertilizertreatmentweremuchhigherthanthoseofsheepmanuretreatment，whichmaybeduetothelowabundanceofN2OreductasegenesofnosZⅠandnosZⅡintheformertreatment.Furthermore，significantreductionoftheabundanceofnitrificationanddenitrificationfunctionalgeneswereobservedonlyinorganic-inorganiccompoundfertilizertreatments.ThisstudyshowsthatYSQ030canreducetheN2Oemissioninsoilappliedwithorganicfertilizer，whichcanprovideascientificbasisforbothsoilfertilityimprovementandN2Oemissionreduction，andalsoprovidecorestrainresourcesfortheresearchanddevelopmentofnewmicrobialfertilizersorbio-organicfertilizers.

Keywordsmicrobialfertilizer;organicfertilizer;nitrousoxide（N2O）;plantgrowth-promotingrhizobacteria（PGPR）;greenhousegasmitigation