李佳蔚 曾珊 楊君揚 陳忠琴 譚明堂 高加龍 鄭惠娜 蘇偉藝 曹文紅

摘要：以香港牡蠣為原料，通過酶解法制備富鋅牡蠣酶解產(chǎn)物并對其相對分子量圖譜和氨基酸組成進行分析。經(jīng)過蛋白酶篩選、超聲預處理后應用單因素試驗、正交試驗以及時間曲線優(yōu)化酶解工藝，提高酶解產(chǎn)物的水解度和生物鋅釋放量。采用超聲功率500 W、超聲時間10 min進行預處理，選擇動物蛋白酶進行酶解。最佳酶解工藝為加酶量1.6%、酶解時間4 h、酶解溫度50 ℃、料液比1∶4、pH 6.5，得到牡蠣酶解產(chǎn)物水解度為49.581%。酶解產(chǎn)物的鋅含量（以干基計）為680.831 mg/kg。牡蠣肽相對分子量小于1 000 Da的組分達到81.87%，富含酸性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸。香港牡蠣酶解產(chǎn)物中含有豐富的小分子肽，氨基酸組成較完善，鋅含量較高，可為后續(xù)富鋅產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎。

關鍵詞：香港牡蠣；富鋅；牡蠣肽；超聲輔助酶解；低分子量

中圖分類號：TS254.1

文獻標志碼：A

文章編號：1000-9973（2024）06-0108-07

Study on Preparation Process of Zinc-Rich Oyster Peptides with Low Molecular

Weight by Ultrasound-Assisted Enzymatic Hydrolysis Method

LI Jia-wei¹， ZENG Shan¹， YANG Jun-yang¹， CHEN Zhong-qin^1，2， TAN Ming-tang^1，2， GAO Jia-long^1，2，

ZHENG Hui-na^1，2， SU Wei-yi³， CAO Wen-hong^1，2*

（1.College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， China; 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety， National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing Technology， Zhanjiang 524088， China; 3.Market Supervision Licensing Technology Review Center in Shunde District， Foshan City， Guangdong Province， Foshan 528399， China）

Abstract： With Crassostrea hongkongensis as the raw material， the zinc-rich oyster enzymatic hydrolysate is prepared by enzymatic hydrolysis method， and its relative molecular weight chromatogram and amino acid composition are analyzed. Through protease screening and ultrasound pretreatment， single factor test， orthogonal test and time curves are used to optimize the enzymatic hydrolysis process， so as to improve the hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate and the release amount of biological zinc. Using ultrasonic power of 500 W and ultrasonic time of 10 min for pretreatment， animal protease is selected for enzymatic hydrolysis. The optimal enzymatic hydrolysis process is as follows： the enzyme addition amount is 1.6%， enzymatic hydrolysis time is 4 h， enzymatic hydrolysis temperature is 50 ℃， solid-liquid ratio is 1∶4 and pH is 6.5. The hydrolysis degree of the obtained oyster enzymatic hydrolysate is 49.581%. The zinc content of the enzymatic hydrolysate （on dry basis） is 680.831 mg/kg. The components of oyster peptides with relative molecular weight less than 1 000 Da reach 81.87%， which are rich in acid amino acids， namely glutamic acid and aspartic acid. The enzymatic hydrolysate of Crassostrea hongkongensis contains abundant small-molecular peptides， with a relatively complete amino acid composition and high zinc content， which can lay a foundation for the development of zinc-rich products in the future.

Key words： Crassostrea hongkongensis; zinc-rich; oyster peptide; ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis; low molecular weight

收稿日期：2023-12-07

基金項目：湛江市科技計劃項目（2022A05038）；國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0901105）；貝類產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-49）

作者簡介：李佳蔚（1995—），女，碩士，研究方向：食品加工與安全。

*通信作者：曹文紅（1977—），男，教授，博士，研究方向：海洋食品營養(yǎng)與功能。

鋅是人體必需的一種微量元素，對維持機體生理功能和正常代謝起著重要作用^[1-2]。由于人體內(nèi)不能儲存鋅元素，所以需要通過食物進行補充來維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定^[3]。近年來調查發(fā)現(xiàn)，我國膳食結構中鋅補充嚴重不足，特別是兒童和老人^[4]。缺鋅會引發(fā)健康問題，比如影響生長發(fā)育、味覺和嗅覺障礙以及免疫缺陷等^[5-6]。如何高效、安全且方便地為人體補充鋅是如今食品領域的研究重點。傳統(tǒng)的補鋅劑與人體發(fā)生不利反應，會使生物利用率下降，導致吸收效率低^[7]，因此將具有溶解性強、生物利用率高、毒副作用小等優(yōu)點的生物鋅作為鋅元素的補充，更有利于鋅元素的消化吸收。

超聲波是一種新興的綠色加工技術，應用于各種食品加工過程中^[8]。諸多研究表明超聲波可以增強分子運動速度和頻率，破壞組織細胞壁，釋放細胞中物質^[9]，同時可以軟化蛋白質的結構，從而達到提高酶解效率的目的^[10]。研究表明酶解得到的低分子肽吸收速度快，需要能量低，因此更容易被機體吸收利用^[11]。

香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）主要分布在廣東、廣西等地區(qū)，而湛江香港牡蠣年產(chǎn)量約40萬噸，占全國的10%。牡蠣中的鋅含量較高，課題組前期研究表明，香港牡蠣的鋅濃度為126.751 mg/kg，是補鋅的良好來源^[12]。根據(jù)食品安全國家標準GB 28050—2011的要求，富鋅食品的標準為≥45 mg/kg。目前市面上富鋅產(chǎn)品大多為螯合金屬產(chǎn)物，通過對原料進行富集處理以達到安全性更高的補鋅產(chǎn)品很少，因此本研究通過超聲預處理和酶解明確富集制備富鋅低分子牡蠣肽的最佳工藝，為之后富鋅產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎，對牡蠣精深加工的多樣性具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香港牡蠣：2022年9月購于霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場，洗凈瀝干，分裝，于－20 ℃冷凍貯藏；動物蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、Protamex 1.6：南寧龐博生物工程有限公司；濃硝酸（分析純）、濃硝酸（優(yōu)級純）：廣州化學試劑廠；氫氧化鈉標準溶液（分析純）：羅恩試劑；甲醛（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；鄰苯二甲醛（分析純）、17種氨基酸混合標準品：美國Sigma公司；PEG：Polymer Standards Service GmbH（PSS）公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：CNW Technologies GmbH公司。

1.2 主要儀器與設備

Thermo LYNX6000高速落地離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；2-16KL臺式高速冷凍離心機 美國Sigma公司；SHJ-AB磁力攪拌水浴鍋 常州金壇良友儀器有限公司；Anton Paar Multiwave Pro41微波消解儀 奧地利安東帕公司；FB224電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；LGJ-18冷凍干燥機 河南兄弟儀器設備有限公司；Eyela旋轉蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會社；Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 1100液相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；KQ-500DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TAS-990AFG原子吸收分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 香港牡蠣酶解產(chǎn)物的制備

將香港牡蠣肉置于4 ℃冰箱中冷藏解凍后用料理機打成肉糜狀，稱取15.00 g牡蠣肉糜置于燒杯中，再加入一定比例的超純水，使用均質機均質（10 000 r/min，60 s），超聲處理10 min后用1 mol/L NaOH調節(jié)蛋白酶解所需pH，加入適量的蛋白酶混勻后在磁力攪拌水浴鍋中設置溫度酶解一定時間，酶解過程中維持pH穩(wěn)定；酶解結束后，在100 ℃下滅酶20 min，混合液于4 ℃離心（9 000 r/min，15 min），取上清液備用。

1.3.2 蛋白酶的篩選

結合課題組前期研究^[13]，選擇動物蛋白酶（最適pH 6.5）、中性蛋白酶（最適pH 7.0）、菠蘿蛋白酶（最適pH 7.0）、木瓜蛋白酶（最適pH 6.5）和Protamex 1.6（最適pH 7.0）5種蛋白酶分別按照1.3.1的步驟對牡蠣肉進行酶解處理，選擇料液比1∶3、加酶量1.6%、時間3 h、溫度50 ℃，同時調節(jié)pH為各蛋白酶的最適pH，以水解度（degree of hydrolysis，DH）為指標，選出最優(yōu)蛋白酶。

1.3.3 水解度的計算

參考王仁佳等^[14]的方法，采用甲醛滴定法測定水解度。水解度（DH）計算公式見公式（1）：

DH=A－BC－D×100%。（1）

式中：DH為水解度，%；A為酶解液中氨基氮含量，g/100 g；B為原料中游離氨基氮含量，g/100 g；C為原料中總氮含量，g/100 g；D為原料中非蛋白氮含量，g/100 g。

1.3.4 超聲預處理

分別采用150，300，400，500，600 W 5種不同功率對均質后的牡蠣漿液超聲10 min，以蛋白水解度為指標，選擇最優(yōu)的超聲功率。

1.3.5 單因素試驗

選擇不同的酶解溫度、pH、料液比、加酶量4個因素進行單因素試驗，以水解度為指標，探究各個單因素對香港牡蠣肉水解度的影響。設置酶解溫度分別為45，50，55，60，65 ℃，pH分別為6，6.5，7，7.5，8，料液比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，加酶量分別為0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%，控制酶解時間為3 h，進行初步優(yōu)化。

1.3.6 正交試驗優(yōu)化香港牡蠣酶解工藝

在單因素試驗的基礎上，確定酶解溫度、pH、料液比、加酶量4個因素進行L₉（3⁴）正交試驗設計，見表1。以香港牡蠣蛋白水解度為指標，確定最優(yōu)工藝條件。

1.3.7 酶解時間對香港牡蠣水解度和鋅釋放量的影響

在工藝優(yōu)化基礎上得到的最優(yōu)條件下，對比不同酶解時間對鋅釋放量和蛋白水解度的影響，酶解時間設置為0.5，1，1.5，2，3，4，5 h。

1.3.8 鋅釋放量的計算

鋅釋放量計算公式見公式（2）：

X=A×VM×m×100%。（2）

式中：X為鋅釋放量，%；A為酶解液中鋅含量，mg/L；V為酶解液總體積，L；M為香港牡蠣肉中總鋅含量，mg/kg；m為樣品質量，g。

酶解液中鋅含量的測定參考GB 5009.14—2017中的方法。

1.3.9 超濾分離

利用0.45μm水相濾膜抽濾除去大分子物質、雜質等，選擇3，5，8，10 kDa 4個超濾膜板對抽濾后的濾液進行超濾分級，得到＞10 kDa、8～10 kDa、5～8 kDa、3～5 kDa、＜3 kDa 5種超濾組分。

1.3.10 分子量分布測定

采用凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）測定香港牡蠣酶解產(chǎn)物的分子量分布。色譜條件：色譜柱：Waters Ultrahydrogel 500-250-120A（300 mm×7.8 mm）；流動相：0.1 mol/L NaNO₃水溶液；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：40μL。標準品為聚乙二醇（PEG）。以保留時間（t）和分子量的對數(shù)lgM回歸，得到分子量回歸方程：lgM=16.91－0.941 2t+0.016 7t²－0.000 113 6t³（R²=0.999 7）。

1.3.11 氨基酸組成分析

根據(jù)GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》測定氨基酸含量，采用全自動氨基酸分析儀對牡蠣酶解產(chǎn)物及超濾組分的氨基酸組成進行分析。

1.3.12 鋅含量的測定

根據(jù)GB 5009.14—2017，采用微波消解和火焰原子吸收光譜法測定樣品中的鋅含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上試驗均重復3次，采用Excel 2021、IBM SPSS Statistics 27.0.1進行數(shù)據(jù)處理和方差分析，P＜0.05表示差異顯著且具有統(tǒng)計學意義，采用Origin 2021作圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

在水產(chǎn)品酶解過程中，蛋白酶的選擇尤為重要，中性蛋白酶應用于魷魚皮膠原蛋白肽的制備^[15]，動物蛋白酶在魷魚內(nèi)臟中酶解制備水產(chǎn)品調味基料中的應用研究^[16]，菠蘿蛋白酶應用于ACE抑制肽活性作用機制的研究^[17]，木瓜蛋白酶在制備抗氧化活性殼寡糖中的應用研究^[18]，Protamex 1.6復合蛋白酶在牡蠣風味物質^[19]以及水解蛋白中有較多的研究。諸多的研究結果表明，蛋白酶在水產(chǎn)品水解中起到重要的作用，并且能力顯著，因此選擇以上5種蛋白酶對牡蠣進行酶解。蛋白酶對香港牡蠣蛋白水解度的影響見圖1。

由圖1可知，在香港牡蠣蛋白酶解中，木瓜蛋白酶等4種蛋白酶的水解度均低于35%，動物蛋白酶的水解度達到42.69%，顯著高于其他蛋白酶（P＜0.05）。因此，在后續(xù)試驗中選擇動物蛋白酶。

2.2 超聲預處理功率的選擇

趙鈺等^[20]利用超聲輔助酶解草魚鱗，制備的膠原蛋白肽得率顯著提高。較多研究表明超聲可提高蛋白水解度，如Lan等^[21]利用超聲輔助酶解豬皮蛋白，其水解度提高了50%。超聲功率對水解度的影響見圖2。

由圖2可知，隨著超聲功率的增大，水解度逐漸上升，在超聲功率為500 W時達到最高，為47.63%，顯著高于其余超聲功率處理的組別（P＜0.05），與超聲處理前相比水解度提高了4.94%，可能是因為超聲處理的過程中會使得親水性基團暴露，有利于底物和酶進行結合，提高酶解效率；超聲功率繼續(xù)上升，水解度反而下降，可能是因為蛋白質分子構象被破壞，使得酶活力下降，從而導致水解度下降，與藍尉冰等^[22]的研究結果一致。

2.3 動物蛋白酶酶解單因素試驗結果

2.3.1 溫度對香港牡蠣肉水解度的影響

由圖3可知，隨著溫度的上升，水解度整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在50 ℃時水解度達到最大值，為 47.63%，55～65 ℃之間水解度大幅度降低，不同溫度之間差異均顯著（P＜0.05）。動物蛋白酶最適的反應溫度在50 ℃左右，溫度過高或者過低都會對水解能力產(chǎn)生影響。在最適溫度下，隨著溫度不斷上升，酶活性也不斷上升，因此水解度逐漸上升；當超過動物蛋白酶最適溫度時，酶解效率出現(xiàn)下降趨勢，這是因為在此過程中有部分酶失活，導致水解度逐漸下降^[23]。因此，選擇45，50，55 ℃進行后續(xù)正交試驗。

2.3.2 pH對香港牡蠣肉水解度的影響

由圖4可知，隨著pH的增加，水解度整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在pH為6.5時水解度最大，為47.63%，顯著高于其他組別（P＜0.05），這可能是因為pH會影響底物中的羧基、氨基等基團的狀態(tài)，進而影響蛋白酶與底物的催化，使得其結合減少，水解度下降^[24]。因此，選擇pH 6.0，6.5，7.0進行后續(xù)正交試驗。

2.3.3 加酶量對香港牡蠣肉水解度的影響

由圖5可知，當加酶量在0.8%～1.6%之間時，水解度呈上升趨勢，在1.6%時達到最大，為47.63%。加酶量超過1.6%后，水解度下降。隨著酶添加量的繼續(xù)增加，水解度的變化不顯著（P>0.05）。隨著蛋白酶添加量的增加，底物與酶的接觸增大，因此水解度上升較快；但酶的添加量達到一定量時，隨著底物逐漸減少，酶解產(chǎn)物增多，可能達到飽和的狀態(tài)，因此水解度在后期波動不大，這與黃艷燕等^[25]和肖雪等^[26]的研究結果一致。因此，選擇加酶量1.4%、1.6%、1.8%進行后續(xù)正交試驗。

2.3.4 料液比對香港牡蠣肉水解度的影響

由圖6可知，料液比為1∶1時水解度最低，僅為35.86%，此時酶解樣品較濃稠，牡蠣肉糜分散能力弱，與酶的接觸受此影響從而使得水解度較低；料液比為1∶3時水解度最高，為47.63%，顯著高于1∶2時的水解度（P＜0.05），可能是因為體系內(nèi)流動性合適，有利于反應的進行^[27]；之后隨著料液比的增大，溶劑體積增大，導致酶與底物的接觸點減少，因此水解度呈現(xiàn)下降趨勢^[28]。因此，選擇料液比1∶2、1∶3、1∶4進行后續(xù)正交試驗。

2.4 香港牡蠣超聲輔助酶解工藝正交優(yōu)化

由表2可知，各因素對香港牡蠣水解能力影響的主次順序為C＞A＞D＞B，即料液比＞酶解溫度＞加酶量＞pH，得到的最優(yōu)試驗方案為A₂B₂C₃D₂，即料液比1∶4、酶解溫度50 ℃、加酶量1.6%、pH 6.5，此條件下水解度為49.581%。

2.5 酶解時間對水解度和鋅釋放量的影響

采用正交試驗的優(yōu)化結果為條件，探究不同酶解時間對水解度和鋅釋放量的影響，結果見圖7。

由圖7可知，鋅釋放量與水解度呈現(xiàn)一定的相關性，在一定酶解時間內(nèi)，鋅釋放量隨著水解度的增大而增加。當酶解時間為0.5～3 h時，水解度增長迅速，3 h時達到最高，此時水解度為49.581%，3 h后水解度基本趨于穩(wěn)定；鋅釋放量在4 h時迅速達到最高，為77.90%，高于其他時間的鋅釋放量，可能是因為在此過程中底物逐漸被酶解，各類蛋白在不同時間段被分解，釋放出含鋅的肽，因此使得鋅釋放量增大。繼續(xù)酶解，水解度無變化，鋅釋放量有所降低。

2.6 香港牡蠣酶解產(chǎn)物相對分子量分布分析

采用水相GPC測定香港牡蠣酶解產(chǎn)物相對分子量分布，分子量分布圖譜見圖8。

由表3和圖8可知，牡蠣酶解產(chǎn)物主要由小分子肽段構成。相對分子量小于1 000 Da的組分占81.87%，其中500～1 000 Da的組分占13.67%，200～500 Da的組分占68.20%。有研究表明，小肽的吸收效率高，更容易被吸收利用，從而能更好地發(fā)揮多種功能活性^[29]。

2.7 香港牡蠣酶解產(chǎn)物及不同超濾組分中氨基酸組成分析

由表4可知，香港牡蠣酶解產(chǎn)物總氨基酸含量達499.033 mg/g，參與金屬離子配位較高的是Glu、Asp、His等^[30]，酸性和堿性氨基酸殘基與鋅的螯合也有較重要的作用，酶解產(chǎn)物中Glu和Asp的含量較高^[31]，Glu含量達到65.891 mg/g，Asp含量達到48.512 mg/g。同時堿性氨基酸Lys和Arg等含量都較高，Lys含量達到 40.444 mg/g，Arg含量達到44.674 mg/g，牡蠣酶解產(chǎn)物中鋅含量較高可能與其有關^[32]。酶解產(chǎn)物中含有18種氨基酸，包含8種必需氨基酸，氨基酸組成比較全面，同時不同超濾組分的氨基酸組成也較平均，因此可以為部分有鋅需求的食品進行添加，不但可以達到補鋅的目的，而且能增加其營養(yǎng)成分。

2.8 酶解產(chǎn)物不同超濾組分中總鋅含量分析

酶解產(chǎn)物不同超濾組分的鋅含量見圖9。

由圖9可知，鋅含量由高到低為＞10 kDa，8～10 kDa，5～8 kDa，3～5 kDa，＜3 kDa，其中＞10 kDa的超濾組分中鋅含量最高，達到673.819 mg/kg。根據(jù)食品安全國家標準GB 28050—2011中的要求，富鋅食品的標準為≥45 mg/kg。因此，從總鋅含量來看，酶解產(chǎn)物中各超濾組分均達到了富鋅的標準。

3 結論

牡蠣是一種營養(yǎng)豐富、蛋白質含量高的水產(chǎn)品，其鋅含量是自然界中最高的。本研究通過酶解法制備富鋅低分子牡蠣肽，確定酶解工藝的最佳條件為加酶量1.6%、料液比1∶4、酶解溫度50 ℃、pH 6.5、酶解時間4 h，在此方案下得到的水解度為49.581%，酶解產(chǎn)物的鋅含量（以干基計）為680.831 mg/kg。結果表明，超聲輔助酶法可以提高牡蠣的水解度，同時酶解產(chǎn)物和超濾組分的氨基酸組成較完善，均含有18種氨基酸且與鋅含量相關的氨基酸含量較高；相對分子量分布圖表明酶解產(chǎn)物中小分子肽含量較多，小于1 000 Da的組分占比81.87%；各超濾組分鋅含量都達到富鋅的標準。

在酶解過程中釋放的鋅相對其余鋅補充劑而言能在人體內(nèi)被更好地吸收利用，并且由于酶解產(chǎn)物中的鋅含量較高，因此可少量添加在食品中，達到富鋅的目的。同時由于牡蠣酶解產(chǎn)物中含有的小分子肽多，在補充鋅元素的過程中也會有更多有益身體的活性肽發(fā)生作用，具有良好的應用前景，為下一步產(chǎn)品的開發(fā)研究奠定基礎。

參考文獻：

[1]PAOLA B， GIULIA B， FRANCIS A， et al. Zinc and its role in immunity and inflammation[J].Autoimmunity Reviews，2015，14（4）：277-285.

[2]鄭英敏，袁楊，蘇東曉，等.大豆多肽-鋅螯合物的制備工藝優(yōu)化及其結構表征[J].食品工業(yè)科技，2020，41（14）：160-165.

[3]柯梟，胡曉，楊賢慶，等.羅非魚皮膠原蛋白肽-鋅螯合物的制備及結構表征與體外消化分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2021，47（14）：38-44.

[4]ANANDA S P. Discovery of human zinc deficiency： 50 years later[J].Journal of Trace Elements in Medicine and Biology，2012，26（2-3）：66-69.

[5]KOGAN S， SOOD A， GARNICK M S.Zinc and wound healing： a review of zinc physiology and clinical applications[J].Wounds： a Compendium of Clinical Research and Practice，2017，29（4）：102-106.

[6]ROSALIND S G. Zinc deficiency and human health： etiology， health consequences， and future solutions[J].Plant and Soil，2012，361（1-2）：291-299.

[7]SWARNA L P， AISHWARYA J， JYOTHI L A. Compositional and processing effects in promoting the bioaccessibility of iron and zinc of ready to cook high protein kheer mix[J].LWT-Food Science and Technology，2019，109：186-193.

[8]穆紅，羅瑞明，李亞蕾.響應面法優(yōu)化超聲輔助雙酶酶解牛骨蛋白工藝[J].食品研究與開發(fā)，2023，44（7）：135-142.

[9]馬麗媛，黃雪瑩，尚爾坤，等.超聲輔助酶法提取玉米皮中多糖及其抗氧化性測定[J].食品與機械，2023，39（5）：186-192.

[10]DONG Z Y， LI M Y， TIAN G， et al. Effects of ultrasonic pretreatment on the structure and functionality of chicken bone protein prepared by enzymatic method[J].Food Chemistry，2019，299：125103.

[11]YANG L， GUO Z， WEI J， et al. Extraction of low molecular weight peptides from bovine bone using ultrasound-assisted double enzyme hydrolysis： impact on the antioxidant activities of the extracted peptides[J].LWT-Food Science and Technology，2021，146：111470.

[12]韓蓉，曹文紅，章超樺，等.香港牡蠣中鋅元素的分布及存在形態(tài)[J].廣東海洋大學學報，2021，41（4）：120-127.

[13]李婉，曹文紅，章超樺，等.牡蠣酶解產(chǎn)物的組成特點及其體外免疫活性[J].食品工業(yè)科技，2017，38（16）：35-42.

[14]王仁佳，曹文紅，章超樺，等.華貴櫛孔扇貝富硒蛋白粉的酶法制備工藝優(yōu)化及其營養(yǎng)評價[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2022，48（10）：84-92.

[15]張國玉，俞存兵，余奕珂，等.酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽工藝[J].食品工業(yè)，2022，43（11）：12-14.

[16]黃敬哲，張修正，裴繼偉，等.動物蛋白酶酶解魷魚內(nèi)臟工藝研究[J].魯東大學學報（自然科學版），2022，38（1）：83-88.

[17]CHEN J， SUN S， LI Y， et al. Proteolysis of tilapia skin collagen： identification and release behavior of ACE-inhibitory peptides[J].Food Science and Technology，2020，139：110502.

[18]黃曉月，畢思遠，區(qū)家豪，等.木瓜蛋白酶法制備抗氧化活性殼寡糖的工藝優(yōu)化[J].生物學雜志，2022，39（1）：104-109.

[19]RYU T， KIM J， SHIN J， et al.Optimization of hydrolysis using oyster and oyster cooking drip[J].Journal of Life Science，2015，25（7）：795-800.

[20]趙鈺，余小月，熊喆，等.超聲輔助酶解制備草魚鱗膠原肽及其理化特性評價[J].現(xiàn)代食品科技，2022，38（9）：159-170.

[21]LAN M M， LI W F， CHANG C， et al. Enhancement on enzymolysis of pigskin with ultrasonic assistance[J].Bioengineered，2020，11（1）：397-407.

[22]藍尉冰，韓鑫，陳冠余，等.超聲波預處理協(xié)同酶提取近江牡蠣活性肽研究[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（8）：48-52.

[23]梁瑞萍，謝超，梁佳，等.響應面法優(yōu)化牡蠣蛋白酶解工藝的研究[J].浙江海洋大學學報（自然科學版），2019，38（5）：407-414.

[24]張一帆，張?zhí)苽?，央?響應面法優(yōu)化西藏核桃蛋白酶解工藝[J].食品安全質量檢測學報，2017，8（12）：4747-4754.

[25]黃艷燕，王升，馮濤，等.大米蛋白水解條件的響應面法優(yōu)化[J].廣西科學，2020，27（2）：175-181.

[26]肖雪，王金浩，邵俊花，等.超聲輔助酶法優(yōu)化雞肉蛋白水解工藝[J].食品研究與開發(fā)，2023，44（2）：124-131.

[27]蘇來金，葉劍，劉煥興，等.響應面法優(yōu)化蝦殼促鈣吸收肽的酶解工藝[J].食品工業(yè)科技，2019，40（22）：201-206.

[28]陳靜，陳志宏，張汆，等.響應面法優(yōu)化玉米蛋白粉酶解工藝及其動力學研究[J].武漢輕工大學學報，2020，39（5）：9-16.

[29]蔡木易.食源性肽研究進展[J].北京工商大學學報（自然科學版），2012，30（5）：1-10.

[30]IRELAND S M， MARTIN A C R. ZincBind—the database of zinc binding sites[J].Database（Oxford），2019，2019：1-8.

[31]JIANG L P， WANG B， LI B， et al. Preparation and identification of peptides and their zinc complexes with antimicrobial activities from silver carp （Hypophthalmichthys molitrix） protein hydrolysates[J].Food Research International，2014，64：91-98.

[32]CRISTINA T， MANUEL A， JAVIER V. Iron-chelating activity of chickpea protein hydrolysate peptides[J].Food Chemistry，2012，134（3）：1585-1588.