［摘 要］ 目的：調(diào)查某三甲醫(yī)院耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 （MRSA） 的基因型分布，探討菌株各分子分型間的相關(guān)性，并構(gòu)建不同遺傳背景下的耐藥譜模型。方法：選取來源于醫(yī)院25個(gè)科室的金黃色葡萄球菌（S. aureus） 共計(jì)204 株，采用全自動(dòng)VITEK 2 Compact 細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀及E-test條檢測菌株的抗菌藥物敏感性，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 法檢測mecA 基因作為確證實(shí)驗(yàn)，比較頭孢西丁（FOX） 和（或） 苯唑西林（OXA） 作為表型檢測方法篩選MRSA 的能力。采用PCR 法檢測MRSA 菌株的分子分型，包括S. aureus A 蛋白分型（spa）、附屬基因調(diào)節(jié)器分組（agr）、多位點(diǎn)序列分型（MLST） 和S. aureus 染色體盒mec 分型（SCCmec）。結(jié)合藥物敏感實(shí)驗(yàn)和分子分型結(jié)果，構(gòu)建不同遺傳背景下的耐藥譜。結(jié)果：通過檢測mecA基因共獲得39株MRSA。通過檢測FOX和OXA共獲得51 株表型MRSA。spa 分型中， 共鑒定出包括5 種新型（t20226、t20227、 t20228、 t20229 和t20230） 在內(nèi)的57 種不同型別，主要為t309 （30. 9%）、t078 （11. 8%） 和t437 （11. 8%）。agr 分型，94. 9% 的MRSA 屬于agrⅠ。MLST 分析MRSA 種群， ST59 克?。?1. 5%） 最流行， 其次為ST72（20. 5%）。87. 2%的MRSA攜帶Ⅳ型SCCmec，其中亞型Ⅳa 24株，亞型ⅣF 10株。結(jié)論：MRSA的主要基因型為ST59-t437-agr Ⅰ- Ⅳ a， 其耐藥譜主要表現(xiàn)為FOX-OXA- 青霉素（PEN）- 紅霉素（ERY）-克林霉素（CLI）。

［關(guān)鍵詞］ 金黃色葡萄球菌； 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌； 頭孢西??； 苯唑西林； 抗菌譜

［中圖分類號(hào)］ R446. 5 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， S.aureus） 作為一種重要的病原菌依靠攜帶的毒力因子［葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）、表皮剝脫毒素（exfoliative toxins，ETs）］、溶血素、核酸酶、蛋白水解酶和脂肪酶，導(dǎo)致許多疾病，包括皮膚軟組織感染、敗血癥、肺炎、腦膜炎、中毒性休克綜合征、食物中毒和燙傷皮膚綜合征。S. aureus 中， 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA） 通過耐藥基因的水平獲得或自身染色體的堿基突變進(jìn)化出耐藥機(jī)制，使其能夠在抗生素選擇壓力下長期生存， 導(dǎo)致多重耐藥菌（multidrugresistant， MDR） 的出現(xiàn)， 使得對MRSA 的治療變得更加復(fù)雜和困難。為了解來自不同地理分布的菌株的分子流行病學(xué)特征，從而采取高效精準(zhǔn)的藥物治療，研究人員根據(jù)菌株的遺傳特征，采用附屬基因調(diào)節(jié)器分組（accesory gene regulator， agr）、金黃色葡萄球菌A 蛋白分型（staphylococcalprotein A， spa）、多位點(diǎn)序列分型（multilocussequence typing， MLST） 和金黃色葡萄球菌染色體盒mec 分型（staphylococcal chromosomalcassettes mec， SCCmec） 等分型方法對其鑒別，研究結(jié)果顯示：同一譜系菌株的抗菌藥物敏感性存在地理上的差異［1-4］?？仆啬翅t(yī)院研究結(jié)果［5］ 顯示： ST22-MRSA 克隆對慶大霉素（gentamicin，GEN） 和甲氧芐啶-磺胺甲惡唑的耐藥率分別為69. 2% 和84. 6%，而來自中國18 個(gè)省的該克隆的研究結(jié)果顯示對以上2 種抗菌藥物均敏感［6］。來自德國和中國的菌株ST8-IVa-t008 均對克林霉素（cindamycin，CLI） 敏感，但對環(huán)丙沙星的耐藥率卻相差顯著（37. 5% vs 100. 0%）［7-8］。本研究旨在調(diào)查濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院患者M(jìn)RSA 菌株流行情況， 通過耐藥表型和分子分型研究， 獲得MRSA的流行病學(xué)特征，探討不同遺傳背景下的耐藥譜，從而為臨床給藥提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1. 1 主要試劑和儀器

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購于湖南艾科瑞生物工程有限公司， Taq 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR） Mix 預(yù)混液購于生工生物工程（上海） 股份有限公司?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（matrix assisted laserdesorption ionization time-of-flight， MALDI-TOF）和VITEK-2 Compact 型全自動(dòng)細(xì)菌分析儀（法國梅里埃公司）。

1. 2 菌株來源

收集2021 年1?12 月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院和門診患者S. aureus 204 株， 經(jīng)質(zhì)譜儀鑒定后?80 ℃保存。甲氧西林敏感株ATCC 25923 （陰性對照） 和甲氧西林耐藥株ATCC 43300 （陽性對照） 為濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院微生物室留存。SCCmec 各型陽性對照菌株NCTC10042 （Ⅰ 型）、N315 （Ⅱ型）、85/2080 （Ⅲ型）、JCSC4744 （Ⅳ型）和HS663 （Ⅴ型） 由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院余方友主任惠贈(zèng)。

1. 3 S. aureus的藥敏實(shí)驗(yàn)

采用全自動(dòng)VITEK 2 Compact 細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀檢測S. aureus 的抗菌藥物敏感性。檢測的抗生素包括頭孢西?。╟efoxitin， FOX）、苯唑西 林 （oxacillin， OXA）、 青 霉 素 （penicillin，PEN）、 頭孢洛林（ceftarolin， CPT）、GEN、左氧氟沙星（levofloxacin， LVX）、莫西沙星（moxifloxacin， MFX）、紅霉素（erythromycin，ERY）、CLI、利福平（rifampin， RIF）、甲氧芐啶- 磺胺甲惡唑（trimethoprim-sulfamethoxazole，SXT）、萬古霉素（vancomycin， VAN）、替考拉寧（teicoplanin， TEC）、達(dá)托霉素（daptomycin，DAP）、甲氧芐啶- 磺胺甲惡唑（trimethoprimsulfamethoxazole，SXT） 和利奈唑胺（linezolid，LZD）。梯度擴(kuò)散（epsilometric test， E-test） 法檢測 阿 米 卡 星 （amikacin， AMK）、 氯 霉 素（chloramphenicol， CHL） 和米諾環(huán)素（minocycline， MNO） 的最低抑菌濃度（minimuminhibitory concentrations，MICs）。

1. 4 MRSA菌株的鑒定

據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（Clinical andLaboratory Standards Institute， CLSI） 指南，表型MRSA 的診斷標(biāo)準(zhǔn)為FOX MIC≥8 mg·L－1 和（或） OXA MIC≥4 mg·L－1。PCR 法檢測菌株mecA 作為MRSA 的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。評估FOX 和OXA以及二者結(jié)合（FOX+OXA） 的靈敏度（sensitivity，Se）、特異度（specificity，Sp）、陽性預(yù)測值（positive predictive value， PPV）、陰性預(yù)測值（negative predictive value， NPV） 和約登指數(shù)（Youden index，YI）。

1. 5 spa和agr分型

提取菌株DNA 后，采用PCR 法檢測所有菌株的spa 和agr 型別［1-2］。spa 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min），采用凝膠成像儀觀測結(jié)果后，切膠回收純化，由生工生物工程（上海） 股份有限公司測序。所得序列與spaServer 數(shù)據(jù)庫（http：//spaserver. ridom. de） 比對， 確定每個(gè)菌株的spa 型別。agrⅠ～Ⅳ擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度分別為439、572、321 和657 bp。

1. 6 MLST分型

提取菌株DNA 后， 采用PCR 法擴(kuò)增mecA 陽性菌株的7 個(gè)管家基因， 分別編碼氨基甲酸激酶（carbamate kinase， arcC）、 莽 草 酸 脫 氫 酶（shikimate dehydrogenase， aroE） 、甘油激酶（glycerol kinase， glpF）、鳥苷酸激酶（guanylatekinase， gmk）、 磷 酸 乙 酰 轉(zhuǎn) 移 酶 （phosphateacetyltransferase， pta）、 磷 酸 丙 糖 異 構(gòu) 酶（triosephosphate isomerase， tpi） 和乙酰輔酶A 乙酰轉(zhuǎn)移酶（acetyl coenzyme A acetyltransferase，yqiL）［3］ 。測序后所得序列與MLST 數(shù)據(jù)庫（https：//pubmlst. org/saureus/） 比對， 確定每個(gè)菌株的序列類型（sequence type， ST）。利用mega7 軟 件， 采 用 鄰 接 法 （neighbor-joiningmethod，N-J） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將具有密切遺傳背景的ST 聚類為1 個(gè)克隆復(fù)合體（clonalcomplex， CC）。

1. 7 SCCmec分型

采用多重PCR 方案對MRSA 菌株進(jìn)行SCCmec 分型［4］。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 29. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2 檢驗(yàn)或Fisher’s精確概率法比較MRSA 組與甲氧西林敏感菌株（methicillin-susceptible S. aureus，MSSA） 組耐藥率。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 FOX和OXA獨(dú)立及聯(lián)合檢測表型MRSA

通過檢測mecA 共獲得39 株MRSA， 剩余165 株為MSSA。通過檢測FOX 和OXA 的MIC 共獲得51 株表型MRSA，其中FOX 耐藥菌株50 株，OXA 耐藥菌株43 株， FOX 和OXA 耐藥菌株共計(jì)42 株。以mecA 作為確證方法，3 項(xiàng)診斷指標(biāo)的檢測結(jié)果見表1。FOX 篩選出38 株mecA 陽性菌株（Se=97. 4%）， 155 株FOX 敏感菌株中鑒定出154 株mecA 陰性菌株（NPV=99. 4%）。FOX+OXA 篩選出160 株mecA 陰性菌株（Sp=97. 0%），42 株表型耐藥菌株中鑒定出37 株mecA 陽性菌株（PPV=88. 1%）， 且在正確區(qū)分MRSA 與MSSA菌株方面顯示出優(yōu)勢（YI=0. 919）。本研究結(jié)果顯示：2 株mecA 陽性菌株中，1 株對FOX 和OXA敏感， 1 株對FOX 耐藥但對OXA 敏感； 165 株mecA 陰性菌株中， 12 株為表型耐藥： 6 株FOX耐藥，1 株OXA 耐藥，5 株對二者均耐藥。

2. 2 菌株的臨床特征分析

菌株來源于甲狀腺外科、兒科和皮膚科等科室（圖1）。來自甲狀腺外科的S. aureus 最多（n=24， 11. 8%）， 但僅3 株為MRSA。來自兒科的MRSA 比例最高（11/22， 50. 0%）。標(biāo)本來源于膿液、痰液和分泌物等（圖2）。MRSA 的主要來源為膿液（12/39， 30. 8%） 和痰標(biāo)本（12/39，30. 8%）。

2. 3 S. aureus菌株的分子分型

2. 3. 1 agr 和spa 分型

80. 9% 的菌株屬于agrⅠ（n=165）， 其次為agr Ⅱ （17/204 ， 8. 3%） 和agr Ⅳ （16/204， 7. 8%）， agr Ⅲ 含量最少（6/204， 2. 9%）。MRSA 種群中未發(fā)現(xiàn)agr Ⅲ 和agrⅣ，94. 9% 的菌株屬于agrⅠ （n=37） （表2）。S. aureus 中共鑒定出57 種spa 型別，包括5 種新型型別（t20226、t20227、t20228、t20229 和t20230），最常見的spa 型別是t309 （63/204，30. 9%），其次是t437 （24/204， 11. 8%） 和t078 （24/204，11. 8%）（表2）。

2. 3. 2 MRSA 菌株的MLST 分型

MRSA 種群中含有8 種不同的ST， 包括新型型別ST7196 和ST7437。其中， ST59 克?。?4/39， 61. 5%） 最流行， 其次是ST72 （8/39， 20. 5%） 和ST22（2/39，5. 1%）?；贛RSA 菌株的MLST 分型分析，采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示：8 個(gè)ST 分為1 個(gè)克隆復(fù)合體CC59 （ST59 和ST7437） 和6 個(gè)單體克?。▓D3）。

2. 3. 3 MRSA 菌株的SCCmec 分型

87. 2% 的MRSA 為Ⅳ 型SCCmec （n=34）， 包含亞型Ⅳ a（n=24） 和亞型ⅣF （n=10）。剩余的菌株中，3 株攜帶SCCmec Ⅲ，1 株屬于Ⅴ型，1 株為未分型。

2. 3. 4 分子分型間的關(guān)聯(lián)

agr-spa 聯(lián)合分析、57 種不同的spa 型別， 屬于4 個(gè)不重復(fù)的agr 組（表2）。其中，agrⅠ組含有最多種類的spa 型，為37 種，agrⅢ組含有的spa 型最少，僅為3 種。屬于t078 的24 株菌和t002 的6 株菌均為MSSA， 標(biāo)記t2431 的6 株菌均為MRSA。STs-spa 聯(lián)合分析，CC59 包括的t172、t1751、t3527、t3736 和t437 未在其他CCs 或STs 中。t2431 只在克隆ST72 中被鑒別。STs-agr 聯(lián)合分析， 除ST9 和ST965 屬于agrⅡ外， 其余ST 均屬于agrⅠ。ST-SCCmec 組合分析， 除1 株ST59 被鑒定為Ⅲ 型SCCmec 外，CC59 均為Ⅳ a 型SCCmec。ST72 均為Ⅳ F 型SCCmec。

2. 3. 5 MRSA 菌株的流行基因型

綜合分子分型數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示： MRSA 菌株的流行基因型為ST59-t437-agrⅠ -Ⅳ a （21/39， 53. 8%）， 其次為ST72-t2431-agr Ⅰ - Ⅳ F （6/39， 15. 4%）； 兒科MRSA 基因型多為ST72-t2431-agr Ⅰ-ⅣF （6/11，54. 5%），其次為ST59-Ⅳa-t437 （4/11，36. 4%）。

2. 4 S. aureus菌株的藥敏試驗(yàn)

所有菌株對 CPT、LZD、DAP、TEC、VAN和MNO 敏感。菌株對PEN 耐藥率為96. 6%（197/204）， 對ERY （162/204， 79. 4%） 和CLI（160/204， 78. 4%） 耐藥率均大于75%。

MRSA 組患者對FOX、OXA、AMK 和CHL的耐藥率高于MSSA 組，對SXT 的耐藥率則低于MSSA 組（ 表3）。MRSA 組菌株的MDR 率（34/39， 87. 2%） 明顯高于MSSA 組（50/165，30. 3%） 菌株（Plt;0. 01）。MRSA 流行基因型ST59-t437-agrⅠ-Ⅳa （15/21， 71. 4%） 和第二流行基因型ST72-t2431-agr Ⅰ -IVF （4/6， 66. 7%）的耐藥譜均為FOX-OXA-PEN-ERY -CLI （表4）。

3 討 論

本研究中14 株菌表型篩查與mecA 結(jié)果顯示“ 矛盾”。基因型為ST965-t062-agrⅡ -IVF 的菌株MRSA-33 對OXA 和FOX 敏感， 基因型為ST72-t2431-agrⅠ-IVF 的菌株MRSA-6539 對FOX 耐藥，而對OXA 敏感。推測上述OXA 敏感的甲氧西林耐藥（oxacillin sensitive MRSA， OS-MRSA） 菌株，mecA 序列中存在堿基插入或缺失，致其提前終止，編碼的PBP2a 不能執(zhí)行正常功能，或是mecA 啟動(dòng)子序列發(fā)生異常導(dǎo)致mecA 不能進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯［9-10］。GOERING 等［11］ 研究顯示：當(dāng)暴露于抗生素時(shí)，mecA 陽性菌株有逆轉(zhuǎn)為表型耐藥的能力，同時(shí)，調(diào)節(jié)blaZ 基因轉(zhuǎn)錄的blaR1 的截?cái)嗷蛉笔б部蓪?dǎo)致OXA 和（或） FOX 敏感［12］。小菌落變異（small-colony variants， SCVs） 使細(xì)菌對外界感知下降， 從而對抗菌藥物不敏感。對剩余菌株的研究［13］ 表明：菌株改良的OXA 耐藥金黃色葡萄球菌（modified S. aureus， MODSA） 的pbp （pbp1～3）基因突變導(dǎo)致編碼的PEN 結(jié)合蛋白對藥物的親和力降低而耐藥。BA 等［14］ 研究顯示：編碼環(huán)狀二腺苷磷酸二酯酶的GdpP 的截短同樣介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類耐藥。缺失mec 結(jié)構(gòu)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant lacking mec， MRLM） 對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥可能是由于細(xì)菌體內(nèi)超產(chǎn)的β-內(nèi)酰胺酶，水解抗菌藥物中的β-內(nèi)酰胺環(huán)而耐藥。上述研究結(jié)果顯示表型耐藥和相關(guān)基因之間的復(fù)雜性，也與表型檢測的操作過程和菌液濃度等操作誤差有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示流行的MRSA 克隆為ST59，與LI 等［15］ 和WANG 等［16］ 研究結(jié)果一致。但與其他國家的研究結(jié)果不盡相同。日本地區(qū)主要的MRSA 基因型是ST1-t1784 和ST8-t008， ST59 僅零星出現(xiàn)［17-18］。英格蘭地區(qū)主要的MRSA 克隆是ST22， 但該型在本研究結(jié)果中僅占5. 1% ［19］。上述研究結(jié)果表明不同地區(qū)有其特定的MRSA 的基因型。

本實(shí)驗(yàn)中， 97. 4% 的MRSA 對GEN 敏感，92. 3%對LVX敏感，均明顯高于RICCOBONO 等［20］的結(jié)論，而對ERY 的敏感性低于RICCOBONO 等［20］的結(jié)論（7. 7% vs 29. 0%，P=0. 014）。XIONG等［21］研究發(fā)現(xiàn)MRSA 對PEN、ERY、CLI、GEN、LVX、MFX 和RIF 的耐藥率明顯高于MSSA 組，而在本研究中未發(fā)現(xiàn)存在差異。推測不同地理分布的細(xì)菌對藥物選擇性壓力不同，造成對同種藥物的不同耐藥率。

MRSA 主要譜系ST59-t437 對β - 內(nèi)酰胺類（100. 0%）、大環(huán)內(nèi)酯類（ERY， 95. 2%） 和林可酰胺類（CLI， 90. 5%） 耐藥，而對其他抗菌藥物均較為敏感（gt;90%），較低的抗性適應(yīng)成本使該譜系在生長和競爭方面具有優(yōu)勢。本研究中未鑒定出以往的優(yōu)勢克隆ST239， 可能的原因是ST239對RIF、LVX、MFX 和四環(huán)素具有抗性， 攜帶或獲得的耐藥基因增加其進(jìn)化負(fù)擔(dān)， 導(dǎo)致其失去優(yōu)勢［15-16］。美國舊金山綜合醫(yī)院的研究［22］ 結(jié)果顯示：72. 1% 的ST59 菌株對ERY 耐藥，但對CLI 的耐藥率（11. 8%） 低于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。WARD 等［23］ 研究結(jié)果表明： 美國ST59 克隆多攜帶ermA 基因， 推測本實(shí)驗(yàn)中的ST59 克隆可能攜帶對ERY 和CLI 耐藥的ermB 基因。本實(shí)驗(yàn)中，ST59 克隆除攜帶t437和Ⅳa 型SCCmec，還攜帶t172、t3527、t3736 和Ⅲ型SCCmec，但比例較低，表明該克隆基因結(jié)構(gòu)的多樣性。雖然Ⅲ型SCCmec 元件中存在攜帶抗性基因的質(zhì)粒pT181、轉(zhuǎn)座子Tn554 和ψTn554 ，復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)并未改變該克隆的耐藥表型［24］。

本研究結(jié)果顯示： 來自兒科的MRSA， 主要基因型是ST72-t2431-agrⅠ -Ⅳ F （50. 0%）， 其次是ST59-t437-agrⅠ-Ⅳa。2 種不同遺傳背景下菌株的耐藥譜差異不大，主要表現(xiàn)為ERY-CLI-β-內(nèi)酰胺類。本研究結(jié)果顯示： 主要兒童MRSA 譜系與全球流行的ST5-Ⅳ的結(jié)論不同。中國兒童菌株的普遍基因型為ST59-MRSA-Ⅳ/Ⅴ，對ERY 耐藥率大于78. 6%，但對CLI 耐藥率卻相差很大［25-26］。本研究中的ST72-IVF 對ERY 和CLI 的耐藥率均為83. 3% （5/6），高于國內(nèi)外的研究結(jié)果：中國兒童MRSA 種群中零星出現(xiàn)的ST72-Ⅳ 對ERY 和CLI敏感［26］，韓國某兒童醫(yī)院的研究結(jié)果顯示對ERY和CLI 均敏感的分離株克隆主要是ST72-Ⅳ ［27］。葡萄牙地區(qū)對2 100 名兒童的研究結(jié)果顯示： ST72-Ⅳc 對ERY 和CLI 耐藥［28］。Ⅳ型SCCmec 含有很多亞型（Ⅳa 到 Ⅳn），ⅣF 和Ⅳc 等亞型對紅霉素和CLI 耐藥的影響還需要大量樣本的研究驗(yàn)證。雖有研究［29］ 表明： ST72-Ⅳ 克隆引起的死亡率明顯低于ST5-Ⅱ，但兒科流行的MRSA 克隆仍應(yīng)引起臨床醫(yī)生的關(guān)注。

綜上所述， 本研究中流行的MRSA 基因型為ST59-t437-agrⅠ -Ⅳ a， 主要耐藥譜為FOX-OXAPEN-ERY-CLI。兒科可能存在MRSA 流行，主要基因型為ST72-t2431-agr Ⅰ - Ⅳ F。spa、agr、MLST 和SCCmec 分子分型間的關(guān)聯(lián)尚需要大量樣本支持。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：紀(jì)冰負(fù)責(zé)論文的整體設(shè)計(jì)，付明霞、李娜和王鳳霞負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)獲取，胡遠(yuǎn)芳和陳宇佳負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析，梁進(jìn)負(fù)責(zé)論文撰寫，紀(jì)冰和梁進(jìn)負(fù)責(zé)論文的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

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[基金項(xiàng)目] 山東省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2020MH309）