［摘 要］ 目的：探討重癥肌無力 （MG） 患者外周血單個核細(xì)胞 （PBMCs） 中線粒體自噬和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平，闡明其對MG診斷的指導(dǎo)價值。方法：收集并提取50名健康對照者 （對照組）和50 例MG 患者（MG 組） 的PBMCs，采用實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法和Western blotting 法檢測線粒體自噬因子磷脂酶和張力蛋白同源物（PTEN） 誘導(dǎo)激酶1 （PINK1）、E3 泛素連接酶PARK2 （Parkin）、泛素結(jié)合蛋白62 （p62）、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 （LC3Ⅱ） 及凋亡因子細(xì)胞色素C（Cyt-C）、B 細(xì)胞淋巴瘤2 （Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)Ｘ 蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶 3（caspase 3） 和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶 9 （caspase 9） 的mRNA 以及蛋白表達(dá)水平， 根據(jù)mRNA 檢測結(jié)果設(shè)定多個不同臨界值，在每個臨界值處計算出相應(yīng)的靈敏度和特異度，并繪制受試者工作特征 （ROC） 曲線。結(jié)果：與對照組比較，MG組患者PBMCs中的自噬因子PINK1、Parkin和LC3Ⅱ的mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01），p62 mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）； 凋亡因子Cyt-C、Bax、caspase 3 和caspase 9 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， Cyt-C mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， 而Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）。ROC 曲線檢測，PINK1、Parkin、p62 和LC3Ⅱ的ROC 曲線下面積（AUC） 分別為0. 969 6 （95%CI：0. 943 5～0. 995 7）、0. 944 0 （95%CI：0. 904 7～0. 983 3）、0. 855 6（95%CI： 0. 776 7～0. 934 5） 及0. 908 8 （95%CI： 0. 852 6～0. 965 0）（Plt;0. 01）， 靈敏度分別為92%、92%、78% 和84%， 特異度分別為88%、82%、92% 和82%； 而Cyt-C、Bax、Bcl-2、caspase 3和caspase 9的AUC均為1. 000（Plt;0. 01），靈敏度和特異度均達(dá)到100%。結(jié)論：MG患者PBMCs 中存在線粒體自噬障礙和凋亡增加現(xiàn)象，其對臨床診斷MG 具有較高的指導(dǎo)價值。

［關(guān)鍵詞］ 重癥肌無力； 線粒體自噬； 細(xì)胞凋亡； 外周血單個核細(xì)胞； 診斷價值

［中圖分類號］ R746. 1 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG） 是由自身抗體介導(dǎo)的獲得性神經(jīng)-肌肉接頭（neuromuscularjunction， NMJ） 傳遞障礙的自身免疫性疾?。?］。臨床表現(xiàn)為骨骼肌波動性無力及易疲勞，活動后加重，休息后可減輕。流行病學(xué)研究［2］ 顯示：MG 的全球年發(fā)病率為（1. 0～2. 9） /10 萬， 患病率為（10～35） /10 萬。目前臨床對MG 的診斷和治療主要是針對其免疫發(fā)病機制，然而臨床上仍有5%～10% 的血清抗體雙陰性MG 患者診斷不明確，這給MG 治療帶來一定的困難［3］。近年來，MG 的線粒體損傷機制逐漸得到廣泛關(guān)注。MG 的線粒體形態(tài)學(xué)改變、能量代謝障礙和融合分裂失衡現(xiàn)象及機制等均已得到證實。線粒體融合分裂和自噬是線粒體質(zhì)量控制的核心環(huán)節(jié)，兩者之間相互影響、相互轉(zhuǎn)化， 此外， 線粒體自噬障礙會進一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前MG 線粒體融合分裂失衡機制已得到證實，而關(guān)于線粒體自噬及凋亡在MG 發(fā)病中的作用機制仍尚未完全闡明［4-5］。本研究通過探討MG 患者外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclearcells， PBMCs） 中線粒體自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的差異，闡明MG 患者PBMCs 中存在線粒體自噬障礙和凋亡增加的現(xiàn)象， 對在臨床中協(xié)助診斷MG 具有一定的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1. 1 臨床資料

收集 2018年 10月—2020年 12月于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科住院的符合MG 診斷標(biāo)準(zhǔn)的50 例MG 患者作為試驗組（MG 組），以來自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢科體檢人員和醫(yī)院工作人員中符合條件的健康對照者共50 名作為正常對照組（對照組）。MG 診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合必備條件，同時至少符合參考條件中的其中一項。必備條件：典型的MG 癥狀，骨骼肌波動性無力和易疲勞，休息可緩解。參考條件：①新斯的明或滕喜龍試驗陽性；②肌電電生理改變，重復(fù)神經(jīng)電刺激（repetitive nerve stimulation， RNS）呈現(xiàn)衰減現(xiàn)象； 單纖維肌電圖有Jitter （顫抖） 大于55 μs 或阻滯的表現(xiàn)；③抗乙酰膽堿受體抗體試驗陽性； ④ 影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)胸腺增生或腫瘤；⑤疲勞試驗陽性。MG 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者年齡為14～75 歲， 入院第一診斷為MG， 并符合Osseman 分型中的Ⅱ型；患者臨床資料完整，知情并同意加入本課題，并簽署知情同意書。MG 患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①除MG 疾病外，并發(fā)其他自身免疫性疾??； ② 臨床資料缺項； ③ 近期發(fā)生嚴(yán)重的感染性疾病，或并發(fā)較為嚴(yán)重的心腦血管疾病及惡性腫瘤等； ④ 近期發(fā)生肌無力危象， 以及近3 個月內(nèi)曾使用激素類和（或） 免疫抑制劑等方法治療者；⑤ 近期曾參與其他臨床研究。健康對照者納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在14～75 歲；②無MG 病史，且未并發(fā)心肺及精神等疾??；③知情并同意加入本課題。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意， 倫理審批號： NO. ZYYECK ［2018］ 075， 健康對照者和MG 患者均簽署知情同意書。

1. 2 主要試劑和儀器

Ficoll-Paque PREMIUM淋巴細(xì)胞分離液購自美國GE Healthcare 公司，SDSPAGE凝膠配制試劑盒購自中國碧云天公司，全蛋白提取試劑盒和BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購自中國凱基生物公司，ECL 化學(xué)發(fā)光液購自美國Bio-Rad 公司， anti-B 細(xì)胞淋巴瘤2 （B cell lymphoma2， Bcl-2）、anti-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶9（cysteine containing aspartic protease 9， caspase 9）和anti-磷脂酶和張力蛋白同源物（phosphatase andtensinhomolog， PTEN） 誘導(dǎo)激酶1 （PTENinducedputative kinase protein 1，PINK1）、anti-微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3Ⅱ型（microtubule-associated protein1 light chain 3 type Ⅱ ， LC3Ⅱ） 和anti-GAPDH 購自美國Abcam 公司，anti-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3 （cysteine-containing aspartic protease 3，caspase 3）、anti-Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 related Xprotein， Bax）、anti- 細(xì)胞色素C （cytochrome C，Cyt-C）、anti-E3 泛素連接酶PARK2 （E3 ubiquitinligase PARK2，Parkin） 和anti-SQSTM1/泛素結(jié)合蛋白62 （ubiquitin binding protein p62，p62） 購自美國CST 公司， TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ 和PrimeScriPtTM RT Master Mix 購自日本TaKaRa 公司，TRNzol-A+購自中國廣茂化學(xué)試劑有限公司，正向引物和反向引物購自上海捷瑞生物工程有限公司。高速冷凍離心機（型號： 5424R） 購自美國Eppendorf 公司， 酶標(biāo)儀（型號： 800TS） 購自美國Bio-Tek 公司，電泳系統(tǒng)（型號：1645050）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號：1708265） 和實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 儀（型號：CFX96TM） 均購自美國Bio-Rad 公司，紫外分光光度計（型號：K5500） 購自北京凱奧科技發(fā)展有限公司。

1. 3 外周血采集及單個核細(xì)胞的提取

采 用EDTA 抗凝采血管抽取健康對照者和MG 患者空腹外周血約5 mL，采用Ficoll 密度梯度離心法淋巴細(xì)胞分離液分離PBMCs，置于－80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 RT-qPCR法檢測 PBMCs中線粒體自噬和凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平

采用TRIzol法提取PBMCs總RNA，并用紫外分光光度計測量RNA 的濃度和純度。然后嚴(yán)格按照PrimeScriPtTM RT Master MixKit 說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照說明書進行熒光定量PCR， 所需目的基因引物序列見表1。PCR 擴增條件： 95 ℃ 預(yù)變性30 s， 95 ℃ 變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后觀察擴增曲線和熔解曲線。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－△△Ct 法計算自噬和凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平。

1. 5 Western blotting 法檢測 PBMCs中線粒體自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

在裝有PBMCs的離心管中加入提前配制好的蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白， BCA 法測定蛋白濃度。按照計算體系加入相應(yīng)蛋白到10% SDS-PAGE 凝膠孔中進行電泳，完成電泳后將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5% 脫脂牛奶室溫封閉1. 5 h， 隨后加入一抗4 ℃孵育過夜， 目標(biāo)蛋白抗體按1∶1 000 比例稀釋， GAPDH 按1∶5 000 比例稀釋?；厥找豢购螅鶕?jù)一抗動物種屬分別加入相對應(yīng)的二抗，室溫下孵育1. 5 h。二抗孵育結(jié)束后，使用凝膠成像系統(tǒng)對目的條帶進行曝光，采用Image J 軟件對條帶進行灰度分析定量，以GAPDH 為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 6 PMBC中線粒體自噬和凋亡相關(guān)基因mRNA的受試者工作特征（receiver operatorcharacteristic， ROC）曲線的繪制

計算曲線下面積（area under curve，AUC），評估線粒體自噬和凋亡基因?qū)G 診斷的靈敏度、特異度及預(yù)測價值。約登指數(shù)也稱正確指數(shù)，約登指數(shù)= 靈敏度+ 特異度-1，約登指數(shù)越大說明真實性越大。通過SPSS 軟件計算出所有組別對應(yīng)的約登指數(shù)，約登指數(shù)最大值所對應(yīng)的即為最佳的指標(biāo)閾值，篩選出相應(yīng)指標(biāo)所對應(yīng)的敏感度及特異度。

1. 7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 24. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。2 組研究對象的性別構(gòu)成比以例數(shù)表示， 組間比較采用χ2 檢驗； 2 組研究對象的年齡，PBMCs 中的PINK1、Parkin、p62、LC3Ⅱ、Cyt-C、Bax、Bcl-2、caspase 3 和caspase 9 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布， 以-x±s 表示， 2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t 檢驗，以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 2組研究對象的一般資料

對照組研究對象中男性25 名， 女性25 名， 平均年齡為（40. 2±16. 0） 歲， MG 組患者中男性18 例， 女性32 例，平均年齡為（44. 2±16. 6） 歲。2 組研究對象性別構(gòu)成比和年齡分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05），具有可比性。

2. 2 2組研究對象PBMCs中線粒體自噬相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平

與對照組比較，MG 組患者PBMCs 中PINK1、Parkin 和LC3Ⅱ mRNA 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）， 而p62 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）。見表2。

2. 3 2組研究對象PBMCs中凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平

與健康對照組比較， MG 組患者 PBMCs 中Cyt-C、Bax、Caspase 3 和Caspase 9 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01），Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）。見表3。

2. 4 2組研究對象PBMCs中線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與對照組比較，MG 組患者 PBMCs中PINK1、Parkin 和LC3Ⅱ/Ⅰ 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）， 而p62 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）。見圖1。

2. 5 2組研究對象PBMCs中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與對照組比較， MG 組患者PBMCs 中Cyt-C、Bax、caspase 3 和caspase 9 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）。見圖2。

2. 6 2組研究對象PBMCs中線粒體自噬及凋亡相關(guān)基因 mRNA 的 ROC 曲線

結(jié)合約登指數(shù)結(jié)果，可得自噬相關(guān)基因PINK1、Parkin、p62 和LC3Ⅱ的靈敏度分別為92%、92%、78% 和84%， 特異度分別為88%、82%、92% 和82%。凋亡相關(guān)基因的靈敏度和特異度均為100%。PINK1、Parkin、p62 和LC3 Ⅱ 的AUC 分別為0. 969 6 （95%CI：0. 943 5～0. 995 7）、0. 944 0 （95%CI： 0. 904 7～0. 983 3）、0. 855 6 （95%CI： 0. 776 7～0. 934 5）及0. 908 8 （95%CI：0. 852 6～0. 965 0）（Plt;0. 01），而Cyt-C、Bax、Bcl-2、caspase 3 和caspase 9 的AUC 均為1. 000 （Plt;0. 01），AUC 均大于0. 8，表明線粒體自噬和凋亡相關(guān)基因?qū)G 的診斷具有較高的指導(dǎo)價值。見圖3。

3 討 論

MG 是國內(nèi)外公認(rèn)的疑難病，近年來，MG 的線粒體損傷機制研究取得突破。線粒體是細(xì)胞生命活動的“ 動力站”， 對骨骼肌維持正常生理功能、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及再生有重要的調(diào)節(jié)作用［6］。研究［7］發(fā)現(xiàn)： MG 患者PBMCs 線粒體動力學(xué)的平衡被打破， 線粒體分裂活躍并且出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變。TANG 等［8］ 研究發(fā)現(xiàn)MG 患者的骨髓干細(xì)胞中存在自噬缺陷，并且導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，本課題組前期研究［4-5］ 已證實MG 患者PBMCs 和動物模型中存在線粒體能量代謝障礙及融合分裂失衡等現(xiàn)象， 對臨床診斷MG 具有一定的指導(dǎo)意義。本研究通過檢測MG 患者PBMCs 中的線粒體自噬和凋亡指標(biāo)的表達(dá)水平，進一步探討線粒體自噬和凋亡與MG發(fā)病的相關(guān)性，評估其對臨床診斷MG 的指導(dǎo)價值。

線粒體自噬由LEMASTERS［9］首次提出，是一種選擇性去除受損線粒體的過程，在肌肉的發(fā)生過程中對線粒體形態(tài)重塑的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，其功能障礙會阻止成肌細(xì)胞融合成肌管，影響骨骼肌功能，導(dǎo)致肌肉萎縮和肌無力等癥狀， 而PTEN 誘導(dǎo)激酶1（PTEN-induced putative kinase protein 1，PINK1） /E3泛素連接酶PARK2（Parkin） 通路在成肌細(xì)胞分化的早期即被激活，是調(diào)控線粒體自噬的重要通路［10］。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 （microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3） 及LC3Ⅰ所形成的共軛體LC3Ⅱ和泛素結(jié)合蛋白p62 （由SQSTM1基因編碼，全稱sequestosome 1） 作為PINK1 和Parkin 的下游蛋白，對維持正常線粒體自噬功能起至關(guān)重要的作用［11］。

本研究結(jié)果顯示： MG 患者PBMCs 中的線粒體自噬相關(guān)基因PINK1、Parkin 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的mRNA 及蛋白表達(dá)水平降低， p62 mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高。MUCHA 等［12］ 研究發(fā)現(xiàn)：在杜氏肌營養(yǎng)不良（duchenne muscular dystrophy，DMD）患者和動物模型中發(fā)現(xiàn)肌營養(yǎng)不良蛋白缺乏主要是由于自噬缺陷， PINK1 基因表達(dá)水平明顯降低，表明PINK1 低表達(dá)所導(dǎo)致的自噬缺陷參與杜氏肌營養(yǎng)不良（duchenne muscular dystrophy， DMD）的發(fā)病。SEABRIGHT 等［13］ 研究發(fā)現(xiàn)：在骨骼肌細(xì)胞中，Parkin 的正常激活可誘導(dǎo)線粒體自噬，從而維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)Parkin 蛋白表達(dá)水平降低時，骨骼肌線粒體出現(xiàn)自噬障礙和功能異常。SMITH等［14］研究發(fā)現(xiàn)在肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateralsclerosis，ALS） 中可以觀察到細(xì)胞出現(xiàn)大量破碎及圓形的線粒體累積，并且證實該現(xiàn)象是由Parkin功能異常及p62 基因缺陷導(dǎo)致自噬缺陷無法清除受損線粒體所引起的。TANG 等［8］ 研究證實：與健康對照組比較，MG 患者的骨髓單個核細(xì)胞中LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平明顯降低，p62 蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明MG 存在線粒體自噬障礙。WANG 等［15］研究發(fā)現(xiàn)：MG 患者的調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞存在線粒體自噬體成熟障礙，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組。

結(jié)合上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 在MG、DMD 和ALS 等神經(jīng)肌肉病中，線粒體存在自噬功能障礙，從而引起骨骼肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡和肌細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果表明： MG 患者PBMCs 中存在線粒體自噬障礙， 進一步證實其與MG 發(fā)病具有密切的相關(guān)性。適當(dāng)?shù)淖允煽赏ㄟ^抑制細(xì)胞凋亡實現(xiàn)保護骨骼肌的作用，而過度激活或抑制自噬則可進一步誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，促進骨骼肌損傷［16］。

細(xì)胞凋亡是指機體為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的程序性細(xì)胞死亡。在多數(shù)脊椎動物中，線粒體通路是主要的調(diào)節(jié)形式，是由線粒體、Cyt-C、caspases 家族和Bcl-2 家族一系列基因共同調(diào)控的信號網(wǎng)絡(luò)［17］。

Bax 和Bcl-2 均屬于Bcl-2 家族蛋白， 其中Bax屬于促凋亡蛋白，Bcl-2 屬于抗凋亡蛋白，兩者相結(jié)合可抑制Cyt-C 的釋放，抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)線粒體凋亡被激活，Cyt-C 從線粒體釋放到胞質(zhì)中啟動下游級聯(lián)反應(yīng)，激活caspase 9 和caspase 3，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［18］。研究［19］ 發(fā)現(xiàn)：線粒體凋亡信號傳導(dǎo)與成肌細(xì)胞向多核肌管分化有關(guān)，在骨骼肌萎縮的情況下，多核肌纖維中的線粒體凋亡發(fā)生改變。

本研究結(jié)果顯示：凋亡相關(guān)基因中Cyt-C、Bax、caspase 3 和caspase 9 mRNA 及蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低。TANG 等［8］ 研究發(fā)現(xiàn)：與健康對照組比較，MG 組患者的骨髓單個核細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低，Bax 和caspase 3蛋白表達(dá)水平升高，表明MG 患者骨髓單個核細(xì)胞存在自噬障礙和凋亡增加。李艷等［20］ 研究發(fā)現(xiàn)：實驗性自身免疫性重癥肌無力（experimentalautoimmune myasthenia gravis， EAMG） 大鼠下丘腦的Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低， Bax 蛋白表達(dá)水平升高，而腎上腺摘除后Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低和Bax 蛋白表達(dá)水平升高更加顯著，表明腎上腺摘除可以增加EAMG 大鼠的易感性， 促進細(xì)胞凋亡，從而加重EAMG 大鼠的肌無力癥狀。CHEN 等［21］研究發(fā)現(xiàn)：Fukutin相關(guān)蛋白（Fukutin-related protein，F(xiàn)KRP） 基因相關(guān)肌營養(yǎng)不良中自噬溶酶體減少，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低， 而Bax 蛋白表達(dá)水平升高。在成肌細(xì)胞分化過程中，自噬通過調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的凋亡信號，保護分化成肌細(xì)胞免受過度細(xì)胞凋亡的影響。RAHMAN 等［19］ 研究發(fā)現(xiàn)： 亨廷頓舞蹈癥動物模型中表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量的顯著損失，伴隨著Cyt-C、caspase 3 和caspase 9 蛋白活性的升高， 說明凋亡增加是該病的重要發(fā)病機制。研究［19］發(fā)現(xiàn)：在C2C12 成肌細(xì)胞中，caspase 9 蛋白活性升高會影響成肌細(xì)胞的分化，通過抑制caspase 9蛋白的活性可以改善自噬缺陷成肌細(xì)胞的分化。AVRUTSKY 等［22］ 研究證明： caspase 9 蛋白上調(diào)與慢通道綜合征（slow-channel syndrome， SCS）存在的肌無力障礙相關(guān)，這是一種由乙酰膽堿受體突變引起的綜合征。

適度的細(xì)胞凋亡，尤其是caspase 通路的激活是骨骼肌發(fā)育所必需的。過度激活的凋亡信號導(dǎo)致成肌細(xì)胞分化失敗，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［21］。結(jié)合以上研究結(jié)果，說明自噬功能障礙可促進細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而引起肌細(xì)胞損傷和肌營養(yǎng)不良等發(fā)生，導(dǎo)致骨骼肌失能以及參與神經(jīng)肌肉病的發(fā)病。MG 患者PBMCs 的凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平異常上升提示MG中可能存在凋亡現(xiàn)象，結(jié)合其ROC 曲線結(jié)果可以得出，凋亡相關(guān)指標(biāo)對診斷MG 具有較高的靈敏度、特異度和診斷價值。

綜上所述，與對照組比較，MG 組患者PBMCs中線粒體自噬和凋亡相關(guān)基因表達(dá)異常，表明MG患者PBMCs 中存在線粒體自噬障礙和凋亡增加。ROC 曲線提示自噬和凋亡相關(guān)基因在診斷MG 中具有較高的靈敏度和特異度，AUC 均大于0. 8，表明線粒體自噬和凋亡相關(guān)基因在臨床診斷MG 中具有較高的指導(dǎo)價值。雖然肌肉活檢和病理檢查是診斷MG 肌細(xì)胞損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，然而，考慮肌肉活檢為有創(chuàng)檢查，臨床診斷MG 不建議常規(guī)進行肌肉活檢，而MG 患者PBMCs 簡單易得且創(chuàng)傷小，具有較高的可接受度，值得廣泛推廣。因此，臨床可通過檢測MG 患者血清PBMCs 中的線粒體自噬和凋亡基因的mRNA 和蛋白表達(dá)水平來指導(dǎo)診斷MG，提高臨床診斷MG 的準(zhǔn)確性，可對目前MG 的發(fā)病機制和診斷方法起到補充作用，同時，線粒體自噬和凋亡作為線粒體損傷機制的重要組成部分，可作為未來治療MG 的潛在新靶點。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：宋雅芳和江其龍負(fù)責(zé)實驗和論文的整體設(shè)計，蔡東紅負(fù)責(zé)實驗實施和論文撰寫，江其龍、李青和柯鈴鈴負(fù)責(zé)病例的收集及樣本的采集以及實驗實施，張涵、鐘慧雅和蔡東紅負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。

[參考文獻(xiàn)]

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[基金項目] 國家自然科學(xué)基金面上項目（82374391）；廣東省科技廳自然科學(xué)基金面上項目（2023A1515011127）；廣東省教育廳生物醫(yī)藥與健康重點領(lǐng)域?qū)ｍ棧?021ZDZX2032）