［摘 要］ 目的：分析膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物1（Gli1） 和性別決定區(qū)Y框蛋白2（Sox2） 在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其病理學(xué)意義，探討Gli1與宮頸癌干性特征的相關(guān)性。方法：采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測159 例宮頸癌組織中Gli1、缺氧誘導(dǎo)因子1α （HIF-1α）、Sox2、性別決定區(qū)Y 框蛋白9（Sox9）、分化簇44 （CD44）、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4 （OCT4） 和賴氨酸特異性去甲基化酶1 （LSD1）的表達(dá)并分析其相關(guān)性；使用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析（GEPIA） 明確Gli1 對宮頸癌狀細(xì)胞患者預(yù)后的影響及其與干細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性；缺氧條件下檢測SiHa 細(xì)胞的球體形成能力及其干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)。結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色，在宮頸癌組織中 Gli1表達(dá)率與 HIF-1α（r=0. 374，Plt;0. 001） 和Sox2 表達(dá)水平（r=0. 176，Plt;0. 05） 呈正相關(guān)關(guān)系；GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析，宮頸癌中Gli1 陽性表達(dá)的患者預(yù)后差（Plt;0. 05）。缺氧條件下SiHa 細(xì)胞中Gli1、HIF-1α 和Sox2 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平均明顯升高 （Plt;0. 001），且具有較強(qiáng)的球體形成能力。結(jié)論：缺氧上調(diào)宮頸癌細(xì)胞 Gli1和 Sox2 mRNA及蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)癌細(xì)胞的干性特征形成。

［關(guān)鍵詞］ 宮頸腫瘤； 膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物1； 缺氧； 干性； 缺氧誘導(dǎo)因子1a

［中圖分類號］ R737. 33 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

宮頸癌在全球女性常見癌癥中排名第3 位［1］，是全球女性死亡的主要原因之一，高居女性生殖系統(tǒng)相關(guān)死亡的第1 位，每年約有53 萬宮頸癌新發(fā)病例及27. 5 萬因?qū)m頸癌死亡病例［2-3］。我國每年約有13 萬宮頸癌新發(fā)病例， 年輕女性宮頸癌發(fā)病率和死亡率的上升趨勢尤為顯著［1，4］。宮頸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells， CSCs） 密切相關(guān)， 這是導(dǎo)致患者預(yù)后較差的重要因素［3，5］。在實(shí)體瘤細(xì)胞及大部分腫瘤組織中，缺氧可維持或增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的干性特征，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展和耐藥［6］。其中缺氧誘導(dǎo)因子1α （hypoxia-induciblefactor-1α， HIF-1α） 主要參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和肉芽組織形成，調(diào)節(jié)腫瘤組織的新陳代謝、腫瘤細(xì)胞的增殖及血管生成、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［7-9］。刺猥信號通路（Hedgehog，Hh） 通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展各個(gè)階段，其中膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物1 （glioma-associated oncogenehomolog 1， Gli1） 作為Hh 通路的重要轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生并參與調(diào)控膠質(zhì)瘤CSCs 和內(nèi)源性腦干細(xì)胞的生長及增殖，并且Gli1 可能是食管鱗狀細(xì)胞癌、肺鱗癌和乳腺導(dǎo)管癌潛在的干細(xì)胞標(biāo)志物［10］。先前研究［5，10-14］ 表明： Gli1 在乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌組織中均高表達(dá)，是判定患者預(yù)后的獨(dú)立因素，且與性別決定區(qū)Y 框蛋白2 （sex determining region Y2，Sox2）、性別決定區(qū)Y 框蛋白9 （sex determiningregion Y9， Sox9）、 分 化 簇 44 （cluster ofdifferentiation， CD44） 和賴氨酸特異性去甲基化酶1 （lysine-specific demethylase 1，LSD1） 等干性相關(guān)標(biāo)志物及HIF-1α 呈正相關(guān)關(guān)系［5，10-14］，但研究并未探討缺氧條件下Gli1 蛋白及干性標(biāo)志物的表達(dá)情況。目前，Gli1 在宮頸癌中的表達(dá)與干性特征以及缺氧之間的相關(guān)關(guān)系尚不清楚。本研究探討Gli1蛋白對宮頸癌發(fā)生和預(yù)后的影響，分析Gli1 蛋白表達(dá)與宮頸癌干細(xì)胞標(biāo)志物以及缺氧的相關(guān)性。

1 資料與方法

1. 1 臨床資料

41例正常宮頸上皮組織、19例宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN） Ⅰ/Ⅱ級和110 例CIN Ⅲ級及159 例宮頸癌組織標(biāo)本來自上海芯超生物科技有限公司以及延邊大學(xué)附屬醫(yī)院病理科1996—2006 年診斷并行錐形切除或子宮切除的組織蠟塊存檔標(biāo)本。組織病理學(xué)CIN 分級參照Riehart 標(biāo)準(zhǔn)： CIN Ⅰ 級、CIN Ⅱ 級和CIN Ⅲ 級。本研究獲得延邊大學(xué)科技倫理委員會的批準(zhǔn)（倫理批號： YD20231027007）。組織標(biāo)本常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin， HE）染色觀察，選取適當(dāng)蠟塊進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1. 2 細(xì)胞、主要試劑和儀器。

人宮頸癌 SiHa細(xì)胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫（American Type CultureCollection， ATCC）； Gli1 （ab151796）、Sox2（ab97959）、Sox9 （ab185966）、LSD1 （ab62582）、CD44 （ab51037）、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor 4， OCT4）（ab181557） 和actin （ab8277） 抗體購自英國Abcam 公司， HIF-1α （2136621） 抗體購自美國Millipore 公司， RIPA 裂解液、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride， PVDF）、雙吡啶甲酸（bicinchoninic acid， BCA） 蛋白檢測試劑盒和免疫組織化學(xué)試劑盒購自上海碧云天公司，TE 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantiattive PCR，RT-qPCR）儀（型號：nexus），和Western blotting 電泳系統(tǒng)及凝膠成像儀（型號：Power Pac） 購自美國Bio-Rad公司， TRIzol 試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen 公司， 激光共聚焦顯微鏡購自日本尼康株式會社。

1. 3 免疫組織化學(xué)染色檢測正常宮頸組織和宮頸癌組織中 Gli1、HIF-1α及干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物 Sox2、Sox9、CD44、OCT4 和 LSD1 的表達(dá)。

常規(guī)脫蠟和水 化 后， 切 片 用 98 ℃ 的 Tris-EDTA 緩 沖 液（pH9. 2） 進(jìn)行抗原修復(fù)。Gli1、 HIF-1α 和干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Sox2、Sox9、CD44、OCT4 和LSD1一抗室溫孵育2 h，抗鼠/兔二抗與組織標(biāo)本在室溫下孵育1 h，使用顯色劑3，3-二氨基聯(lián)苯胺對組織標(biāo)本進(jìn)行染色。染色結(jié)果按陽性細(xì)胞所占百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度分別計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比≤25% 計(jì)為1 分， ≤26%～50% 計(jì)為2 分， lt;51%～75% 為3 分，≥76% 計(jì)為4 分；細(xì)胞著色淡黃色計(jì)為1 分，棕黃色計(jì)為2 分，棕褐色計(jì)為3 分。將2 項(xiàng)得分的乘積作為最終評分，總分lt;4 分為陰性，≥4 分為陽性。

1. 4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

SiHa細(xì)胞常氧狀態(tài)下置于37 ℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱中，SiHa 細(xì)胞缺氧狀態(tài)下置于37 ℃ 、5% CO2、1% O2 和94% N2 的培養(yǎng)箱中，用含10% 胎牛血清、100 U·mL－1 青霉素G 和100 mg·L－1 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞分為常氧條件組和缺氧條件組。

1. 5 RT-qPCR法檢測不同的缺氧時(shí)間宮頸癌細(xì)胞中HIF-1α、Gli1及干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平

使用TRIzol 法提取細(xì)胞中的RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件： 37 ℃ 、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃進(jìn)行保存。按照表1 所示，設(shè)計(jì)Gli1、HIF-1α 和干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物引物， 進(jìn)行RT-qPCR 法擴(kuò)增， 擴(kuò)增條件： 95 ℃ 、5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)， 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehude-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 為內(nèi)參，采用2－ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA 的表達(dá)情況。

1. 6 Western blotting法檢測不同缺氧時(shí)間宮頸癌細(xì)胞中 HIF-1α和 Gli1及干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平

用含苯甲基磺酰氟 （phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF） 的RIPA 緩沖液裂解腫瘤細(xì)胞檢測缺氧0、24 和48 h 條件下Gli1、HIF-1α、Sox2 和β-actin 的蛋白表達(dá)水平。10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）凝膠分離相同數(shù)量的蛋白， 電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用5% 脫脂牛奶在室溫條件下封閉2 h，然后與Gli1、HIF-1α 和Sox2 蛋白及β-actin 抗體孵育 2 h。 二抗孵育 2 h 后， 使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL） 試劑盒顯影。使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 7 球體形成實(shí)驗(yàn)檢測球體形成能力

SiHa細(xì)胞在常氧或缺氧環(huán)境下用含有20 μ g·L－ 1 EGF ，10 μg·L－1 bFGF 和2%B27 的無血清DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)。2 周后用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和大小，根據(jù)計(jì)數(shù)直徑≥100 μm 的腫瘤球體數(shù)， 代表球體形成能力。

1. 8 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析（Gene ExpressionProfiling Interactive Analysis，GEPIA）網(wǎng) 站 分 析Gli1表達(dá)水平和宮頸癌患者生存率及干細(xì)胞標(biāo)志物關(guān)系

利用GEPIA網(wǎng)站分析癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas， TCGA） 數(shù)據(jù)庫中Gli1 表達(dá)水平與宮頸癌患者生存率的關(guān)系，以及其與干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2、Sox9、LSD1、CD44 和OCT4 的相關(guān)關(guān)系。

1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 25. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組織化學(xué)法和 Western blotting法的量化結(jié)果符合正態(tài)分布且方差齊性， 以x±s表示，2 組 間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。采用Spearman 相關(guān)性分析進(jìn)行相關(guān)性分析。Kaplan-Meier 法測定總生存率（overall survival rate， OS）， 并采用Log-rank 進(jìn)行比較。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 正常組織

CIN組織和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Gli1 蛋白表達(dá) 觀察 Gli1 蛋白在宮頸正常組織、CIN 組織及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：Gli1 蛋白在正常組織和CIN 組織中主要表達(dá)于胞質(zhì)，在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中主要表達(dá)于胞核和胞質(zhì)（圖1）。與正常組織比較， CIN Ⅲ 級組織和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Gli1 蛋白陽性表達(dá)率升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）（表2）。

2. 2 Gli1蛋白表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Gli1 蛋白表達(dá)與患者年齡和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)（Pgt;0. 05）（表3）。生物信息庫GEPIA 分析結(jié)果顯示：高表達(dá)Gli1 蛋白的宮頸癌患者生存率明顯低于低表達(dá)Gli1 蛋白患者（Plt;0. 05）（圖2）， 表明高表達(dá)Glil 蛋白的宮頸癌患者預(yù)后不良。

2. 3 宮頸癌組織中Gli1與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的相關(guān)性

宮頸癌組織中 Gli1蛋白表達(dá)與 Sox2的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0. 176， Plt;0. 05）； 與Sox9、CD44、OCT4 （POU5F1） 和LSD1（KDM1A） 表達(dá)無相關(guān)性（圖3 和表4）。GEPIA分析結(jié)果顯示： 宮頸癌組織中Gli1 mRNA 表達(dá)水平與Sox2 的mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（Plt;0. 05）， 而與Sox9、CD44、OCT4 和LSD1 的mRNA 表達(dá)水平無相關(guān)性（Pgt;0. 05）（圖4）。

2. 4 不同缺氧時(shí)間宮頸癌細(xì)胞中 HIF-1α、Gli1和干細(xì)胞標(biāo)志物 mRNA 及蛋白表達(dá)水平

缺氧 24 h時(shí)SiHa 細(xì)胞中HIF-1α 和Gli1 及干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2、Sox9、CD44、OCT4 和LSD1 的mRNA 表達(dá)水平隨時(shí)間的延長而遞增。缺氧48 h 時(shí) HIF-1α、Gli1 和Sox2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平較缺氧0 h 組明顯升高（Plt;0. 001）。見圖5 和6。

2. 5 常氧/缺氧條件下 SiHa腫瘤球體的數(shù)量

球體形成實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示：缺氧條件下SiHa 細(xì)胞球體的形成數(shù)量較常氧狀態(tài)下明顯增多（Plt;0. 001）（圖7）。

2. 6 宮頸癌組織中Gli1蛋白表達(dá)與HIF-1α、Sox2、Sox9、CD44 和 OCT4 表達(dá)的關(guān)系

缺氧 48 h 時(shí)SiHa 細(xì)胞中HIF-1α 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平較缺氧0 h 組明顯升高（Plt;0. 001）。宮頸癌組織中HIF-1α 陽性表達(dá)率與Gli1 蛋白（63. 0%， 58/92；r=0. 374， Plt;0. 001） 及干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2（80. 0%， 44/55； r=0. 294， Plt;0. 001）、Sox9（72. 9%， 35/48； r=0. 216， P=0. 016）、CD44（68. 3%，56/82；r=0. 189，P=0. 029） 和OCT4（71. 9%，46/64；r=0. 248，P=0. 005） 表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。見表5 和6。

3 討 論

全球95% 宮頸癌是由人乳頭瘤病毒（heliumpressure vessel， HPV） 感染引起的［15］， 宮頸癌患者中有50% 以上存在HPV16 型感染［1］。研究［16-17］表 明：Hh 信 號 通 路 分 子 中 音 猥 因 子 （sonichedgehog，Shh） 和Gli1 蛋白的表達(dá)與HPV16 型感染密切相關(guān)。Gli1 蛋白是Hh 信號傳導(dǎo)的主要效應(yīng)因子，其中Gli1 作為一種轉(zhuǎn)錄活性很高的激活因子常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16］。當(dāng)Gli1 異?；罨瘯r(shí)，常與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖分化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良相關(guān)［18-20］。Gli1 作為促癌基因在許多類型的癌癥中高表達(dá)， 如非小細(xì)胞肺癌、胃癌、胰腺癌和結(jié)腸癌［21-22］。何燁等［23］ 研究發(fā)現(xiàn)：Gli1 在宮頸癌中高表達(dá)并與TNM 分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)，而與年齡無關(guān)。本研究結(jié)果顯示：Gli1 蛋白在CIN Ⅲ和宮頸癌組織中高表達(dá)， 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GEPIA 分析結(jié)果顯示：Gli1 蛋白高表達(dá)的宮頸癌患者與較差的生存率密切相關(guān)，表明Gli1 可能是判定宮頸癌患者不良預(yù)后的有效指標(biāo)。

宮頸癌的復(fù)發(fā)率為35%，腫瘤復(fù)發(fā)與CSCs 較高的化療耐藥性、DNA 修復(fù)和自我更新能力等密切相關(guān)［24］。因此，研究宮頸癌CSCs 是了解腫瘤生長、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的必要步驟。CSCs 是一群具有較強(qiáng)自我更新能力和侵襲遷移能力的細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有著至關(guān)重要作用。本課題組先后研究了Gli1 在乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌中與干性特征基因的相關(guān)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)各種腫瘤組織中Gli1蛋白表達(dá)與干性特征標(biāo)志物表達(dá)均存在密切關(guān)聯(lián)［5，10-14］。本研究結(jié)果顯示：宮頸癌組織中Gli1 蛋白表達(dá)與Sox2 呈正相關(guān)關(guān)系，表明Gli1 蛋白也是腫瘤干細(xì)胞的一種標(biāo)志物。

HIF-1 轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)癌癥中CSC 的形成和擴(kuò)增［25］。球體形成能力是CSCs 體外鑒定的一個(gè)重要方法，其判斷的是單個(gè)細(xì)胞在合適的條件培養(yǎng)基中自我更新的能力，成球的大小及數(shù)目是衡量腫瘤細(xì)胞干性的金標(biāo)準(zhǔn)［25］。本研究結(jié)果顯示： 缺氧狀態(tài)提高了宮頸癌細(xì)胞的球體形成能力，增加了宮頸癌細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2、Sox9、CD44、OCT4 和LSD1 mRNA 表達(dá)水平，并且隨著缺氧時(shí)間的延長SiHa 細(xì)胞中Gli1 和Sox2 的蛋白表達(dá)水平也升高。因此，在缺氧狀態(tài)下Gli1 可能通過Sox2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞具有干性特征，但Gli1 調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在宮頸癌中Gli1 與干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)以及患者的生存率密切相關(guān)，并且缺氧狀態(tài)促進(jìn)Gli1 和Sox2 的表達(dá)。因此，Gli1 在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后判定中起重要作用。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：朱長吉負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施及論文撰寫，劉興哲負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施，玄延花負(fù)責(zé)論文的整體設(shè)計(jì)。

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[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82160594）