［摘 要］ 目的：探討叉頭框轉錄因子O1（FOXO1） 基因對腹主動脈瘤 （AAA） 血管平滑肌細胞自噬和凋亡的影響，闡明其可能的作用機制。方法：收集19例AAA患者動脈瘤組織（AAA組）及鄰近正常主動脈組織（對照組），采用實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測2 組研究對象動脈瘤組織中FOXO1 mRNA 表達水平， 透射電鏡觀察2 組研究對象動脈瘤組織中自噬溶酶體形成情況；Western blotting 法檢測2 組研究對象動脈瘤組織中FOXO1 及自噬相關蛋白卷曲螺旋肌球蛋白樣B 細胞淋巴瘤2 （Bcl-2） 結合蛋白（Beclin1）、微管相關蛋白1 輕鏈3 α （LC3） 和P62 蛋白表達水平。體外培養(yǎng)人主動脈血管平滑肌細胞（hVSMCs），并采用FOXO1 siRNA （si-FOXO1） 及其陰性對照（si-NC）慢病毒感染hVSMCs，10 μmol·L－1血管緊張素Ⅱ （Ang Ⅱ） 聯(lián)合自噬激活劑雷帕霉素（Rap） 進行干預，將細胞分為空白對照組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+si-NC 組、Ang Ⅱ+si-FOXO1 組、Ang Ⅱ+si-NC+Rap 組和Ang Ⅱ+si-FOXO1+Rap 組。CCK-8 法檢測各組細胞增殖活性，流式細胞術檢測各組細胞凋亡水平，ELISA 法檢測各組細胞上清中基質金屬蛋白酶2 （MMP-2） 和基質金屬蛋白酶9 （MMP-9）水平， RT-qPCR 法檢測各組細胞中FOXO1 mRNA 表達水平， Western blotting 法檢測各組細胞中FOXO1、Bcl-2、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 （Cleavedcaspase-3）、Beclin1、LC3 和 P62 蛋白表達水平。結果：與對照組比較，AAA 組動脈瘤組織中FOXO1 mRNA 表達水平升高（Plt;0. 05），自噬溶酶體數(shù)量增多（Plt;0. 05），Beclin1 蛋白表達水平和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ 比值升高（Plt;0. 05）， P62 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）。與空白對照組比較，Ang Ⅱ 組hVSMCs 增殖活性降低（Plt;0. 05）， 細胞凋亡率升高（Plt;0. 05）， 細胞上清中MMP-2 和MMP-9 水平升高（Plt;0. 05）， 細胞中Bax、Cleaved caspase-3 和Beclin1 蛋白表達水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高（Plt;0. 05），Bcl-2 和P62 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）；與Ang Ⅱ+si-NC 組比較，Ang Ⅱ+si-FOXO1 組hVSMCs 增殖活性升高（Plt;0. 05），細胞凋亡率降低（Plt;0. 05），細胞上清中MMP-2 和MMP-9 水平降低（Plt;0. 05）， 細胞中Bax、Cleaved-caspase-3 和Beclin1 蛋白表達水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ 比值降低（Plt;0. 05）， Bcl-2 和P62 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05）。與Ang Ⅱ+si-FOXO1 組比較，Ang Ⅱ+si-FOXO1+Rap 組細胞凋亡率升高（Plt;0. 05），細胞上清中MMP-2 和MMP-9 水平升高（Plt;0. 05），細胞中Beclin1 蛋白表達水平和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值降低（Plt;0. 05），P62蛋白表達水平升高 （Plt;0. 05）。結論：FOXO1基因沉默可能通過降低自噬水平來提高Ang Ⅱ暴露下hVSMCs 增殖活性，并抑制其凋亡，從而參與AAA 的發(fā)病。

［關鍵詞］ 腹主動脈瘤； 人血管平滑肌細胞； 叉頭框轉錄因子O1； 自噬； 細胞凋亡

［中圖分類號］ R732. 2 ［文獻標志碼］ A

腹主動脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA） 是常見的慢性主動脈退行性疾病， 具有高發(fā)病率和高病死率， 是導致65 歲以上老年人死亡的一個主要原因［1-2］。隨著我國人口老齡化嚴重以及整體壽命延長，AAA 發(fā)病率逐年升高，且瘤體一旦發(fā)生破裂其死亡率高達90%， 嚴重危害中老年人生命健康［3］。目前尚無明確有效藥物防治AAA， 故臨床廣泛采用外科手術和血管修復治療AAA，但仍存在瘤體破裂導致患者死亡的風險［4］。因此，闡明AAA 的潛在分子機制十分迫切。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs） 是血管壁的重要組成部分，其增殖抑制、凋亡促進和細胞外基質（extracellular matrix，ECM） 降解是促進AAA 發(fā)生發(fā)展的關鍵因素［5］。叉頭框轉錄因子O1 （forkhead box transcriptionfactor O1， FOXO1） 是人體內(nèi)重要的轉錄調控因子， 屬于叉頭框轉錄因子 （forkhead boxtranscription factor，F(xiàn)OX） 家族的重要成員，參與調節(jié)機體葡萄糖代謝、脂質代謝、氧化應激、凋亡、自噬和內(nèi)質網(wǎng)應激等多種生物學過程［6］。劉嬌等［7］ 研究結果顯示： 小檗堿可通過沉默信息調節(jié)因子1 （silent information regulator 1， SIRT1） /FOXO1 通路介導的凋亡與自噬抑制卵巢顆粒細胞。WANG 等［8］ 研究結果顯示： FOXO1 在氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL） 處理的VSMCs 中表達下調，其過表達可逆轉ox-LDL 對VSMCs 增殖的促進作用。WAN等［9］ 研究顯示： FOXO1 與AAA 密切相關， 且對AAA 有潛在的診斷價值，但具體作用機制尚不明確。因此，本研究通過檢測AAA 組織及鄰近正常主動脈組織中FOXO1 表達水平，并采用血管緊張素Ⅱ （angiotensin Ⅱ ， Ang Ⅱ） 誘導VSMCs 建立體外腹主動脈瘤細胞模型， 探討FOXO1 基因沉默對Ang Ⅱ 暴露下VSMCs 增殖和凋亡的影響及其作用機制，以期為AAA 的治療和藥物開發(fā)提供新的靶點。

1 資料與方法

1. 1 一般資料

選取 2020年 4月—2022年 5月在本院經(jīng)手術切除的19 例AAA 患者的腹主動脈組織（AAA 組） 及鄰近正常主動脈組織（對照組，距離腫瘤邊緣2～3 cm），其中男性14 例，女性5 例，年齡（67. 1±4. 6） 歲。本研究獲得本院倫理委員會批準，倫理批號：201901005，術前均告知患者并簽署知情同意書。

1. 2 細胞、主要試劑和儀器

人主動脈血管平滑肌細胞（human vascular smooth muscle cells，hVSMCs） 及配套專用培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司。胰蛋白酶購自美國Gibco 公司，Ang Ⅱ 和雷帕霉素（rapamycin， Rap） 購自美國MCE 公司， si-FOXO1 （靶序列： 5′-CAATTCGTCATAATCTGTCCCTACA-3′） 及其陰性對照si-NC （靶序列： 5′-CAATGCTACTAAGTCCCTTCTTACA-3′） 慢病毒購自上海吉瑪制藥技術有限公司，含DPAI 抗熒光淬滅封片液、CCK-8 細胞增殖與細胞毒性檢測試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒和BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司， 基質金屬蛋白酶（matrix metallo-protein，MMP）-2 和MMP-9 ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR （real-timequantitative fluorescence PCR， RT-qPCR） 試劑盒購自日本TaKaRa 公司； FOXO1 抗體、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA） 抗體、B 細胞淋巴瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2） 抗體、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Cleaved-caspase-3） 抗體、卷曲螺旋肌球蛋白樣Bcl-2 結合蛋白（coiled-coil myosin-like Bcl-2interacting protein， Beclin-1） 抗體、微管相關蛋白1 輕鏈3α （microtubule-associated proteins lightchain 3α，LC3）、死骨片1 （sequestosome 1，P62）和GAPDH 抗體購自美國Affinity 公司， FITC-HRP 標記的山羊抗兔二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司。超凈工作臺（型號：SW-CJ-2D） 購自蘇州凈化設備有限公司，熒光定量PCR 儀（型號：LEIA-X4） 購自山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，酶標分析儀（型號： AMR-100） 購自杭州奧盛儀器有限公司， 流式細胞儀（型號： NovoCyte 2040R）購自美國ACEA 公司， 倒置熒光顯微鏡（型號：XD-202） 購自南京江南永新光學有限公司， 透射電子顯微鏡（型號： HITACHI HT7800） 購自日本日立公司。

1. 3 細胞培養(yǎng)

采 用 配 套 專 用 培 養(yǎng) 基 培 養(yǎng)hVSMCs，置于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長密度達90% 時， 使用胰蛋白酶進行消化傳代處理。hVSMCs 專用培養(yǎng)基成分： Ham’s F-12K+0. 05 g·L－1 維生素C+0. 01 g·L－1 胰島素+ 0. 01 g·L－ 1 轉鐵蛋白+10 μ g·L － 1 亞硒酸鈉+ 0. 03 g·L－1 內(nèi)皮細胞生長補充劑ECGs+10% 胎牛血清+10 mmol·L－1 4- （2-羥乙基） 哌嗪-1-乙磺酸［4- （2-hydroxyethyl） -1-piperazineethanesulfonicacid，HEPES］ 緩沖液+10 mmol·L－1 N-三（羥甲基） 甲基-2- 氨基乙烷磺酸［N-tris（hydroxymethyl） methyl-2-aminoethanesulfonicacid， TES］ 緩沖液+1% 雙抗。hVSMCs 無血清培養(yǎng)12 h 后，添加含10 μmol·L－1 Ang Ⅱ的培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱孵育48 h 建立體外AAA 細胞模型［10］，用于后續(xù)實驗。

1. 4 免疫熒光法鑒定 hVSMCs

取對數(shù)生長期hVSMCs， 以每孔1×105 個細胞密度接種至24 孔細胞培養(yǎng)板中， 過夜， 取出培養(yǎng)板去除培養(yǎng)基，PBS 緩沖液清洗1 次， 4% 多聚甲醛室溫固定10 min，PBS緩沖液清洗3次，加入0. 2% Triton X-100室溫通透10 min， PBS 緩沖液清洗3 次， 加入5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入一抗α-SMA 抗體（1∶ 200）， 4 ℃ 孵育過夜， PBS 緩沖液清洗3 次，加入FITC 標記的山羊抗兔二抗（1∶ 200）， 室溫孵育1 h， PBS 緩沖液清洗3 次， 加入DAPI 緩沖液，室溫孵育10 min。采用熒光顯微鏡觀察細胞熒光染色情況，α-SMA 陽性表達為hVSMCs。

1. 5 細 胞 轉 染 及 分 組 處 理

取 對 數(shù) 生 長 期hVSMCs，以每孔5×105 個細胞的密度接種至6 孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜。次日，更換新鮮完全培養(yǎng)基， 以病毒感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI） 為200 加入si-FOXO1 及其陰性對照si-NC慢病毒， 18 h 后更換新鮮完全培養(yǎng)基， 72 h 后采用RT-qPCR 法和Western blotting 法檢測感染效率， 收集細胞進行后續(xù)實驗。采用CCK-8 法、流式細胞術和Western blotting 法檢測hVSMCs 增殖、凋亡及自噬，實驗分組：空白對照組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ + si-NC 組和Ang Ⅱ +si-FOXO1 組，10 μmol·L－1 Ang Ⅱ 干預各組細胞48 h。采用流式細胞術檢測hVSMCs 凋亡， 實驗分組： Ang Ⅱ+si-NC 組、Ang Ⅱ +si-FOXO1 組、Ang Ⅱ +si-NC+Rap 組和Ang Ⅱ +si-FOXO1+Rap 組，10 μmol·L－1 Ang Ⅱ和100 μg·L－ 1 Rap 干預各組細胞48 h［11］。

1. 6 CCK-8法檢測各組細胞存活率

取病毒感染后的對數(shù)生長期hVSMCs，以每孔2×103個細胞的密度接種至96 孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜， 處理細胞48 h，另設調零孔（只加培養(yǎng)基），提前2 h 取出培養(yǎng)板， 每孔加入10 μL CCK-8 溶液， 置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，采用酶標儀檢測450 nm 處吸光度（A） 值。細胞存活率= （實驗組A 值－調零組A 值） / （對照組A 值－調零組A 值） ×100%。

1. 7 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

取病毒感染后的對數(shù)生長期hVSMCs，以每孔5×105個細胞密度接種至6 孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，處理細胞48 h。收集各組細胞，PBS 緩沖液清洗1 次，加入200 μL PBS 緩沖液重懸細胞， 加入5 μL AnnexinV-FITC 染液， 輕吹混勻， 加入5 μL PI 染液， 輕吹混勻，4 ℃避光20 min，上機檢測。

1. 8 ELISA法檢測各組hVSMCs培養(yǎng)上清中基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）水平

取病毒感染后的對數(shù)生長期hVSMCs，以每孔5×105 個細胞的密度接種至6 孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，處理細胞48 h。收集各組細胞上清，4 ℃、1 000 g 離心20 min，取上清嚴格按照ELISA 試劑盒說明書步驟進行實驗操作， 酶標儀在450 nm 處檢測各組樣本A 值，繪制標準曲線， 并根據(jù)標準曲線計算各組樣本中MMP-2 和MMP-9 水平。

1. 9 RT-qPCR 法檢測動脈瘤組織及各組細胞中FOXO1 mRNA 表達水平

收集 AAA 組織和鄰近正常主動脈組織及處理后的各組細胞， 采用TRIzol 法提取組織（勻漿儀充分研磨） 和細胞中總RNA， 并采用紫外分光光度計檢測RNA 的濃度。 采用 RT-qPCR 試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA， 之后進行RT-qPCR 反應， 反應條件：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火25 s，70 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，F(xiàn)OXO1 上游引物： 5′-AGGGTTAGTGAGCAGGTTACAC-3′， FOXO1 下游引物： 5′-TGCTGCCAAGTCTGACGAAA-3′； GAPDH 上游引物：5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′， GAPDH下游引物： 5′-GCCCAATACGACCAAATCAGAG-3′。采用2－△△Ct 法計算各組細胞中FOXO1mRNA 表達水平。

1. 10 Western blotting 法檢測動脈瘤組織和各組細 胞 中 FOXO1、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Beclin1、LC-3及 P62蛋白表達水平

收集 AAA 組織及鄰近正常主動脈組織以及處理后的各組細胞，加入裂解液冰上提取組織（勻漿儀充分研磨） 和細胞中總蛋白，使用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。每組樣本取30 μg 蛋白上樣，行電泳、轉膜、封閉處理， 加入FOXO1 抗體（1∶ 1 000）、Bcl-2抗體（1∶1 000）、Bax 抗體（1∶1 000）、Cleavedcaspase-3 抗體（ 1 ∶ 1 000）、Beclin1 抗體（1∶1 000）、LC-3 抗體（1 ∶ 1 000）、P62 抗體（1∶1 000） 和GAPDH 抗體（1∶ 5 000）， 4 ℃ 孵育過夜，TBST 清洗3 次，加入HRP 標記的山羊抗兔二抗（1∶2 000） 室溫孵育2 h，TBST 清洗3 次，滴加ECL 顯影液， 采用凝膠成像儀曝光采集圖像；采用Image J 軟件分析條帶灰度值， 以GAPDH 為內(nèi)參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值。

1. 11 透射電鏡觀察動脈瘤組織超微形態(tài)表現(xiàn)

將AAA 組織及鄰近正常主動脈組織修切體積為1 mm3， 固定在2. 5% 戊二醛中1 h， 然后使用1%四氧化鋨進行處理， 脫水并包埋至Durcupan 水溶性包埋樹脂中，將樣品切成厚度為60 nm 薄片，安裝于銅格柵上， 用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，通過電子顯微鏡觀察樣品形態(tài)結構。

1. 12 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。AAA 組織中FOXO1 mRNA 和蛋白表達水平，各組細胞存活率和凋亡率，細胞上清中MMP-2 和MMP-9 水平，細胞中FOXO1 mRNA 表達水平及FOXO1、Bcl-2、Cleaved-caspase-3、Beclin1、LC-3 和P62 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2. 1 動脈瘤組織中FOXO1 mRNA表達水平、動脈瘤組織超微形態(tài)表現(xiàn)及動脈組織中FOXO1和自噬相關蛋白表達水平

RT-qPCR 法檢測結果顯示：與對照組（0. 94±0. 25） 比較， AAA 組患者動脈瘤組織中FOXO1 mRNA 表達水平（3. 79±1. 09）升高（Plt;0. 05），見圖1。透射電子顯微鏡檢測結果顯示：與對照組比較，AAA 組患者動脈瘤組織中自噬溶酶體形成數(shù)量增多， 見圖2。Westernblotting 法檢測結果顯示：與對照組比較，AAA 組患者動脈瘤組織中FOXO1 和Beclin1 蛋白表達水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高（Plt;0. 05），P62 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05），見圖3。

2. 2 hVSMCs鑒定及感染效率驗證

免疫熒光法檢測結果顯示： α-SMA 呈陽性表達， 提示細胞鑒定為hVSMCs， 見圖4。RT-qPCR 法和Westernblotting 法檢測結果顯示： 與空白對照組比較，si-NC 組hVSMCs 細胞中FOXO1 mRNA 和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）；與si-NC 組比較， si-FOXO1 組細胞中FOXO1 mRNA 和蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 05），見圖5 和6。

2. 3 各組hVSMCs存活率和細胞凋亡率

CCK-8法檢測結果顯示： 與空白對照組（100. 00%±2. 12%） 比較， Ang Ⅱ 組 hVSMCs 增殖率（55. 12%±6. 28%） 降低（Plt;0. 05）；與Ang Ⅱ組比 較， Ang Ⅱ +si-NC 組 hVSMCs 增 殖 率（57. 24%±5. 36%） 差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）； 與Ang Ⅱ +si-NC 組比較， Ang Ⅱ +si-FOXO1 組hVSMCs 增殖率（90. 03%±3. 21%）升高（Plt;0. 05）。流式細胞術檢測結果顯示： 與空白對照組比較， Ang Ⅱ 組hVSMCs 凋亡率升高（Plt;0. 05）； 與Ang Ⅱ 組比較， Ang Ⅱ +si-NC 組hVSMCs 凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）；與Ang Ⅱ +si-NC 組比較， Ang Ⅱ +si-FOXO1 組hVSMCs 凋亡率降低（Plt;0. 05）。見圖7 和8。

2. 4 各組 hVSMCs培養(yǎng)上清中 MMP-2和 MMP-9水平

ELISA 法檢測結果顯示：與空白對照組比較， Ang Ⅱ 組hVSMCs 上清中MMP-2 和MMP-9水平升高（Plt;0. 05）；與Ang Ⅱ組比較，Ang Ⅱ+si-NC 組hVSMCs 上清中MMP-2 和MMP-9 水平差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）；與Ang Ⅱ+si-NC 組比較，Ang Ⅱ+si-FOXO1組hVSMCs上清中MMP-2和MMP-9 水平降低（Plt;0. 05）。見表1。

2. 5 各組hVSMCs中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Beclin1、LC-3 和 P62蛋白表達水平

Westernblotting 法檢測結果顯示： 與空白對照組比較，Ang Ⅱ組hVSMCs 中Bcl-2 和P62 蛋白表達水平降低 （Plt;0. 05）， 而 Bax、 Cleaved caspase-3 和Beclin1 蛋白表達水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ 比值升高（Plt;0. 05）；與 Ang Ⅱ 組比較，Ang Ⅱ+si-NC 組hVSMCs 中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Beclin1 和P62 蛋白表達水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）； 與Ang Ⅱ+si-NC 組比較， Ang Ⅱ +si-FOXO1 組hVSMCs 中Bcl-2 和P62 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05）， 而Bax、Cleaved caspase-3 和Beclin1 蛋白表達水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值降低（Plt;0. 05）。見圖9。

2. 6 誘導自噬后各組hVSMCs中Beclin1、LC-3和P62 蛋白表達水平

Western blotting 法檢測結果顯示：與 Ang Ⅱ + si-NC 組 比 較， Ang Ⅱ + si-FOXO1 組hVSMCs 中Beclin1 蛋白表達水平和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值降低（Plt;0. 05）， P62 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05）， Ang Ⅱ +si-NC+Rap 組hVSMCs 中Beclin1 蛋白表達水平和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高（Plt;0. 05），P62 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）； 與Ang Ⅱ +si-FOXO1 組比較，Ang Ⅱ +si-FOXO1+Rap 組hVSMCs 中Beclin1蛋白表達水平和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ 比值降低（Plt;0. 05）， P62 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05）。見圖10。

2. 7 誘導自噬后各組hVSMCs凋亡率

流式細胞術檢測結果顯示：與Ang Ⅱ+si-NC 組比較，AngⅡ +si-FOXO1 組hVSMCs 凋亡率降低（Plt;0. 05），Ang Ⅱ+si-NC+Rap 組hVSMCs 凋亡率升高（Plt;0. 05）； 與Ang Ⅱ +si-FOXO1 組比較，Ang Ⅱ +si-FOXO1+Rap 組hVSMCs 凋亡率升高（Plt;0. 05）。見圖11 和12。

2. 8 誘導自噬后各組hVSMCs培養(yǎng)上清中MMP-2和 MMP-9 水平

ELISA 法 檢 測 結 果 顯 示：與Ang Ⅱ +si-NC 組比較， Ang Ⅱ +si-FOXO1 組hVSMCs 上清中MMP-2 和MMP-9 水平降低（Plt;0. 05）， Ang Ⅱ +si-NC+Rap 組hVSMCs 上清中MMP-2 和MMP-9 水平升高（Plt;0. 05）； 與Ang Ⅱ+si-FOXO1 組比較，Ang Ⅱ+si-FOXO1+Rap 組hVSMCs 上清中MMP-2 和MMP-9 水平升高（Plt;0. 05）。見表2。

3 討 論

Ang Ⅱ是一種血管收縮劑，是腎素/血管緊張素系統(tǒng)的主要生物活性肽，是目前化學誘導AAA最常用的造模方式。體內(nèi)輸注Ang Ⅱ可模擬AAA的炎癥發(fā)生過程，能夠促進腎上腺主動脈擴張、動脈粥樣硬化、巨噬細胞蓄積以及血栓形成。此外，體外應用Ang Ⅱ刺激VSMCs 可誘導細胞自噬，抑制細胞增殖并促進細胞凋亡和ECM 降解，可以用于模擬AAA 平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMC） 損傷［12-13］。AAA 是一種進行性主動脈擴張性疾病，其發(fā)病率占所有動脈瘤的第1 位，其主要病理特征為ECM 降解和血管壁中層收縮型SMC 減少［14］。VSMCs 作為主動脈血管壁的主要細胞成分之一，對維持主動脈結構和功能起著重要作用，其凋亡與AAA 發(fā)生發(fā)展密切相關。

近年來研究［15-16］ 發(fā)現(xiàn)： FOXO1 與Bcl-2 相互作用介導細胞死亡， 可促進Bax/Bcl-2 比值升高，從而發(fā)揮促進細胞凋亡的作用。ZHANG 等［17］ 研究發(fā)現(xiàn)： 沉默F(xiàn)OXO1 可抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲， 并促進細胞凋亡。FOXO1 和Cleaved caspase-3 表達下調與肺動脈平滑肌細胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs） 的過度增殖和細胞凋亡抵抗關系密切，上調兩者表達可通過抑制細胞周期進程和促進細胞凋亡來抑制PASMCs 增殖， 從而減輕實驗性肺動脈高壓［18］。 因此， FOXO1 可能成為靶向治療AAA 的潛在靶點。本研究結果顯示：與對照組比較，AAA 組患者動脈瘤組織中FOXO1 高表達，推測FOXO1 異常高表達可能促進AAA 發(fā)展， 明確其作用機制有利于為AAA 的治療提供新的方向。

自噬是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性降解途徑， 也是細胞維持生存的一種重要機制。自噬是一種不同于凋亡的新的程序性死亡方式，一方面適度自噬激活可清除受損的細胞器和異常蛋白，防止蛋白聚集，從而對細胞起保護作用；另一方面過度自噬可誘導細胞自噬性死亡，并與凋亡信號存在交互作用。研究［19-20］ 表明： 自噬在AAA 的形成過程中起著關鍵作用。杜亞豪等［21］ 研究發(fā)現(xiàn)：AAA 血管平滑肌細胞中自噬和凋亡水平均升高。SALMON 等［22］ 研究發(fā)現(xiàn)：AAA 形成過程中會激活主動脈瘤VSMCs 中的自噬相關基因。GUO 等［23］ 研究顯示：自噬相關蛋白在AAA 患者中表達水平升高，自噬基因Atg7 在Ang Ⅱ處理的VSMCs 中表達水平升高，其過表達可抑制VSMCs增殖并誘導細胞凋亡和自噬。本研究結果顯示：與對照組比較，AAA 組患者動脈瘤組織中FOXO1 表達和自噬水平升高。體外細胞實驗檢測結果顯示：Ang Ⅱ處理可抑制VSMCs 增殖，誘導細胞凋亡和自噬， 并上調MMP-2 和MMP-9 水平， 促進ECM降解， 提示Ang Ⅱ 干預可促進AAA 發(fā)展。但FOXO1 是否通過調控自噬參與VSMCs 凋亡進程尚未得到證實。本研究發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)OXO1 表達可促進Ang Ⅱ處理的VSMCs 增殖，抑制細胞凋亡、自噬和ECM 降解，提示FOXO1 可能是調控AAA 發(fā)展的關鍵基因。進一步研究結果發(fā)現(xiàn)：自噬激動劑Rap 處理后，可逆轉FOXO1 基因沉默對Ang Ⅱ處理的hVSMCs 凋亡抑制作用。由此推斷，F(xiàn)OXO1可能通過促進自噬誘導AAA 血管平滑肌細胞凋亡，其可能為AAA 的效應靶點之一。

綜上所述，F(xiàn)OXO1 在AAA 組織高表達，沉默F(xiàn)OXO1 基因可能通過降低自噬水平來提高Ang Ⅱ暴露下hVSMCs 增殖活性， 并抑制其凋亡， 從而參與AAA 的發(fā)病。本研究為AAA 的防治和藥物開發(fā)提供了一種潛在的有效靶點，但仍存在一些不足：實驗僅從細胞層面探討了FOXO1 通過調控自噬參與VSMCs 細胞增殖凋亡過程，本課題組后續(xù)將從動物層面入手，深入探討體內(nèi)FOXO1 與AAA的關系。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：王琳茹和胡文賢負責論文的整體設計，張晶負責論文的撰寫，趙冬嬋和王晉軍負責論文的統(tǒng)計學分析。

[參考文獻]

［1］ NAGNOSTAKOS J， LAL B K. Abdominal aorticaneurysms［J］. Prog Cardiovasc Dis， 2021， 65： 34-43.

［2］ CALGI M P， MCNEIL J S. Abdominal aorticaneurysms （etiology ， epidemiology ， and naturalhistory）［J］. Anesthesiol Clin， 2022， 40（4）： 657-669.

［3］ 韓曉峰， 郭 曦， 劉光銳， 等. 腹主動脈瘤發(fā)病機制研究進展［J］. 心肺血管病雜志， 2016， 35（10）：817-820.

［4］ SCHANZER A， ODERICH G S. Management ofabdominal aortic aneurysms［J］. N Engl J Med， 2021，385（18）： 1690-1698.

［5］ ROMBOUTS K B， VAN MERRIENBOER T A R，KET J C F， et al. The role of vascular smooth musclecells in the development of aortic aneurysms anddissections［J］. Eur J Clin Invest， 2022， 52（4）： e13697.

［6］ XING Y Q， LI A， YANG Y， et al. The regulation ofFOXO1 and its role in disease progression［J］. Life Sci，2018， 93： 124-131.

［7］ 劉 姣， 楊 陽， 何悅雙， 等. 基于SIRT1/FoxO1通路探究小檗堿抑制卵巢顆粒細胞凋亡與自噬的調節(jié)機制［J］. 中國實驗方劑學雜志， 2023， 29（6）： 79-87.

［8］ WANG Q Y， YANG X， ZHOU X， et al. MiR-3174promotes proliferation and inhibits apoptosis by targetingFOXO1 in hepatocellular carcinoma ［J］. BiochemBiophys Res Commun， 2020， 526（4）： 889-897.

［9］ WAN L， HUANG J Y， NI H Z， et al. Screening keygenes for abdominal aortic aneurysm based on geneexpression omnibus dataset ［J］. BMC CardiovascDisord， 2018， 18（1）： 34.

［10］ZHANG Z D， ZOU G Q， CHEN X S， et al.Knockdown of lncRNA PVT1 inhibits vascular smoothmuscle cell apoptosis and extracellular matrix disruptionin a murine abdominal aortic aneurysm model［J］. MolCells， 2019， 42（3）： 218-227.

［11］李 丹， 楊 鵬， 滕紅麗， 等. 27nt-miRNA通過靶向哺乳動物雷帕霉素靶蛋白調控血管平滑肌細胞凋亡及其分子機制研究［J］.中國循環(huán)雜志，2020，35（4）：401-407.

［12］MONDACA-RUFF D，RIQUELME J A，QUIROGA C，et al. Angiotensin Ⅱ -regulated autophagy is required forvascular smooth muscle cell hypertrophy ［J］. FrontPharmacol， 2019，9： 1553.

［13］GUO J J， WANG Z， XUE M， et al. Metforminprotects against abdominal aortic aneurysm by Atg7-induced autophagy［J］. Adv Clin Exp Med，2022，31（1）：59-69.

［14］張江鋒， 覃 曉. 腹主動脈瘤發(fā)病機制的研究［J］. 廣西醫(yī)科大學學報， 2020， 37（2）： 309-314.

［15］NING N， ZHANG S， WU Q， et al. Inhibition ofacylglycerol kinase sensitizes DLBCL to venetoclax viaupregulation of FOXO1-mediated BCL-2 expression［J］.Theranostics， 2022， 12（12）： 5537-5550.

［16］姜靖雯， 陳學武， 羅榮城， 等. 三氟拉嗪激活FOXO1相關的Bax/Bcl-2信號通道誘導肝癌細胞凋亡［J］. 中國藥學雜志， 2019， 54（11）： 886-893.

［17］ZHANG L L， LIANG B， XU H， et al. Cinobufagininduces FOXO1-regulated apoptosis， proliferation，migration， and invasion by inhibiting G9a in non-smallcelllung cancer A549 cells［J］. J Ethnopharmacol，2022， 291： 115095.

［18］LI B B， TENG C， YU H L， et al. Alleviatingexperimental pulmonary hypertension via co-deliveringFoxO1 stimulus and apoptosis activator tohyperproliferating pulmonary arteries［J］. Acta PharmSin B， 2023， 13（6）： 2369-2382.

［19］RAMADAN A， AL-OMRAN M， VERMA S. Theputative role of autophagy in the pathogenesis ofabdominal aortic aneurysms［J］. Atherosclerosis， 2017，257： 288-296.

［20］WANG L， LIU S， PAN B H， et al. The role ofautophagy in abdominal aortic aneurysm： protective butdysfunctiona［l J］. Cell Cycle， 2020， 19（21）： 2749-2759.

［21］杜亞豪， 鄭月宏， 田 翠， 等. 腹主動脈瘤血管平滑肌細胞凋亡和自噬研究［J］. 中華老年多器官疾病雜志，2010， 9（3）： 217-221.

［22］SALMON M， SPINOSA M， ZEHNER Z E， et al.Klf4， Klf2， and Zfp148 activate autophagy-related genesin smooth muscle cells during aortic aneurysmformation［J］. Physiol Rep， 2019， 7（8）： e14058.

［23］GUO J， WANG Z， XUE M， et al. Metformin protectsagainst abdominal aortic aneurysm by Atg7-inducedautophagy［J］. Adv Clin Exp Med， 2022， 31（1）： 59-69.

[基金項目] 國家自然科學基金項目（82172095）；山東省科技廳自然科學基金項目（ZR2022ME083）；山東省衛(wèi)健委中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目（2019-WJZD045）；山東省衛(wèi)健委醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展項目（202104130109）