［摘 要］ 目的：探討呼吸道與非呼吸道標本分離耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 （MRSA） 的耐藥性、分子分型和生物膜形成能力的差異。方法：選取住院患者送檢標本中分離出的 100 株 MRSA，其中50 株MRSA 分離自呼吸道標本，50 株MRSA 分離自非呼吸道標本。對100 株MRSA 進行14 種抗菌藥物的體外藥敏試驗，采用多位點序列分型（MLST） 和金黃色葡萄球菌A 蛋白（Spa） 分型方法進行分子分型，結晶紫染色實驗檢測MRSA菌株生物膜形成能力。結果：體外藥敏試驗，100株MRSA對青霉素、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、莫西沙星和四環(huán)素的總體耐藥率較高，均大于60. 0%，對復方新諾明耐藥率僅為9. 0%，且所有菌株均對萬古霉素、利奈唑胺、替加環(huán)素和奎奴普丁/達福普汀敏感。呼吸道標本分離的MRSA 對莫西沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率明顯高于非呼吸道標本分離株（Plt;0. 05）。100 株MRSA 中共檢出17 種基因型，其中優(yōu)勢型別為ST5-t2460 型（26. 0%）、ST239-t030 型（23. 0%） 和 ST59-t437 型（20. 0%）。呼吸道標本分離MRSA 中優(yōu)勢型別為ST5-t2460 型（20. 0%） 和ST239-t030 型（13. 0%）， 其次為ST59-t437 型（7. 0%）； 非呼吸道標本分離MRSA 中共檢出13 種基因型， 優(yōu)勢型別為ST59-t437 型（13. 0%） 和ST239-t030 型（10. 0%）。100 株MRSA 全部為產膜菌株，強產膜菌株、中產膜菌株和弱產膜菌株比例分別為2. 0% （2/100）、24. 0% （24/100） 和74. 0% （74/100）。ST59-t437 型克隆株整體產膜能力較強，60. 0% （12/20） 為中產膜株和強產膜株。結論：呼吸道標本分離MRSA菌株整體耐藥率明顯高于非呼吸道標本分離MRSA 株。ST59-t437 基因型和ST239-t030 基因型為2 類標本共有優(yōu)勢克隆株，ST59-t437 型菌株呈現較強的生物膜形成能力，而ST239-t030 型菌株整體耐藥性最強。

［關鍵詞］ 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌； 耐藥性； 分子分型； 生物膜

［中圖分類號］ R378. 1 ［文獻標志碼］ A

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcus aureus， MRSA） 是一類常見的、可導致多種類型侵襲性感染的多重耐藥菌， MRSA 感染是導致住院患者病死率增高的一個重要原因［1-2］。2019 年，MRSA 的病原體-藥物組合造成10 萬多例抗生素耐藥性（anti-microbialresistance， AMR） 死亡， 造成沉重的社會和經濟負擔［3］。2021 年MRSA 住院患者分離率為30. 0%，是導致社區(qū)感染及醫(yī)院內感染的首位革蘭染色陽性球菌［4］。流行病學研究［5-7］ 顯示：特定地區(qū)及人群檢出MRSA 優(yōu)勢克隆株在發(fā)生動態(tài)改變， 不同基因型（ST239、ST59 和ST2460 型等） 常伴隨特定的耐藥特征和毒力特征（毒力特征和生物膜形成能力等）。既往研究［8］ 顯示：呼吸道分離菌株黏附力高于其他部位分離株，手術感染部位分離菌株生物膜形成能力更強，CC8 型菌株生物膜形成能力強于CC5 型菌株。國外相關研究［9-10］ 顯示：呼吸道與血液標本分離MRSA 在基因型方面也存在一定差異，呼吸道樣本分離MRSA 株以t003 型和t041 型為主，而血液標本分離MRSA 株僅以t003 型為主， 膿液標本分離MRSA 產膜株比例明顯高于痰液標本分離株，且2 類菌株耐藥性存在差異。呼吸道與非呼吸道無菌標本分離株在生物膜形成能力和耐藥性等方面的差異，與菌株遺傳背景及特定部位宿主環(huán)境特征（需氧環(huán)境和微需氧環(huán)境） 有關 ［8］， 進而影響感染進程及預后。本研究以2012—2021 年內蒙古自治區(qū)呼和浩特地區(qū)住院患者分離的MRSA 臨床株為研究對象，探討呼吸道與非呼吸道標本分離MRSA 株的耐藥性及分子流行病學特征的差異，闡明不同部位標本分離MRSA 株的耐藥性及分子流行病學特征間的差異，以便更有針對性地指導臨床使用抗生素，有助于 MRSA 感染性疾病的防控和治療。

1 資料與方法

1. 1 菌株來源

收集2012年12月—2021年8月內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院就診患者臨床標本分離的100 株MRSA 菌株，剔除同一患者重復分離菌株，其中50 株MRSA 分離自呼吸道標本，50 株MRSA分離自非呼吸道標本。藥敏質控株糞腸球菌ATCC29212 和 金 黃 色 葡 萄 球 菌 ATCC29213均由內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科保存。

1. 2 試劑和主要儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）， MasterMix 和DNA Marker （大連TaKaRa 生物工程有限公司），VITEK- Ⅱ 全自動微生物分析系統(tǒng)及配套ASTGP67藥敏卡（法國梅里埃公司）； PCR 擴增儀（型號： Efficiency 96， 北京領宇科技有限公司），電泳儀（型號：PowerpacTM Basic，美國Bio-Rad 公司）， 凝膠成像分析系統(tǒng)（型號： Gel DocXR+ ，美國Bio-Rad 公司）， 培養(yǎng)箱（型號： IMH750-S，美國ThermoFisher Scientific 公司）。

1. 3 體外藥敏試驗

所有菌株均由 VITEK-Ⅱ全自動微生物分析儀進行菌種鑒定，利用AST-GP67藥敏卡檢測菌株抗菌藥物敏感性， 結果參照CLSIM100-S31 文件［11］ 規(guī)定判讀標準進行抗菌藥物敏感性判讀 。

1. 4 DNA提取

將菌株接種于營養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，挑取足量的菌落重懸于無菌的生理鹽水中，按照細菌DNA 提取試劑盒說明書進行DNA提取，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 5 多 位 點 序 列 分 型（multiocus sequencetyping，MLST）

DNA 提取流程如“1. 4” 所述。7 個管家基因 （arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL） 引物由北京中美泰和生物技術有限公司合成， 引物序列參照金黃色葡萄球菌MLST 數據庫（https：//pubmlst. org/saureus）。PCR 擴 增 產 物送 北京中美泰和生物技術有限公司進行測序。將測序結果上傳到金黃色葡萄球菌 MLST 數據庫進行在線分析，獲取每個菌株７個管家基因的等位基因編號，根據等位基因編號得出序列型（sequencetype，ST）。

1. 6 金 黃 色 葡 萄 球 菌 A 蛋 白（Staphylococalprotein A，Spa）分型

根據參考文獻 ［4］ 合成引物， PCR 產物純化后由北京中美泰和生物技術有限公司完成測序， 測序結果通過Spa 分型數據庫（http：//www. ridom. de/spaserver）， 參照已公布的重復序列，根據重復序列出現的次數和排列方式得到 Spa 分型。

1. 7 結晶紫染色實驗檢測 100株 MRSA菌株的生物膜形成能力

待測菌株在含 0. 25% 葡萄糖的TSB 液中37 ℃ 過夜培養(yǎng)， 調整菌液濃度為McFarland 等級0. 5 濃度（約1. 5×108 CFU·mL－1），并在含0. 25% 葡萄糖的TSB 中稀釋至最終濃度為1×106 CFU·mL－1， 置于96 孔細胞培養(yǎng)板中37 ℃培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液并用0. 9% 氯化鈉輕輕洗滌3 次， 并用甲醇固定 15 min。風干后， 將孔用0. 1% 結晶紫染色5 min， 再用無菌PBS 緩沖液洗滌3 次， 自然風干， 隨后于33% 冰乙酸中作用30 min，590 nm 波長處測定培養(yǎng)孔中溶液的吸光度（A） 值， 重復3 次， 計算其平均值。 以未接種菌的培養(yǎng)液作為陰性對照，A 值反映生物膜與接觸表面黏附的牢固程度，依據臨界Ac 值（Ac 值是由空白孔的平均值加上其3 倍的標準差），可將生物被膜分成4 類： A≤Ac 為不產膜（0）， Ac4Ac 為強產膜（＋＋＋）。

1. 8 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 16. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。呼吸道和非呼吸道標本分離的MRSA 株耐藥率以百分率（%） 表示，2 組間耐藥率比較采用χ2 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2. 1 呼吸道和非呼吸道標本分離MRSA 菌株對常用抗菌藥物的耐藥率

呼吸道和非呼吸道標本分離的MRSA 除了對利奈唑胺、萬古霉素、替加環(huán)素、奎奴普丁/達福普汀和青霉素耐藥率一致外，對其他抗菌藥物的耐藥率均存在不同程度的差異，呼吸道標本分離的MRSA 株對莫西沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率明顯高于非呼吸道標本分離MRSA 株（Plt;0. 05）； 呼吸道標本分離的MRSA 菌株對紅霉素、克林霉素和利福平的耐藥率略高于非呼吸道標本分離MRSA 株，但差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）； 呼吸道標本分離的MRSA 菌株對復方新諾明的耐藥率略低于非呼吸道標本分離的MRSA 株， 但差異無統(tǒng)計意義（Pgt;0. 05）。見表1。

2. 2 呼吸道與非呼吸道標本分離 MRSA 菌株MLST 分型

在 100 株 MRSA 中發(fā)現了 10 種 ST型，優(yōu)勢型別為ST5 型、ST59 型和ST239 型，占比為26. 0%、25. 0% 和25. 0%，其余依次為ST22型（12. 0%）、 ST25 型 （6. 0%）、 ST5939 型（2. 0%）、 ST398 型 （1. 0%）、 ST5637 型（1. 0%）、 ST5662 型 （1. 0%） 和 ST1 型（1. 0%）。 呼吸道標本分離的 MRSA 中發(fā)現8 種ST 型，優(yōu)勢型別為ST5 型和ST239 型，占比分別為20. 0% 和15. 0%， 其次為ST59 型（8. 0%）、ST25 型（2. 0%）、ST5939 型（2. 0%）、ST22 型（1. 0%）、ST398 型（1. 0%） 和ST1 型（1. 0%）；非呼吸道標本分離的MRSA 中發(fā)現7 種ST 型，優(yōu)勢型別為ST59， 占比為17. 0%， 其次為ST22 型（11. 0%）、ST239 型（10. 0%）、ST5 型（6. 0%）、ST25 型 （4. 0%）、 ST5637 型 （1. 0%） 和ST5662 型（1. 0%）。見表2。

2. 3 呼吸道和非呼吸道標本分離MRSA 菌株Spa分型

在100株MRSA中共檢出16種Spa 基因型，其中優(yōu)勢型別為 t2460 型、t030 型和t437 型，占比分別為42. 0%、23. 0% 和20. 0%。呼吸道標本分離的MRSA 中共檢出9 種Spa 基因型，優(yōu)勢型別為t 2 4 6 0 型， 占比為2 3 . 0 %， 其次為t 0 3 0 型（13. 0%）、 t437 型（7. 0%）、 t078 型（2. 0%）、t1493 型（1. 0%）、 t034 型（1. 0%）、 t4239 型（1. 0%）、t005 型（1. 0%） 和t127 型（1. 0%）；非呼吸道標本分離的MRSA 中共檢出11 種Spa 基因型， 分布較分散， 優(yōu)勢型別為t437 型和t030 型，占比分別為13. 0% 和10. 0%， 其次為t2460 型（9. 0%）、 t005 型（8. 0%）、 t078 型（3. 0%）、t309 型（2. 0%）、 t3590 型（1. 0%）、 t441 型（1. 0%）、 t7496 型（1. 0%）、t 258 型（1. 0%） 和t3622 型（1. 0%）。見表2。

2. 4 呼吸道與非呼吸道標本分離MRSA 菌株不同基因型的聯合分析

100株MRSA中有17種型別，其中優(yōu)勢型別為ST5-t2460 型、ST239-t030 型和ST59-t437 型， 占比分別為26. 0%、23. 0% 和20. 0%， 其次為ST22-t005 型（9. 0%） 和ST25-t078 型（5. 0%）。呼吸道標本分離的MRSA 中共檢出10 種型別， 優(yōu)勢型別為ST5-t2460 型和ST239-t030 型， 占比分別為20. 0% 和13. 0%， 其次為ST59-t437 型（7. 0%）；非呼吸道標本分離的MRSA 中共檢出13 種型別，分布較分散，優(yōu)勢型別為ST59-t437 型和ST239-t030 型， 占比分別為13. 0% 和10. 0%， 其次為ST22-t005 型（8. 0%）和ST5-t2460 型（6. 0%）。見表2。

2. 5 呼吸道與非呼吸道標本分離MRSA 菌株生物膜形成能力檢測

100株MRSA全部為產膜株，生物膜形成能力通過結晶紫染色結果進行鑒別，分為強產膜（＋＋＋）、中產膜（＋＋） 和弱產膜（+） 3 個等級，見圖1。強產膜菌株、中產膜菌株和弱產膜菌株分別有2 株（2. 0%）、24 株（24. 0%） 和74 株（74. 0%）。50 株生物膜陽性分離自呼吸道標本的MRSA 菌株中1 株（2. 0%） 為強產膜菌株，10 株（20. 0%） 為中產膜菌株， 39 株（78. 0%）為弱產膜菌株。50 株分離自非呼吸道標本的MRSA 菌株中， 強產膜菌株、中產膜菌株和弱產膜菌株分別為1 株（2. 0%）、14 株（28. 0%） 和35 株（70. 0%）。 呼吸道與非呼吸道標本分離MRSA 株的3 種產膜株分布比例差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）。不同基因型的聯合分析結果顯示：20 株 ST59-t437 克隆菌株中有2 株為強產膜株，10 株為中產膜株，60. 0% （12/20） 為中等以上產膜株，產膜能力較強。見表2。

2. 6 優(yōu)勢基因型 MRSA 菌株耐藥特征

100 株MRSA 株中共篩選出3 種優(yōu)勢基因型， 分別是ST5-t2460 型（占比26. 0%）、ST239-t030 型（占比23. 0%） 和ST59-t437 型（占比20. 0%）。對3 種優(yōu)勢基因型菌株進行8 種抗生素耐藥特征分析，結果顯示： ST239-t030 型菌株耐藥最為嚴重， 對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、莫西沙星、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、慶大霉素和利福平耐藥率均在69. 0% 以上；ST5-t2460 型菌株對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、莫西沙星、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素和慶大霉素耐藥率均在53. 0% 以上， 僅對利福平敏感性較好。以上2 種基因型于呼吸道與非呼吸道分離標本的MSRA 中的分布比例差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）。ST59-t437 型菌株總體耐藥性較低，僅有約50. 0% 菌株對紅霉素、克林霉素和四環(huán)素表現為耐藥，其他5 種抗生素耐藥率較低，呼吸道標本分離MRSA 菌株整體耐藥率高于非呼吸道標本分離株。見表3。

3 討 論

本研究結果顯示： MRSA 菌株對利奈唑胺、萬古霉素、替加環(huán)素和奎奴普丁/達福普汀均敏感，對紅霉素和克林霉素等9 種抗生素的耐藥率均高于全國平均水平［4］， MRSA 菌株耐藥情況存在明顯的地區(qū)差異， 應當引起重視。呼吸道標本分離的MRSA 株對紅霉素、克林霉素、利福平、莫西沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和慶大霉素耐藥率均高于非呼吸道標本分離的MRSA， 這與陳江華等［7］ 報道一致， 但復方新諾明耐藥率呈相反趨勢， 可能與地域差異有關。MRSA 所致下呼吸道感染時，有效抗生素選擇范圍更小；在進行抗生素治療時，應優(yōu)先選擇利奈唑胺、萬古霉素、替加環(huán)素和奎奴普丁/達福普丁等敏感抗生素。

MRSA 菌株的分子分型特征因地理區(qū)域而異，并且分子分型與致病性、疾病嚴重程度和患者病死率有關［12-13］。除韓國和日本地區(qū)外，亞洲大部分地區(qū)最主要的流行克隆株曾是ST239 型［14-19］，進而演變?yōu)镾T59 型占據優(yōu)勢型別［20-21］。日本和韓國地區(qū)主要流行克隆型是ST5 型， 其是亞洲多個地區(qū)的優(yōu)勢克隆株［18，21］。本研究發(fā)現MRSA 株中，優(yōu)勢克隆株為ST5 型（26. 0%）、ST59 型（25. 0%）和ST239 型（25. 0%），與中國武漢和石家莊地區(qū)報道的MRSA 分子流行病學特征一致［22-23］。與該地區(qū)2012 年前研究結果比較， MRSA 株的優(yōu)勢克隆株由ST239 型演變?yōu)镾T5 型。呼吸道標本優(yōu)勢克隆株與非呼吸道標本相比也存在差異。在呼吸道標本分離MRSA 株中，ST239 型為第2 位優(yōu)勢克隆株， 而非吸道標本分離MRSA 株中， 優(yōu)勢型別為ST59 型（17. 0%） 和ST22 型（11. 0%）。這種差異可能與患者感染類型有關，非無菌部位菌株來源患者多為社區(qū)獲得性感染，而呼吸道標本分離株多來源于醫(yī)院內感染［24］。Spa 分型被廣泛用于研究不同地區(qū)金黃色葡萄球菌的爆發(fā)流行。 t037 型菌株是中國 MRSA 菌株中最常見的Spa 型［25］， 但是也有報道顯示t030 型已經在 MRSA 菌株中替代t037型菌株 ［26］。本研究Spa 分型結果顯示： 在100 株MRSA 菌株中共檢出16 種Spa 基因型， 其中優(yōu)勢型別為 t2460 型（42. 0%），這與LI 等［27］ 的報道一致。呼吸道標本分離的MRSA 株中共檢出9 種Spa基因型，優(yōu)勢型別為t2460 型（23. 0%），非呼吸道標本分離的MRSA 株中共檢出11 種基因型，優(yōu)勢型別為t437 型和t030 型， 占比分別為13. 0% 和10. 0%。表明MRSA 菌株的分子分型特征因時間和地理區(qū)域的改變而發(fā)生相應改變， 應進行動態(tài)監(jiān)測。

本研究中ST5-t2460 型（26. 0%）、ST239-t030 型（23. 0%） 和ST59-t437 型（20%） 是主要流行克隆株， 這與以往的研究報道［18］ 一致。MRSA 菌株的分子分型標本不同來源存在相應差異， 本研究中呼吸道標本來源的MRSA 株， 優(yōu)勢型別為ST5-t2460 型和ST239-t030 型， 其次為ST59-t437 型；非呼吸道標本來源的MRSA 株，優(yōu)勢型別為ST59-t437 型和ST239-t030 型， 其次為ST5-t2460 型和ST22-t005 型。優(yōu)勢基因型菌株進行耐藥性分析結果顯示：ST239-t030 型菌株對8 種抗生素耐藥最為嚴重， ST5-t2460 型菌株對7 種抗生素耐藥最為嚴重，但對利福平敏感性較好，與WANG 等［21］的相關報道一致?？紤]到單獨使用利福平治療MRSA 感染容易產生耐藥性， 建議在常規(guī)抗生素治療ST5-t2460 型菌株感染無效時，應考慮利福平聯合其他抗生素。ST59-t437 型菌株的耐藥性較差，其特征耐藥譜為紅霉素、克林霉素和四環(huán)素，這與李文婷等［28］的相關報道一致。對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素、莫西沙星和環(huán)丙沙星的多重耐藥可能是ST5-t2460 型及ST239-t030型成為優(yōu)勢型別的原因之一。ST5-t2460 優(yōu)勢克隆株的多重耐藥性、產生物膜能力及致死率高的特性，使其在醫(yī)院環(huán)境中更具競爭力［20］。

生物膜是一種具有獨特三維立體構造的細菌聚集群，該三維立體膜樣結構的獨特形態(tài)形成一道屏障， 使得臨床上所用的抗菌藥物難以穿透［29］， 致使產膜菌株可有效逃避抗菌藥物和機體防御系統(tǒng)的殺傷， 導致慢性遷徙性感染［30］。本研究中MRSA株均可產生生物膜，但呼吸道與非呼吸道標本分離的MRSA 的生物膜形成能力無明顯差異， 且強產膜株和中產膜株占比較小。但強產膜菌株和中產膜菌株主要集中分布在ST59-t437 克隆株中， 這與CHEN 等［26］ 相關報道一致。生物被膜的阻擋作用導致抗生素的穿透性降低，造成生物被膜內的有效抗菌濃度明顯降低［29］。ST59-t437 型菌株的強生物膜形成能力可能是其成為優(yōu)勢菌株且與抗生素耐藥特征存在關聯的原因之一。

綜上所述， 本研究中MRSA 株對多種抗菌藥物呈現較高耐藥率，且均具有不同程度的生物膜形成能力。分離自不同部位的菌株在耐藥性和分子分型特征存在一定差異，對于重癥病例的臨床防控和治療，有必要結合其分子流行病學特點，制訂針對性的策略，防范其廣泛傳播和出現高致死率。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：額爾德木圖負責體外藥敏試驗、生物膜實驗和實驗數據的整理、統(tǒng)計分析及論文撰寫，王艷艷負責各項分子分型實驗，李喻瞳輔助完成體外藥敏試驗，陳貴林負責論文的撰寫和修改，王俊瑞負責實驗設計和指導。

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[基金項目] 國家自然科學基金項目（81660352）；內蒙古自治區(qū)科技廳自然科學基金面上項目（2020MS08110）；內蒙古醫(yī)科大學大學生科技創(chuàng)新“英才培育”項目（YCPY2021068）；內蒙古醫(yī)科大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（202110132038）