［摘 要］ 目的：探討非小細(xì)胞肺癌 （NSCLC） A549細(xì)胞基因不穩(wěn)定性和MYC基因突變在吉西他濱耐藥中的作用，并闡明其作用機(jī)制。方法：采用2 mg·L－1吉西他濱持續(xù)作用A549 細(xì)胞（A549 組），構(gòu)建耐藥細(xì)胞株A549R （A549R 組），并將si-NC 和si-MYC 轉(zhuǎn)染至A549R 細(xì)胞，作為si-NC A549R 組和si-MYC A549R 組。采用CCK-8 法檢測不同濃度（0、1、2、4、8、16 和32 mg·L－1） 吉西他濱對各組細(xì)胞的抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq） 和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 信號通路富集分析A549 組及A549R 組細(xì)胞中的差異表達(dá)基因，實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測A549 組和A549R 組細(xì)胞中基因組不穩(wěn)定性相關(guān)基因錯配修復(fù)基因2（MSH2）、錯配修復(fù)基因6 （MSH6） 和DNA 修復(fù)蛋白RAD50 （RAD50） 的表達(dá)水平， Westernblotting 法檢測基因組不穩(wěn)定性相關(guān)蛋白MYC 原癌基因（MYC） 和磷酸化組蛋白（γH2AX） 的表達(dá)水平，染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP） 法檢測RNA polⅡ和γH2AX 在MYC 基因上的富集程度，PCR 法擴(kuò)增并檢測A549R細(xì)胞MYC基因突變情況。結(jié)果：與A549組比較，2、4、8、16和32 mg·L－1 吉西他濱作用后A549R 組細(xì)胞抑制率降低（Plt;0. 05），8 mg·L－1吉西他濱作用后細(xì)胞凋亡率降低（Plt;0. 05）。與A549 組比較，A549R 組細(xì)胞中有234 個mRNAs 表達(dá)水平升高，205 個mRNAs 表達(dá)水平降低，其中錯配修復(fù)相關(guān)基因（MSH2 和MSH6）、RAD50 和MYC 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）。KEGG 信號通路富集分析，表達(dá)水平升高基因主要參與非同源末端連接、mRNA 監(jiān)測途徑和DNA 復(fù)制等信號通路。與A549 組比較，A549R組細(xì)胞中MYC和γH2AX蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）。ChIP 法檢測，RNA pol Ⅱ和γH2AX 在MYC 轉(zhuǎn)錄起始位點及exon 2 上富集程度增加，MYC exon 2 上存在G254A 基因突變。與si-NC A549R 組比較， si-MYC A549R 組細(xì)胞中MYC mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05），2、4、8、16和32 mg·L－1吉西他濱作用后si-MYC A549R 組細(xì)胞抑制率升高（Plt;0. 05），細(xì)胞凋亡率增加（Plt;0. 05）。結(jié)論：對吉西他濱耐藥的NSCLC細(xì)胞中A549R基因組不穩(wěn)定性增加，MYC基因發(fā)生突變和擴(kuò)增，而敲減MYC 可以恢復(fù)A549R 細(xì)胞對吉西他濱的敏感性。

［關(guān)鍵詞］ 吉西他濱； 癌，非小細(xì)胞肺； 基因組不穩(wěn)定性； MYC 擴(kuò)增； MYC 突變

［中圖分類號］ R734. 2 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

目前，肺癌是全球第二大常見癌癥，男性和女性的肺癌死亡率均超過20% ［1］。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC） 約占肺癌的85% ［2］，隨著全球人口增長、老齡化和生活方式的改變，NSCLC 的患病率不斷升高［3］。因此迫切需要提高NSCLC 的預(yù)防、診斷和治療水平。而抗腫瘤藥物耐藥性的產(chǎn)生是在臨床上影響癌癥患者預(yù)后的主要因素之一［4］。因此解決腫瘤耐藥性也是腫瘤治療的關(guān)鍵。吉西他濱是一種抗代謝藥物，廣泛應(yīng)用于乳腺癌、肺癌和胰腺癌的治療［5］。作為NSCLC 患者的首選治療方法，吉西他濱的化療耐藥性嚴(yán)重限制了其治療的有效性［6］。LIU 等［7］ 對胰腺癌的吉西他濱耐藥機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，結(jié)果表明：吉西他濱耐藥樣本顯示出高度的基因組不穩(wěn)定性，并且DNA 損傷程度較高。錢麒鈺等［8］ 研究發(fā)現(xiàn)：NSCLC 形成表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后可以增加其對吉西他濱的耐藥性。目前研究主要集中在NSCLC 吉西他濱耐藥細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性研究以及相關(guān)藥物對NSCLC 吉西他濱耐藥細(xì)胞的影響［9］，但腫瘤細(xì)胞對吉西他濱產(chǎn)生耐藥性的潛在機(jī)制仍不清楚。因此，本研究構(gòu)建吉西他濱的耐藥株，探討引發(fā)NSCLC 耐藥的可能機(jī)制，旨在為解決NSCLC對吉他西濱的耐藥性問題提供可能的靶點。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人 NSCLC 細(xì)胞株A549 購自上海復(fù)祥生物科技有限公司；吉西他濱購自北京沃凱生物科技有限公司，DMEM 培養(yǎng)基、蛋白酶 K、青霉素-鏈霉素和胰酶消化液購自武漢普諾賽生命科技有限公司， 胎牛血清購自美國Gibco 公司， AnnexinⅤ -FITC/PI 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司， NEXTflex Small 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA sequencing，RNA-Seq） Kit v3購自美國 PerkinElmer 公司， PrimeScript RT Kits逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和LipofectamineTM 2000 購自美國Invitrogen 公司， 染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatinimmunoprecipitation， ChIP） Assay Kit 購自美國Millipore 公司，si-NC、si-MYC 和CCK-8 試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司， 染色體組蛋白H2A 家族成員（γH2A histone family member X，γH2AX） 抗體、 GAPDH 抗體、 MYC 原癌基因（MYC proto-oncogene，MYC） 抗體和RNA pol Ⅱ抗體購自美國Abcam 公司，TRIzol 試劑和RIPA 裂解液購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；流式細(xì)胞儀 （型號： Attune CytPix） 和 酶 標(biāo) 儀 （型號：Multiskan SkyHigh） 購自美國Thermo 公司， 實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitativePCR，RT-qPCR） 儀（型號：OPENQPCR） 購自美國Chaibio 公司。

1. 2 細(xì)胞培養(yǎng)及吉西他濱耐藥細(xì)胞的制備

使用添加了10% 胎牛血清和1% 青霉素- 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)A549 細(xì)胞，細(xì)胞置于含有5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%時， 去掉培養(yǎng)基， 采用滅菌PBS 緩沖液清洗3 次后，使用胰酶消化液消化2 min，培養(yǎng)基終止消化，1 000 r·min－1 離心5 min 收集細(xì)胞后加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞， 傳代培養(yǎng)。不同濃度的吉西他濱培養(yǎng)A549 細(xì)胞1 周后， 2 mg·L－1 吉西他濱的培養(yǎng)基中大部分細(xì)胞死亡，將小部分活細(xì)胞轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)， A549 細(xì)胞持續(xù)給藥1 個月， 所得細(xì)胞命名為A549R，隨后與正常培養(yǎng)的A549 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)對比實驗。

1. 3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

將 A549R 細(xì)胞分為 si-NCA549R組和si-MYC A549R組。按照LipofectamineTM2000 說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。調(diào)整細(xì)胞數(shù)并接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使用不含抗生素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞生長密度達(dá)70%。制備si-MYC與脂質(zhì)體的復(fù)合物， 同時制備無干擾作用的si-RNA （si-NC） 與脂質(zhì)體復(fù)合物，將復(fù)合物分別加入si-NC A549R 組和si-MYC A549R 組的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板相應(yīng)孔內(nèi)，搖動混合，5～6 h 倒掉細(xì)胞培養(yǎng)基， PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞2 次， 更換為DMEM 培養(yǎng)基，24 h 后更換培養(yǎng)液，48 h 后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1. 4 CCK-8 法檢測 A549 和 A549R 細(xì)胞抑制率

取對數(shù)生長期A549 和A549R 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔5×104 個細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。分別給予0、1、2、4、8、16 和32 mg·L－1 吉西他濱處理24 h。結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處檢測吸光度（A） 值。細(xì)胞抑制率= （1－ 各濃度孔A 值/對照孔A 值） ×100%，分別繪制2 株細(xì)胞的濃度-抑制率曲線， 計算半數(shù)抑制濃度（half maximalinhibitory concentration， IC50）。細(xì)胞耐藥指數(shù)（resistance index， RI） = 實驗組IC50/對照組IC50。A549R 細(xì)胞反復(fù)凍存復(fù)蘇后，IC50 保持穩(wěn)定，表示A549R 細(xì)胞構(gòu)建成功。

1. 5 RNA-Seq 法 和 生 物 信 息 學(xué) 分 析 A549 和A549R 細(xì)胞中差異表達(dá)基因

TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA， 使用NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3將400 ng RNA 進(jìn)行16 個PCR 循環(huán)， 隨機(jī)制備成Small RNA-seq 文庫。在 Illumina 的 NextSeq 500系統(tǒng)中進(jìn)行文庫測序，并捕獲50 bp 單端讀數(shù)。以miRBase 20. 0 為參考， mirdeep2 和 srna-tools-cli 軟件用于獲取潛在miRNA 并繪制二級結(jié)構(gòu)［10］。使用Benjamini amp; Hochberg 方法調(diào)整P 值。默認(rèn)情況下，將校正的P 值0. 05 設(shè)置為顯著差異表達(dá)的閾值。使用京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址：https：//www. kegg. jp/kegg/kegg1. html）分析差異基因參與的信號通路。

1. 6 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549R組、si-NC A549R組和si-MYC A549R組細(xì)胞凋亡率

8 mg·L－1 吉西他濱處理各組細(xì)胞12 h，用預(yù)冷的PBS 緩沖液清洗2 次， 1 000 g 離心5 min， 收集細(xì)胞并重懸， 制成單細(xì)胞懸液后，分別加入5 μL AnnexinⅤ-FITC 和5 μL PI， 室溫（25 ℃） 避光孵育20 min， 隨后置于冰浴中。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，細(xì)胞凋亡率=AnnexinⅤ陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1. 7 RT-qPCR 法檢測各組細(xì)胞中錯配修復(fù)基因（mutS homology，MSH）2、MSH6、DNA 修復(fù)蛋白RAD50（recombinant DNA repair protein RAD50，RAD50）、MYC 原 癌 基 因 轉(zhuǎn) 錄 起 始 位 點（MYCproto-oncogene-transcriptional start site， MYCTSS）和 MYC 外 顯 子 2（MYC proto-oncogeneexon 2，MYC exon 2） mRNA 表 達(dá) 水 平

使 用TRIzol 法收集總細(xì)胞和組織RNA， 然后使用PrimeScript RT Kits 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 制備成cDNA。采用Mx3000P 實時PCR 系統(tǒng)進(jìn)行RTqPCR。RT-qPCR 反應(yīng)條件： 94 ℃ 、15 s，60 ℃、10 s，72 ℃、20 s，共40 個循環(huán)。采用2－ΔΔCt 法進(jìn)行數(shù) 據(jù) 分 析， 以 GAPDH 為 內(nèi) 參。 引 物 序 列：GAPDH 上游引物， 5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′，GAPDH 下游引物， 5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′； MSH2 上 游 引 物， 5′-ACCAGGAGGTGAGGAGGTTT-3′，MSH2 下游引 物， 5′-TTAAGGGCTCTGACTGCTGC-3′；MSH6 上游引物， 5′-CCCCACCAGTTGTGACTTCT-3′， MSH6 下游引物， 5′-TCTTCCGCTTTCGAGCAACT-3′； RAD50 上 游 引 物， 5′-GCAAGCAGATCGCCATCAAG-3′，RAD50 下游引 物， 5′-GGGAGTAAACTGCTGTGGCT-3′；MYC 上游引物， 5′-GCAATGCGTTGCTGGGTTAT-3′，MYC 下游引物，5′-TCCCTCCGTTCTTTTTCCCG-3′； MYC-TSS 上游引物， 5′-ATTCCAGCGAGAGGCAGAG-3′， MYC-TSS 下游引 物， 5′-CAAATGGGCAGAATAGCCTC-3′；MYC exon 2 上游引物， 5′-ATTCGAGCTGCTGCCCACCC-3′，MYC exon 2 下游引物，5′-GTCACCATCTCCAGCTGGTCG-3′。

1. 8 Western blotting法檢測各組細(xì)胞中 MYC 和γH2AX蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞分組處理后，預(yù)冷的PBS 緩沖液清洗3 次，RIPA 裂解液冰上裂解30 min， 收集各組細(xì)胞裂解物， 離心后收集上清液。BCA 蛋白定量試劑盒測定樣品蛋白質(zhì)濃度，加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液， 煮沸5 min， 于4 ℃條件下保存。依據(jù)蛋白質(zhì)濃度測定結(jié)果每孔上樣10 μg蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（恒壓200 V、45 min）后， 然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF 膜（恒流300 mA、60 min）。用含5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃ 孵育過夜， 1%TBST 洗膜8 min×3 次， 加入熒光標(biāo)記二抗室溫避光孵育1 h，1%TBST 洗膜8 min×3 次。加入ECL 顯色液顯色后曝光。采用Image J 軟件進(jìn)行條帶定量分析，計算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平= 目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值。

1. 9 ChIP 法檢測 RNA pol Ⅱ和 γH2AX 在 MYCTSS及 MYC exon 2 上的富集程度

使用 ChIPAssay Kit 進(jìn)行 ChIP 實驗。細(xì)胞在 100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)板中生長至 80% 匯合。使用含有 1% 甲醛的細(xì)胞培養(yǎng)基在室溫下進(jìn)行 10 min 的蛋白質(zhì)和 DNA 的交聯(lián)。通過超聲波將染色質(zhì)隨機(jī)切割為200～500 bp， 然后分別采用一抗（RNA pol Ⅱ 和γH2AX） 進(jìn)行孵育和免疫沉淀， 將瓊脂糖珠添加到反應(yīng)中以結(jié)合蛋白偶聯(lián)抗體，然后用新鮮制備的洗脫緩沖液（1% SDS 和0. 1 mol·L－1 NaHCO3）洗脫，然后在 45 ℃下加入蛋白酶 K 消化 1 h 逆轉(zhuǎn)交聯(lián)；將與之相結(jié)合的 DNA 片段進(jìn)行免疫沉淀，解交聯(lián)后純化目的DNA，對DNA 進(jìn)行qPCR 法檢測。

1. 10 A549 組和 A549R 組細(xì)胞 MYC 基因突變的檢測

提取A549組和A549R組細(xì)胞基因組，委托生工生物工程（上海） 股份有限公司對MYC 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及測序，測序結(jié)果通過SnapGene 軟件進(jìn)行比對。

1. 11 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 19. 0 統(tǒng)計軟件和GraphPad Prism 8. 0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析及繪圖。各組細(xì)胞凋亡率， MSH2、MSH6 和RAD50mRNA 表達(dá)水平， MYCH 和γH2AX 蛋白表達(dá)水平， RNA pol Ⅱ 和γH2AX 在MYC 基因上的富集程度均符合正態(tài)分布， 以x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 吉西他濱耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定

A549 和A549R 細(xì)胞的濃度-抑制率曲線見圖1。與A549 組比較，2、4、8、16 和32 mg·L－1 吉西他濱作用后，A549R 組細(xì)胞抑制率降低（Plt;0. 05）， 吉西他濱對A549 細(xì)胞和 A549R 細(xì)胞的 IC50 分別為10. 86 及21. 06 mg·L－1。A549R 的RI 為1. 93。使用8 mg·L－1吉西他濱作用細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率， 結(jié)果顯示： 與A549 組（12. 45%±1. 12%）比較， A549R 組（5. 59%±0. 87%） 細(xì)胞凋亡率降低（Plt;0. 05）。見圖2。

2. 2 A549 細(xì)胞和 A549R 細(xì)胞中差異表達(dá)基因

RNA-seq 法分析結(jié)果顯示： 與A549 組比較，A549R 組細(xì)胞中有234 個mRNA 表達(dá)水平升高，205 個mRNA 表達(dá)水平降低。見圖3A。KEGG 富集分析結(jié)果顯示：表達(dá)水平升高基因主要參與非同源末端連接、mRNA 監(jiān)測途徑和DNA 復(fù)制等信號通路。見圖3B。

2. 3 A549組和 A549R 組細(xì)胞中 MSH2、MSH6及RAD50 mRNA表達(dá)水平

RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示：與A549 組比較，A549R 組細(xì)胞MSH2、MSH6和RAD50 mRNA 表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）。見圖4。

2. 4 2 組細(xì)胞中 MYC 和 γH2AX 蛋白表達(dá)水平

Western blotting 法檢測結(jié)果顯示： 與A549 組比較， A549R 組細(xì)胞中MYC 和γH2AX 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）。見圖5。

2. 5 A549組和A549R組細(xì)胞MYC基因突變和擴(kuò)增情況

RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示：與A549組比較， A549R 組細(xì)胞MYC 基因表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）。見圖6A。ChIP 法檢測結(jié)果顯示：與A549 組比較， A549R 組細(xì)胞中RNA pol Ⅱ 和γH2AX 在MYC 轉(zhuǎn)錄起始位點及exon 2 上表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）。見圖6B。將MYC 基因PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行測序， 結(jié)果顯示： A549R 細(xì)胞原癌基因MYCexon 2 上存在G254A 基因突變。見圖6C。

2. 6 si-NC A549R 組和 si-MYC A549R 組細(xì)胞對吉 西 他 濱 的 耐 藥 性

RT-qPCR 法 和 Westernblotting 法檢測結(jié)果顯示：與si-NC A549R 組比較，si-MYC A549R 組細(xì)胞MYC mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）。見圖7。CCK-8 法檢測結(jié)果顯示：與 si-NC A549R 組比較， 2 、4 、8 、16 和32 mg·L－1 吉西他濱作用后， si-MYC A549R 組細(xì)胞抑制率升高（Plt;0. 05）。見圖8。流式細(xì)胞術(shù)檢測 結(jié) 果 顯 示： 與 si-NC A549R 組 （5. 68% ±0. 63%） 比 較， si-MYC A549R 組 （11. 37% ±0. 98%） 細(xì)胞凋亡率升高（Plt;0. 05）。見圖9。

3 討 論

聯(lián)合化療是臨床上癌癥治療的主要方法［11］，但長時間多次的藥物化療會增加癌細(xì)胞對藥物的耐藥性， 降低化療效果［12］。獲得性耐藥性是指腫瘤細(xì)胞與藥物反復(fù)接觸的過程中出現(xiàn)了耐藥性，使其對藥物的敏感性下降甚至消失［13］。腫瘤的耐藥性突變可以使癌細(xì)胞逃避某些藥物的抑制，適應(yīng)環(huán)境的變化來驅(qū)動腫瘤的生長。

吉西他濱是嘧啶類抗代謝藥物，屬于細(xì)胞周期特異性藥物，當(dāng)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，可被轉(zhuǎn)化為具有活性的吉西他濱磷酸鹽，進(jìn)而影響DNA 合成和修復(fù)， 從而抑制腫瘤細(xì)胞分裂， 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［14］。自 1996 年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration， FDA） 批準(zhǔn)以來，吉西他濱已廣泛應(yīng)用于治療各種實體瘤（乳腺癌、卵巢癌和肺癌等）［15］。吉西他濱在NSCLC 的一線治療中已取得良好的效果。然而長期治療患者會出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致化療的總有效率僅為20% 左右［16］。為了探討吉他西濱對NSCLC 基因組的影響，本研究應(yīng)用吉他西濱作用于A549 細(xì)胞， 結(jié)果顯示A549R 的RI 為1. 93，且與親本細(xì)胞株A549 細(xì)胞比較， 耐藥細(xì)胞株A549R 可拮抗由吉西他濱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡， 表明吉西他濱耐藥細(xì)胞株A549R 構(gòu)建成功?；蚪M不穩(wěn)定性包括點突變、染色體畸變、微衛(wèi)星DNA 不穩(wěn)定性和端粒異常，其存在于多種惡性腫瘤和癌前病變中，同時腫瘤的耐藥性也與基因組不穩(wěn)定性有關(guān)。DNA 錯配修復(fù) （mismatchrepair， MMR） 系統(tǒng)紊亂可降低基因組不穩(wěn)定性，誘發(fā)基因突變，MSH2/MSH6 是MMR 中的重要組成部分［17］，RAD50 是非同源末端連接修復(fù)過程中的關(guān)鍵分子， 非同源末端連接修復(fù)過程易引發(fā)DNA 突變。RAD50 在腫瘤組織中高表達(dá)，且參與腫瘤細(xì)胞對順鉑類藥物化療耐藥，與患者預(yù)后不良相關(guān)［18］。γH2AX 是DNA 雙鏈斷裂的標(biāo)志物， 表明腫瘤細(xì)胞和組織中存在基因組不穩(wěn)定性及端粒功能障礙［19］。RNA-seq 法檢測結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)： A549R 中參與非同源末端連接、mRNA 監(jiān)測途徑和DNA 復(fù)制等信號通路的基因表達(dá)上調(diào)。隨后的驗證實驗結(jié)果表明： 與 A549 組比較，A549R 組細(xì)胞中MSH2、MSH6 和RAD50 mRNA及γH2AX 的蛋白表達(dá)水平均升高，表明A549R 細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性增加，DNA 容易發(fā)生斷裂，且斷裂后的修復(fù)方式易引入基因突變，該機(jī)制可能參與吉西他濱化療耐藥過程。

MYC 作為一種原癌基因，是維持多種癌癥生長的多個細(xì)胞過程中的重要信號樞紐［20］。MYC 調(diào)節(jié)RNA 的表達(dá)，與腫瘤的中樞代謝途徑、細(xì)胞死亡、增殖、分化和應(yīng)激途徑相關(guān)［21］。Pol Ⅱ可通過與一系列轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì)相結(jié)合， 促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄［22］。本研究結(jié)果顯示：A549R 細(xì)胞中RNA pol Ⅱ在MYC-TSS 和MYC exon 2 上富集程度增加，MYC mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高， 而敲低MYC可恢復(fù)對吉西他濱的耐藥性，表明NSCLC 對吉西他濱產(chǎn)生耐藥性與MYC 的表達(dá)水平有關(guān)。γH2AX在MYC-TSS 和MYC exon 2 上富集程度增加，A549R 細(xì)胞MYC exon 2 上也存在G254A 基因突變， 表明吉西他濱耐藥NSCLC 細(xì)胞株中MYC 基因可能已發(fā)生DNA 斷裂和修復(fù)，并由此產(chǎn)生了基因突變。研究［23］ 顯示：G254A 基因型多態(tài)性與癌癥風(fēng)險增加顯著， 提示G254A 可能在吉西他濱誘導(dǎo)NSCLC 產(chǎn)生耐藥性中發(fā)揮重要作用，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本課題組發(fā)現(xiàn)吉西他濱耐藥細(xì)胞株基因組不穩(wěn)定性增加，MYC 基因存在突變和擴(kuò)增，而敲低MYC 恢復(fù)NSCLC 細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性。MYC 有望作為NSCLC 中與吉西他濱聯(lián)合用藥的新治療靶點，可為進(jìn)一步探討NSCLC 的耐藥機(jī)制提供新的思路。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：陳宗軍和陳亞紅負(fù)責(zé)論文的整體設(shè)計， 陳宗軍負(fù)責(zé)論文的撰寫，黃麗云和梁紫盈負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。

[參考文獻(xiàn)]

［1］ MILLER K D， FIDLER-BENAOUDIA M， KEEGANT H， et al. Cancer statistics for adolescents and youngadults，2020［J］.CA Cancer J Clin，2020，70（6）：443-459.

［2］ MOLINA J R， YANG P， CASSIVI S D， et al. Nonsmallcell lung cancer： epidemiology， risk factors，treatment， and survivorship［J］. Mayo Clin Proc， 2008，83（5）：584-594.

［3］ JONNA S， SUBRAMANIAM D S. Moleculardiagnostics and targeted therapies in non-small cell lungcancer （NSCLC）： an update［J］. Discov Med， 2019，27（148）：167-170.

［4］ NEGRI M， GENTILE A， ANGELIS C D， et al.Vitamin D-induced molecular mechanisms to potentiatecancer therapy and to reverse drug-resistance in cancercells［J］. Nutrients， 2020， 12（6）：1798.

［5］ WEI L， WEN J Y， CHEN J， et al. OncogenicADAM28 induces gemcitabine resistance and predicts apoor prognosis in pancreatic cancer ［J］. World JGastroenterol， 2019， 25（37）：5590-5603.

［6］ XIE X M， LEE J， LIU H， et al. Birinapant enhancesgemcitabine′s antitumor efficacy in triple-negative breastcancer by inducing intrinsic pathway-dependentapoptosis［J］. Mol Cancer Ther， 2021， 20（2）：296-306.

［7］ LIU K， GENG Y， WANG L， et al. Systematicexploration of the underlying mechanism of gemcitabineresistance in pancreatic adenocarcinoma［J］. Mol Oncol，2022， 16（16）：3034-3051.

［8］ 錢麒鈺，袁改利，馬珊珊，等.槲皮素通過miR-101/EZH2軸介導(dǎo)的EMT途徑改善NSCLC吉西他濱耐藥的機(jī)制研究［J］.天津醫(yī)藥，2022，50（2）：125-130.

［9］ 曲智鋒，徐 遠(yuǎn)，王 培.FTY720聯(lián)合吉西他濱對非小細(xì)胞肺癌腫瘤相關(guān)細(xì)胞株增殖和凋亡作用的研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2017，46（17）：2334-2336.

［10］LIN H， CHEN X N， PAN J N， et al. Secretion ofmiRNA-326-3p by senescent adipose exacerbatesmyocardial metabolism in diabetic mice［J］. J TranslMed， 2022， 20（1）：278.

［11］趙坤宇， 亓妍文， 秦國慧， 等. 中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值和淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞比值對PD-1抑制劑治療的晚期非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的預(yù)測價值［J］. 鄭州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）， 2022， 57（3）： 379-382.

［12］KIM M S， YANG S H， KIM M S. TRPML3 enhancesdrug resistance in non-small cell lung cancer cells bypromoting Ca2+-mediated lysosomal trafficking ［J］.Biochem Biophys Res Commun， 2022， 627：152-159.

［13］SZAKáCS G， PATERSON J K， LUDWIG J A， et al.Targeting multidrug resistance in cancer［J］. Nat RevDrug Discov， 2006， 5（3）：219-234.

［14］PARK J M， PENG J M， SHEN Y S， et al.Phosphomimetic Dicer S1016E triggers a switch toglutamine metabolism in gemcitabine-resistant pancreaticcancer［J］. Mol Metab， 2022， 65：101576.

［15］CHEN C， ZHAO S J， ZHAO X R， et al. Gemcitabineresistance of pancreatic cancer cells is mediated byIGF1R dependent upregulation of CD44 expression andisoform switching［J］. Cell Death Dis， 2022， 13（8）：682.

［16］TOSCHI L，F(xiàn)INOCCHIARO G，BARTOLINI S，et al.Role of gemcitabine in cancer therapy［J］. Future Oncol，2005， 1（1）：7-17.

［17］TUNG C L， CHIU H C， JIAN Y J， et al. Downregulationof MSH2 expression by an Hsp90 inhibitorenhances pemetrexed-induced cytotoxicity in human nonsmall-cell lung cancer cells［J］. Exp Cell Res， 2014，322（2）：345-354.

［18］SYED A， TAINER J A. The MRE11-RAD50-NBS1complex conducts the orchestration of damage signalingand outcomes to stress in DNA replication and repair［J］.Annu Rev Biochem， 2018， 87：263-294.

［19］KUO L J， YANG L X. Gamma-H2AX-a novelbiomarker for DNA double-strand breaks［J］. In Vivo，2008， 22（3）：305-309.

［20］WANG X F， ZHANG P H， DENG K. MYC promotesLDHA expression through microRNA-122-5p topotentiate glycolysis in hepatocellular carcinoma ［J］.Anal Cell Pathol（ Amst）， 2022， 2022：1435173.

［21］HINDS J W， FERIS E J， WILKINS O M， et al.S146L in MYC is a context-dependent activatingsubstitution in cancer development ［J］. PLoS One，2022，17（8）：e0272771.

［22］CHANG H W，F(xiàn)EOFANOV A V，LYUBITELEV A V，et al. N-terminal tails of histones H2A and H2Bdifferentially affect transcription by RNA polymerase Ⅱin vitro［J］. Cells， 2022， 11（16）：2475.

［23］MAO H J， CUI R F， WANG X C. Association analysisof selenoprotein S polymorphisms in Chinese Han withsusceptibility to gastric cancer［J］. Int J Clin Exp Med，2015， 8（7）：10993-10999.

[基金項目] 海南省衛(wèi)健委2021 年度海南省衛(wèi)生健康行業(yè)科研項目（21A200045）