［摘 要］ 目的：構(gòu)建負(fù)載間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體 （MSC-Exo） 和銀納米顆粒 （AgNPs） 抗菌水凝膠，初步探討該水凝膠的抗菌活性及促人表皮HaCaT 細(xì)胞增殖的效果，闡明其在皮膚損傷治療方面的應(yīng)用潛力。方法：利用氧化葡聚糖 （ODex） 和改性透明質(zhì)酸 （HA-ADH） 制備基礎(chǔ)水凝膠骨架，以十六烷基三甲基溴化銨（CTAB） 為穩(wěn)定劑制備AgNPs； 培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC） 獲取MSCExo。構(gòu)建AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠和MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠。通過BCA 法評(píng)估外泌體的負(fù)載率， 選用動(dòng)態(tài)光散射（DLS） 分析、Zeta 電位分析、紫外-可見分光光度計(jì)表征AgNPs 形貌、表面帶電情況和結(jié)構(gòu)，利用紅外光譜表征HA-ADH/ODex 水凝膠骨架的結(jié)構(gòu)組成，通過透射電子顯微鏡（TEM）、納米流式檢測儀和蛋白免疫印跡（Western blotting） 法對(duì)MSC-Exo 進(jìn)行鑒定，CCK-8 法檢測HA-ADH/ODex 水凝膠和AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠的細(xì)胞存活率及MSCExo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠對(duì)HaCaT 細(xì)胞的細(xì)胞增殖率的影響，平板涂布法和比濁法評(píng)估AgNP/HA-ADH/ODex水凝膠的抗菌活性。結(jié)果：DLS分析、Zeta電位分析和紫外分光光度計(jì)檢測，成功制備了粒徑大小均一、表面帶正電的AgNPs。紅外光譜檢測，HA-ADH/ODex 水凝膠制備成功。TEM、納米流式檢測和Western blotting 法驗(yàn)證MSC-Exo 成功提取，BCA 法證實(shí)在MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠中MSC-Exo 負(fù)載率為77. 8%。CCK-8 法檢測， 稀釋倍數(shù)為0、1、2、4、8、16、32 和64 的HA-ADH/ODex 水凝膠浸提液處理的HaCaT 細(xì)胞存活率接近100%。稀釋8 倍及以上的AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠浸提液處理的HaCaT 細(xì)胞存活率均大于85%。平板涂布法檢測，AgNP/HA-ADH/ODex 和MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠具有明顯的抗菌活性，其對(duì)金黃色葡萄球菌（S. aureus） 的抗菌率分別為（96. 44±0. 16） %和（96. 62±0. 16） %，對(duì)大腸桿菌（E. coli）的抗菌率分別為（95. 73±0. 28） %和（95. 58±0. 14） %。CCK-8法檢測，MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex水凝膠能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖率為（115. 00±7. 42）%。結(jié)論：MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠具有優(yōu)異的抗菌性能，能夠有效促進(jìn)人表皮HaCaT 細(xì)胞的增殖，可作為一種安全有效的生物敷料，用于皮膚創(chuàng)傷的治療。

［關(guān)鍵詞］ 透明質(zhì)酸； 葡聚糖； 銀納米顆粒； 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體； 皮膚創(chuàng)傷； 藥物遞送

［中圖分類號(hào)］ R751 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

皮膚創(chuàng)傷及其疾病進(jìn)展是全球主要公共衛(wèi)生問題之一，給患者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。在皮膚創(chuàng)傷的自我修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞等在傷口中遷移及增殖進(jìn)一步促進(jìn)傷口愈合［2］。目前，臨床皮膚創(chuàng)傷治療的主要措施為抗感染和促進(jìn)表皮細(xì)胞的修復(fù)［3］。銀納米顆粒（silvernanoparticles， AgNPs） 具有優(yōu)異的抗菌性能， 可導(dǎo)致細(xì)菌遺傳基因的結(jié)構(gòu)改變并阻斷其繁殖過程［4］。來源于間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stemcell，MSC） 的外泌體（exosome，Exo） 可以促進(jìn)創(chuàng)傷部位成纖維細(xì)胞的募集， 加速皮膚神經(jīng)再生［1，5］。因此聯(lián)合AgNPs 和MSC-Exo 治療皮膚創(chuàng)傷可能達(dá)到抗感染及促進(jìn)表皮修復(fù)的同步效果。但AgNPs 體內(nèi)給藥會(huì)在體內(nèi)沉積， 具有較大的生物毒性，而MSC-Exo 在體內(nèi)代謝快、半衰期短，這導(dǎo)致兩者全身給藥的效果差，在皮膚創(chuàng)傷治療應(yīng)用方面受到一定限制［6-7］。因此，局部給藥可能會(huì)提高兩者聯(lián)合治療皮膚創(chuàng)傷的效果。透明質(zhì)酸（hyaluronic acid， HA） 和葡聚糖（dextran， Dex）作為天然多糖化合物，以其為原料制備的HA/Dex水凝膠具有緩釋性和可降解性，且對(duì)人體具有優(yōu)異的生物相容性和安全性，可作為一種局部給藥的生物敷料［8-10］。但目前尚無將MSC-Exo 和AgNPs 與HA/Dex 水凝膠結(jié)合應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷治療的相關(guān)報(bào)道。本研究將HA 和Dex 改性以獲得改性透明質(zhì)酸（HA-ADH） 和氧化葡聚糖（oxidized Dex，ODex），以兩者為原料制備HA-ADH/ODex 水凝膠，再負(fù)載AgNPs 和MSC-Exo 構(gòu)建MSC-Exo@AgNP/HAADH/ODex 水凝膠， 并探討該水凝膠對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ， S. aureus） 和大腸桿菌（Escherichia coli， E. coli） 的抗菌活性及人表皮HaCaT 細(xì)胞的促增殖作用，為開發(fā)負(fù)載Exo 的新型水凝膠敷料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

HaCaT細(xì)胞和 MSC由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院消化病研究所保存；S. aureus （ATCC 25923） 和E. coli （ATCC 25922）由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部保存，Dex、HA、乙二醇、己二酰肼（adipic dihydrazide，ADH）、1-羥基苯并三唑（1-hydroxybenzotriazole，HOBt） 和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于上海麥克林科技有限公司，十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide， CTAB）購于北京百靈威科技有限公司， 硼氫化鈉（NaBH4）、硝酸銀（AgNO3） 和高碘酸鈉（NaIO4）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺［1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC］ 購于阿法埃莎（中國） 化學(xué)有限公司，氫氧化鈉和鹽酸購于廣州化學(xué)試劑廠， 0. 25% 胰蛋白酶、高糖杜氏改良培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM） 和DEME/F12 購于美國Gibco 公司， 胎牛血清（fetal bovine serum， FBS） 購自上海逍鵬生物科技有限公司， 磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）（1×，pH 值7. 4） 購自武漢塞維爾公司， 堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basicfibroblast growth factor，bFGF） 購于華中海威（北京） 基因科技有限公司，CCK-8 試劑盒購于生工生物工程（上海） 股份有限公司； 酶標(biāo)儀（型號(hào)：INFINIT 200 PRO） 購于德國BMG LABTECH 公司，納米流式檢測儀（型號(hào)：N30E） 購于廈門福流生物科技有限公司， 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope， TEM）（型號(hào)：HT7800） 購于日本株式會(huì)社日立制作所、動(dòng)態(tài)光散射儀（dynamic light scattering， DLS） 分析（型號(hào)： Zetasizer Nano ZSE） 購于英國馬爾文儀器有限公司，紅外光譜儀（型號(hào)：IS5） 購于美國賽默飛世爾科技公司， 紫外-可見分光光度計(jì)（型號(hào)：UV-7100） 購于日本島津公司。

1. 2 AgNPs 的制備

以 CTAB 為 穩(wěn) 定 劑 制 備AgNPs［11］。將60 mL 濃度為1 mmol·L－1 的 AgNO3溶液加入50 mL 濃度為1. 0 mmol·L－1 的 CTAB 溶液中，攪拌5 min。然后，滴加上述混合液至60 mL濃度為1. 0 mmol·L－1 NaBH4 溶液。將反應(yīng)混合物在磁力攪拌器上以800 r·min－1攪拌40 min，溶液顏色變成黃色說明生成了AgNPs。6 000 r·min－1離心去除含有過量CTAB 的上清液以得到AgNPs 溶液，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。使用紫?可見光分光光度計(jì)獲取AgNPs 溶液的紫外-可見光光譜。

1. 3 MSC-Exo 的 提 取 及 鑒 定

使 用 含 有 10%FBS 和10 mg·L－1 bFGF 的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并收集全部培養(yǎng)基，2 000 g離心30 min 收集上清液去除細(xì)胞碎片， 隨后10 000 g 離心45 min 去除較大囊泡，最后使用超速離心機(jī)在100 000 g 下離心75 min， 將離心管底部沉淀采用PBS 緩沖液重懸并收集至離心管中，并以同樣轉(zhuǎn)速超離濃縮得到MSC-Exo。通過蛋白免疫印跡（Western blotting） 法、TEM 和納米流式檢測儀鑒定MSC-Exo 的蛋白表達(dá)、形貌及粒徑。

1. 4 MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水 凝 膠構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn) ［12-13］ 制備 HA-ADH/ODex水凝膠。配制10% （W/V） Dex 水溶液， 加入2 mL NaIO4 溶液（100 g·L－1） 后， 室溫避光環(huán)境氧化反應(yīng)24 h。隨后， 將1. 5 mL 乙二醇溶液加入至Dex 反應(yīng)溶液中以終止氧化反應(yīng)。用纖維素透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量：7 000～12 000） 透析反應(yīng)溶液3 d， 然后將透析后溶液置入凍干機(jī)中凍干，獲得ODex 凍干品。

將800 mg ADH 加入25 mL 濃度為4 g·L－1 HA水溶液中，磁力攪拌約4 h 直至澄清，將pH 值調(diào)至4. 7。迅速將100 mg EDC 和132 mg HOBt 加入至2 mL DMSO 與超純水（V/V，1∶1） 的混合液并充分混勻溶解。將反應(yīng)液加入到HA 溶液中并調(diào)節(jié)pH 值至6. 8，反應(yīng)4～6 h，調(diào)節(jié)pH 值至7. 0。將反應(yīng)液用透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量： 3 500） 分別置于100 mmol·L－1 NaCl 溶液，25% 乙醇溶液和去離子水中各透析1 d， 每天更換3 次透析液。最后將反應(yīng)液置于凍干機(jī)中凍干， 獲得HA-ADH 凍干品。

將HA-ADH 與ODex 凍干品以1∶ 2 的比例混合振蕩混勻后凍干得到HA-ADH/ODex 水凝膠。使用紅外光譜儀分別獲取ODex、HA-ADH 和HAADH/ODex 凍干品的紅外光譜。分別將100 μLAgNPs以及100 μL MSC-Exo和AgNPs（V/V，1∶1）的混合溶液12 h 與1 mg HA-ADH/ODex 水凝膠支架混合孵育12 h 后獲得AgNP/HA-ADH/ODex 和MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠。

1. 5 BCA 法檢測 MSC-Exo在 HA-ADH/ODex水凝膠的負(fù)載率

通過BCA法檢測MSC-Exo蛋白濃度驗(yàn)證MSC-Exo 成功負(fù)載于HA-ADH/ODex 水凝膠上，并計(jì)算其負(fù)載率［14-15］。取500 μL MSC-Exo，使用BCA 試劑檢測MSC-Exo 原液蛋白濃度，稱取5 mg HA-ADH/ODex 水凝膠浸泡于MSC-Exo 溶液中12 h 直至水凝膠溶脹， 取出剩余溶液， 使用BCA 試劑檢測浸泡后剩余溶液的蛋白濃度。負(fù)載率= （MSC-Exo 原液蛋白濃度－ 剩余溶液蛋白濃度） /MSC-Exo 原液蛋白濃度×100%。

1. 6 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率

將HaCaT細(xì)胞加入含有完全培養(yǎng)基（含10% FBS 和100 g·L－1 青/鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基） 的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，置于37 ℃ 、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中。分別將1 mgHA-ADH/ODex 和AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠中加入含10% FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基浸泡12 h得到浸提液。將HaCaT 細(xì)胞以每孔8 000 個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 孵育24 h 棄去培養(yǎng)基， 將浸提液梯度稀釋0、1、2、4、8、16、32、64 和128 倍后， 加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中與細(xì)胞共培養(yǎng)12 h，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，采用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定吸光度（A） 值， 采用細(xì)胞存活率計(jì)算公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A 值－ 空白組A 值） / （陰性對(duì)照組A 值－空白組A 值） ×100%。實(shí)驗(yàn)組：含有細(xì)胞和CCK-8 的水凝膠浸提液溶液； 陰性對(duì)照組： 含有細(xì)胞和CCK-8 的培養(yǎng)基溶液； 空白組： 含有CCK-8 的培養(yǎng)基溶液。

1. 7 平板涂布法和比濁法檢測 AgNP/HA-ADH/ODex 和 MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水 凝膠的體外抗菌作用

通過檢測A值計(jì)算細(xì)菌的菌落數(shù)和抗菌率以研究AgNP/HA-ADH/ODex 及MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 對(duì)S. aureus 以及E. coli 的體外抗菌活性［16］。首先，將約1 mg 干燥水凝膠分別預(yù)浸泡在AgNPs 與AgNPs 和MSCExo（V/V，1∶1） 的混合溶液中12 h，然后將水凝膠分別浸入8 mL 濃度為1. 0×108 CFU·mL－1 的細(xì)菌懸浮液中， 在37 ℃下共孵育12 h 后使用酶標(biāo)儀在600 nm 處檢測A 值，從每組中取出100 μL 細(xì)菌溶液并稀釋至適宜濃度。取100 μL 稀釋后的細(xì)菌懸液均勻涂布在LB 瓊脂平板上。培養(yǎng)過夜后，對(duì)瓊脂平板上的細(xì)菌菌落拍照。以PBS 緩沖液處理的細(xì)菌懸液作為對(duì)照組。抗菌率= （無水凝膠處理組的A 值－水凝膠處理組的A 值） /無水凝膠處理組的A 值×100%。

1. 8 CCK-8 法檢測各組 HaCaT 細(xì)胞增殖率

將HaCaT 細(xì)胞加入含有完全培養(yǎng)基（含10% FBS 和100 g·L－1 青/鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基） 的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)， 置于37 ℃、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中。分別取適量HA-ADH/ODex 水凝膠、AgNP/HAADH/ODex 水凝膠和MSC-Exo@AgNP/HAADH/ODex 水凝膠， 各自加入含10% FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基浸泡12 h 得到粗提液。將HaCaT 細(xì)胞以每孔8 000 個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，孵育24 h 后棄去培養(yǎng)基，將浸提液稀釋8 倍后加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中共培養(yǎng)12 h，然后每孔加入10 μ L CCK-8 溶液， 采用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定A 值并計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率= （實(shí)驗(yàn)組A 值－空白組A 值） / （陰性對(duì)照組A 值－空白組A 值） ×100%。實(shí)驗(yàn)組：含有細(xì)胞和CCK-8 的水凝膠浸提液溶液； 陰性對(duì)照組： 含有細(xì)胞和CCK-8 的培養(yǎng)基溶液； 空白組： 含有CCK-8 的培養(yǎng)基溶液。

1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 Graphpad Prism 8. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率、細(xì)胞增殖率和抗菌率均符合正態(tài)分布， 以x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 AgNPs 與 AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠表征

DLS 檢測AgNPs 粒徑（圖1A）， 其平均粒徑為41. 64 nm 。AgNPs 的Zeta 電位為7. 32 mV 。圖1B 顯示在波長為406 nm 處出現(xiàn)一個(gè)較為明顯的吸收峰， 屬于AgNPs 的等離子共振吸收峰， 表示在CTAB 保護(hù)下， NaBH4 成功將AgNO3 還原為AgNPs。通過對(duì)ODex、HA-ADH 和AgNP/HAADH/ODex 進(jìn)行紅外光譜表征，在約3 400 cm－1處均出現(xiàn)代表-OH 鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰。其中，ODex 的紅外圖譜中可見代表醛基的特征吸收峰1 724 cm－1， 證實(shí)Dex 成功被高碘酸鈉氧化； 在HA-ADH 圖譜1 627 cm－1 處出現(xiàn)ADH 特有的氨基特征峰，表示ADH 成功改性HA；在1 650 cm－1處出現(xiàn)ODex 和ADH 代表腙鍵形成的特征峰， 表明HA-ADH/ODex 成功合成（圖1C）。

2. 2 MSC-Exo 鑒定及其在 HA-ADH/ODex 水凝膠中的負(fù)載率

納米流式檢測儀檢測結(jié)果顯示MSC-Exo 的平均粒徑為58. 31 nm （圖2）。通過TEM 拍攝MSC-Exo 形貌，可見MSC-Exo 為具有圓形杯托狀的雙層膜結(jié)構(gòu)，粒徑小于100 nm （圖3）。Western blotting 法檢測結(jié)果顯示： MSC-Exo 表達(dá)Alix90、HSP70 和CD63 蛋白，微弱表達(dá)β-actin 蛋白，表明已通過培養(yǎng)MSC成功提取MSC-Exo （圖4）。BCA 法檢測MSC-Exo 原液和浸泡后剩余溶液中的蛋白濃度， 結(jié)果顯示： MSC-Exo 原液蛋白濃度為1. 62 g·L－1，浸泡后剩余溶液蛋白濃度為0. 62 g·L－1，MSC-Exo 負(fù)載率為77. 8%，證明MSC-Exo 成功負(fù)載于AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠上。

2. 3 HA-ADH/ODex 和AgNP/HA-ADH/ODex水凝膠的細(xì)胞相容性

梯度稀釋至不同濃度的HA-ADH/ODex 水凝膠浸提液處理的HaCaT 細(xì)胞存活率均大于90%， 各濃度梯度浸提液的細(xì)胞存活率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）（圖5A）。AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠浸提液在稀釋倍數(shù)小于8 倍時(shí)，HaCaT 細(xì)胞存活率低于80%，且隨著稀釋倍數(shù)的增加，細(xì)胞存活率逐漸升高，在稀釋8 倍及以上時(shí)HaCaT 細(xì)胞存活率均大于85% （圖5B）。

2. 4 AgNP/HA-ADH/ODex和MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠的體外抗菌率

平板涂布法檢測結(jié)果顯示：AgNP/HA-ADH/ODex 和MSCExo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠均能夠明顯抑制E. coli 和S. aureus 生長（圖6）， 其中空白組中E. coli 和S. aureus 的菌落數(shù)分別為2. 53×107 和3. 01×107 CFU·mL－1，與2 種水凝膠處理組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3， Plt;0. 001）（圖7A）。AgNP/HA-ADH/ODex 和MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠對(duì)S. aureus 的抗菌率分別為（96. 44±0. 16）%和（96. 62±0. 16）%，對(duì)E. coli的抗菌率分別為（95. 73±0. 28） % 和（95. 58±0. 14） % （圖7 B）。

2. 5 各 組 HaCaT 細(xì) 胞 存 活 率

空 白 組 、 HAADH/ODex 水凝膠組、AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠組和MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠組的細(xì)胞存活率分別為（100. 00±3. 02） % 、（103. 00±2. 05）%、（78. 00±3. 23）%和（115. 00±7. 42）% （圖8）。與MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠組比較，其他3 組HaCaT 組細(xì)胞存活率升高（n=3，Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。

3 討 論

AgNPs 具有良好的抗菌活性， 可通過抑制細(xì)菌DNA 合成來阻斷其繁殖，因此能夠作為一種抗菌藥物應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)［17］。AgNPs 可直接引起細(xì)菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的破壞而導(dǎo)致細(xì)菌死亡［18］。因AgNPs 可以抑制腫瘤壞死因子α （tumornecrosis factor- α ， TNF-α）、 白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6 和IL-1β 等促炎因子的表達(dá)，具有一定的抗炎作用［19］。基于對(duì)AgNPs 抗菌性能較為成熟的研究，本課題成功制備了粒徑大小均一、表面攜帶正電荷的AgNPs，將其負(fù)載于HA-ADH/ODex 水凝膠上，并對(duì)S. aureus 和E. coli 顯示出優(yōu)異的抗菌活性。因此， AgNPs 可以作為皮膚創(chuàng)傷修復(fù)治療的理想抗菌藥物。

由于Dex 和HA 具有良好的安全性因此被廣泛應(yīng)用于藥物載體材料［20］。其中，HA 是一種天然存在的無支鏈糖胺聚糖，是美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration， FDA） 批準(zhǔn)的各種醫(yī)療應(yīng)用配方中的常見成分［21］。HA 作為細(xì)胞外基的重要組成部分，在細(xì)胞分化、增殖、遷移、炎癥、血管生成、組織再生、傷口愈合和癌癥等多種生理及病理過程中發(fā)揮著重要作用［22］。近年來通過不同物理或化學(xué)方法制備的透明質(zhì)酸或葡聚糖基水凝膠作為MSC-Exo 的遞送載體，被廣泛用于骨關(guān)節(jié)炎疾病模型中［23］。本研究選擇具有優(yōu)異生物相容性的天然多糖化合物ODex 和ADH 為原料，對(duì)其進(jìn)行改性并用于構(gòu)建HA-ADH/ODex 水凝膠。

干細(xì)胞來源的Exo 具有高安全性且易于通過細(xì)胞間通訊保存和運(yùn)輸，現(xiàn)已成為無細(xì)胞治療的一種新興方式［24-25］。其中，MSC-Exo 是從MSC 釋放的細(xì)胞外囊泡，這些囊泡攜帶脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等各種生物活性物質(zhì)，通過靶細(xì)胞內(nèi)吞作用的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，參與人體的免疫反應(yīng)、抗原呈遞、細(xì)胞增殖和抗炎等生理過程［26］。研究［27］ 顯示：Exo 可通過激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 （signaltrasducers and activators of transcription， STAT3）、蛋白激酶B （protein kinase B，AKT） 和Wnt/β-連環(huán)蛋白等信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖、膠原蛋白生成和再上皮化過程。MSC-Exo 能夠作用于包括控制免疫反應(yīng)、抑制炎癥、促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成以及減少傷口愈合過程中的瘢痕形成等傷口愈合的所有階段［28］。MSC-Exo 在體內(nèi)的半衰期較短，能夠快速被人體代謝［29］。因此，將MSC-Exo 負(fù)載于合適的載藥系統(tǒng)使其持續(xù)釋放是增強(qiáng)MSC-Exo 治療活性的一種有效措施。如LI 等［30］ 構(gòu)建了一種可生物降解的雙敏感水凝膠負(fù)載MSC-Exo，并持續(xù)釋放，以促進(jìn)傷口愈合和皮膚再生過程。在本研究中，通過二維培養(yǎng)MSC 提取MSC-Exo 成功提取的MSC-Exo， 其粒徑大小、形貌和表面蛋白表達(dá)情況與文獻(xiàn)［31］ 一致。本課題組進(jìn)一步將MSC-Exo 成功負(fù)載于AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠上， 構(gòu)建MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠。

本研究采用CCK-8 法證實(shí)HA-ADH/ODex 和AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠無明顯細(xì)胞毒性，顯示出良好的細(xì)胞相容性，且該水凝膠可以有效負(fù)載MSC-Exo 和AgNPs， 是一種理想的藥物載體。此外， MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠具有促進(jìn)HaCaT 細(xì)胞增殖的作用，與關(guān)于MSC-Exo促進(jìn)皮膚傷口愈合的報(bào)道［32］ 一致， 在一定程度上可反映其作為生物敷料促進(jìn)皮膚修復(fù)的應(yīng)用潛力。

綜上所述， 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的HA-ADH/ODex 水凝膠可有效負(fù)載 AgNPs 和 MSC-Exo 。同時(shí)，MSC-Exo@AgNP/HA-ADH/ODex 水凝膠具有明顯的抗菌活性和促進(jìn)人表皮HaCaT 細(xì)胞增殖作用，在皮膚損傷修復(fù)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：齊玲、滕旭和劉韜負(fù)責(zé)論文的整體設(shè)計(jì)，劉韜和滕旭負(fù)責(zé)論文的撰寫，劉韜、傅家財(cái)和鐘秤明負(fù)責(zé)論文的實(shí)驗(yàn)實(shí)施，劉韜和滕旭負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

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