［摘 要］ 目的：觀察苦參總黃酮 （SF） 對(duì)醋酸鉛 （LA） 誘導(dǎo)的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3氧化應(yīng)激的改善作用及其對(duì)KELCH 狀ECH 相關(guān)蛋白1 （Keap1） /細(xì)胞中核因子E2 相關(guān)因子2 （Nrf2） 信號(hào)通路的影響，探討 SF 改善由 LA 誘導(dǎo)的 TM3 細(xì)胞氧化應(yīng)激的相關(guān)作用機(jī)制。方法：利用噻唑藍(lán)（MTT） 法檢測(cè)不同濃度（0、10、20、50 和80 μmol·L－1） LA 和不同濃度（0、12. 5、25. 0、50. 0 和80. 0 mg·L－1） SF 分別干預(yù)24 h 后的TM3 細(xì)胞存活率； 將TM3 細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、LA 組、LA+低劑量SF 組、LA+中劑量SF 組和LA+高劑量SF 組。除空白對(duì)照組外，其他各組均采用50 μmol·L－1 LA 誘導(dǎo)TM3 細(xì)胞24 h 建立TM3 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，其中LA+低劑量SF 組、LA+中劑量SF 組和LA+高劑量SF 組TM3 細(xì)胞再分別給予12. 5、25. 0 和50. 0 mg·L－1 SF。利用MTT 法檢測(cè)TM3 細(xì)胞存活率；WST-1 法和硫代巴比妥酸（TBA） 法檢測(cè)TM3 細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA） 水平；Western blotting 法檢測(cè)Nrf2、Keap1 和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 9 （Caspase-9） 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：MTT法檢測(cè)，與 0 μmol·L－1 LA 組比較， 10、20、50 和80 μmol·L－1 LA 組TM3 細(xì)胞存活率明顯降低（Plt;0. 01）； 與0 mg·L－1 SF 組比較， 12. 5、25. 0、50. 0 和80. 0 mg·L－1 SF 組TM3 細(xì)胞存活率明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；與LA 組比較，LA+低劑量SF 組、LA+中劑量SF 組和LA+高劑量SF 組TM3 細(xì)胞存活率明顯升高（Plt;0. 01）； WST-1法和TBA 法檢測(cè)，與LA 組比較，LA+低劑量SF 組、LA+中劑量SF 組和LA+高劑量SF 組TM3細(xì)胞中SOD 活性明顯升高（Plt;0. 01），MDA 水平明顯降低（Plt;0. 01）；Western blotting 法檢測(cè)，與LA 組比較，LA+低劑量SF 組、LA+中劑量SF 組和LA+高劑量SF 組TM3 細(xì)胞中Nrf2 蛋白表達(dá)水平明顯升高 （Plt;0. 01），Keap1和Caspase-9蛋白表達(dá)水平明顯降低 （Plt;0. 01）。結(jié)論：SF對(duì)LA誘導(dǎo)TM3 細(xì)胞氧化應(yīng)激具有一定改善作用，并可降低TM3 細(xì)胞中Keap1 蛋白表達(dá)水平，升高TM3 細(xì)胞中Nrf2 蛋白表達(dá)水平。

［關(guān)鍵詞］ 苦參總黃酮； 醋酸鉛； 睪丸間質(zhì)細(xì)胞； 氧化應(yīng)激； KELCH 狀ECH 相關(guān)蛋白1； 核因子E2 相關(guān)因子2

［中圖分類號(hào)］ R96 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

苦參總黃酮（sophoral flavones， SF） 是豆科植物苦參干燥根中的一類主要有效成分，包括二氫黃酮和二氫黃酮醇等［1-2］。研究［3］ 表明：SF 具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗瘧疾和神經(jīng)保護(hù)等生物活性。SF 可通過調(diào)節(jié)影響精子發(fā)育相關(guān)的激素和能量代謝酶的水平，從而對(duì)生精障礙模型小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)［4］，但SF 是否通過影響KELCH 狀ECH 相關(guān)蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1， Keap1） /核因子E2 相關(guān)因子（nuclear factor erythroid 2-relatedfactor 2，Nrf2） 信號(hào)通路而產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激作用尚未見研究報(bào)道。醋酸鉛（lead acetate， LA） 屬于化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的重金屬毒物， LA 能夠減少細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性及抗氧化物質(zhì)的含量，從而引起細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷，故LA 的毒性與氧化應(yīng)激及其所致氧化損傷密切相關(guān)［5-6］。 Keap1/Nrf2 信號(hào)通路是細(xì)胞參與并調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要信號(hào)通路，影響Keap1/Nrf2 信號(hào)通路能夠增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)基因表達(dá)水平，降低含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 （cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9） 的活化，從而減少細(xì)胞凋亡［7-9］。本研究通過構(gòu)建LA 誘導(dǎo)的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3 氧化應(yīng)激模型［10-12］，探討SF 對(duì)LA 誘導(dǎo)的TM3 細(xì)胞氧化應(yīng)激的改善作用，為SF 的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

TM3細(xì)胞購自中國細(xì)胞資源庫；SF （純度gt;80%）（西安草翠芯生物科技有限公司）， LA （上海希格瑪高技術(shù)有限公司），高糖DMEM 培養(yǎng)基、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide， DMSO） 、胎牛血清（fetal bovineserum， FBS）、雙抗和胰蛋白酶（美國Gibco 公司）， 噻唑藍(lán)（methylthiazolydiphenyl-tetrazolium，MTT） 檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 和丙二醛（malondialdehyde， MDA） 檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），Keap1 抗體、Nrf2 抗體和Caspase-9 抗體及全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、凝膠制備試劑盒、彩虹245 廣譜蛋白Marker 以及ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），電泳液、轉(zhuǎn)膜液、緩沖液、封閉液、一抗稀釋液和二抗稀釋液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)： 311） 和酶標(biāo)儀（型號(hào)：SUNERGY-HTX）［賽默飛世爾科技（中國） 有限公司］， 倒置顯微鏡（型號(hào)： CKX4， 日本Olympus 公司），電泳儀、電轉(zhuǎn)儀和電泳槽（型號(hào)：BE6085，美國Bio-Rad 公司），凝膠成像儀（型號(hào)：Alliance Q9，英國UVItec 公司）。

1. 2 TM3 細(xì)胞培養(yǎng)

將 TM3 細(xì)胞放置于 10%FBS+1% 雙抗+ DMEM 高糖培養(yǎng)基中， 置于37 ℃、5% CO2 飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)并傳代。

1. 3 MTT法檢測(cè) LA和 SF分別誘導(dǎo)的 TM3細(xì)胞存活率

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TM3 細(xì)胞，分為0、10、20、50 和80 μmol·L－1 LA 組以及0、12. 5、25. 0、50. 0 和80. 0 mg·L－1 SF 組。按照每孔8×103 個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞混懸液接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上， 待培養(yǎng)密度至80%， 各組分別給予不同濃度LA 和SF， 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入20% MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4 h， 棄去上清液， 加入150 μL DMSO 振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm 處檢測(cè)吸光度（A） 值。細(xì)胞存活率= ［ （實(shí)驗(yàn)組A 值－ 空白組A 值） / （對(duì)照組A 值－ 空白組A 值）］ ×100%。

1. 4 TM3細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的制備及分組

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TM3 細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、LA 組、LA+低劑量SF 組、LA+中劑量SF 組和LA+高劑量SF 組。除空白對(duì)照組外，其他各組均采用50 μmol·L－1 LA 誘導(dǎo)TM3 細(xì)胞24 h 建立TM3 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，其中LA+低劑量SF 組、LA+中劑量SF 組和LA+高劑量SF 組再分別給予12. 5、25. 0 和50. 0 mg·L－1 SF， 置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h［13-14］。

1. 5 MTT 法檢測(cè)各組 TM3 細(xì)胞存活率

利用MTT 法檢測(cè)“1. 4”中TM3 細(xì)胞存活率，具體操作方法參照“1. 3”。

1. 6 WST-1 法 和 硫 代 巴 比 妥 酸（thiobarbituricacid，TBA）法檢測(cè)各組細(xì)胞中SOD活性及MDA水平

各組TM3 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后， 分別加入200 μL 細(xì)胞裂解液在冰上裂解30 min， 再次12 000 r·min－1 離心10 min， 按照BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒使用說明書要求對(duì)TM3 細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)，按照測(cè)試盒說明書要求檢測(cè)TM3 細(xì)胞中SOD活性和MDA 水平。根據(jù)測(cè)試盒說明書中公式計(jì)算SOD 活性和MDA 水平： SOD 抑制率= ［ （對(duì)照組A 值－ 空白組A 值） － （測(cè)定組A 值－ 空白組A 值） ］ / （對(duì)照組A 值－ 空白組A 值） ×100%；SOD 活性（U·mg－1） =SOD 抑制率/ 50%× 反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（0. 24 L/0. 02 L） × 樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。MDA 水平（μmol·g－ 1） = ［ （測(cè)定組A 值－ 空白組A 值） / （標(biāo)準(zhǔn)品組A 值－ 空白組A 值）］ ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/樣本蛋白濃度。

1. 7 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中 Keap1、Nrf2和Caspase-9蛋白表達(dá)水平

按照全蛋白提取試劑盒說明書要求提取細(xì)胞蛋白，按照BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書要求測(cè)定細(xì)胞蛋白表達(dá)水平，搖勻后100 ℃水浴加熱10 min，置于－80 ℃超低溫冰箱保存、備用。按照SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒要求制備膠板， 上樣后， 電泳（濃縮膠：90 V， 分離膠： 110 V）、轉(zhuǎn)膜（110 V、60 min）、清洗（緩沖液：每次5 min、清洗3 次）、封閉（脫脂牛奶： 1 h）、加入一抗（Keap1、Nrf2 和Caspase-9： 4 ℃、24 h）、加入二抗（HRP： 1 h）、清洗（緩沖液：每次5 min、清洗3 次）、顯色（按照ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒要求配制顯色液），置于凝膠成像儀中成像，利用Image J 圖像處理軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照蛋白條帶灰度值。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 22. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組TM3 細(xì)胞存活率，細(xì)胞中SOD活性和MDA 水平及Keap1、Nrf2 和Caspase-9 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布， 以x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 LA 誘導(dǎo)的 TM3細(xì)胞存活率

與 0 μmol·L－1LA 組（100. 00%±0. 01%） 比較， 10、20、50 和80 μmol·L－1 LA 組TM3 細(xì)胞存活率（73. 90%±0. 03%、66. 91%±0. 02%、57. 78%±0. 03% 和39. 13%±0. 02%） 明顯降低（Plt;0. 01）。其中50 μmol·L－1 LA 組細(xì)胞存活率下降至（57. 78±0. 03） %，該濃度是存活率下降近半數(shù)時(shí)的抑制濃度，可用來衡量藥物對(duì)細(xì)胞的毒性或者細(xì)胞對(duì)藥物的耐受能力， 故本實(shí)驗(yàn)選用50 μmol·L－1 LA 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

2. 2 SF誘導(dǎo)的TM3細(xì)胞存活率

與0 mg·L－1 SF組（100. 00%±0. 01%） 比較，12. 5、25. 0、50. 0和80. 0 mg·L－1 SF 組TM3 細(xì)胞存活率（99. 13%±0. 01%、98. 90%±0. 01%、97. 58%±0. 02% 和72. 73%±0. 05%） 明顯降低（Plt;0. 05或Plt;0. 01）。

2. 3 各組 TM3 細(xì)胞存活率

與空白對(duì)照組（100. 00%±0. 01%） 比較， LA 組細(xì)胞存活率（56. 50%±0. 01%） 明顯降低（Plt;0. 01）；與LA 組比較， LA+ 低劑量SF 組、LA+ 中劑量SF 組和LA+高劑量SF 組細(xì)胞存活率（60. 90%±0. 02%、66. 98%±0. 02% 和77. 50%±0. 02%） 明顯升高（Plt;0. 01）。

2. 4 各組TM3細(xì)胞中SOD活性和MDA水平

與空白對(duì)照組比較， LA 組TM3 細(xì)胞中SOD 活性明顯降低（Plt;0. 01）， MDA 水平明顯升高（Plt;0. 01）；與LA 組比較，LA+低劑量SF 組、LA+中劑量SF 組和LA+ 高劑量SF 組TM3 細(xì)胞中SOD 活性明顯升高（Plt;0. 01），MDA 水平明顯降低（Plt;0. 01）。見表1。

2. 5 各組TM3細(xì)胞中Keap1、Nrf2和Caspase-9蛋白表達(dá)水平

與空白對(duì)照組比較，LA組TM3細(xì)胞中Nrf2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01），Keap1和Caspase-9 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）；與LA 組比較， LA+ 低劑量SF 組、LA+ 中劑量SF 組和LA+高劑量SF 組細(xì)胞中Nrf2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）， Keap1 和Caspase-9 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）。見圖1 和表2。

3 討 論

睪丸生精小管之間分布的疏松結(jié)締組織稱為睪丸間質(zhì)或間質(zhì)組織，在間質(zhì)中有一種合成雄激素的內(nèi)分泌細(xì)胞稱為睪丸間質(zhì)細(xì)胞，能夠合成分泌雄性激素，促進(jìn)精子的發(fā)生和男性生殖器官發(fā)育，以及維持第二性征和性功能［15-16］。LA 是生活中應(yīng)用廣泛、具有毒性的化工原料，可作為制備各種鉛鹽、抗污涂料、水質(zhì)防護(hù)劑、顏料填充劑、涂料干燥劑、纖維染色劑以及重金屬氰化過程的溶劑等［17］，而LA 長(zhǎng)期蓄積在環(huán)境中， 會(huì)嚴(yán)重危害人體健康。研究［18-20］ 表明：LA 能夠使小鼠精子密度和精子活力明顯下降，精子畸形率增高，導(dǎo)致小鼠睪丸受損影響其生殖功能。

中藥材苦參是豆科植物苦參的干燥根，具有清熱燥濕、利尿和祛風(fēng)殺蟲等功效，含多種生物堿和多種黃酮類化合物［1-3］。SF 作為其活性成分之一，主要包括二氫黃酮和二氫黃酮醇類化合物［1-2］。研究［21］ 表明：SF 可明顯改善前列腺增生模型大鼠血清中促黃體生成激素（luteinizing hormone， LH）、睪酮（testosterone， T） 和雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT） 水平，減輕大鼠前列腺和精囊腺質(zhì)量，對(duì)良性前列腺增生具有明顯改善作用。研究［4，13］ 結(jié)果顯示： SF 對(duì)LA 所致雄性小鼠睪丸損傷有一定的保護(hù)作用，可以影響與其精子發(fā)育相關(guān)的激素及能量代謝酶的含量，但其具體機(jī)制尚不明確。本研究采用LA 誘導(dǎo)TM3 細(xì)胞構(gòu)建TM3 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型， 結(jié)果表明： 12. 5～50. 0 mg·L－1 SF 可以改善由LA 引起的TM3 細(xì)胞存活率的降低，且隨著SF 的濃度升高，TM3 細(xì)胞增殖作用加強(qiáng)。

SOD 是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，具有抗氧化和抗衰老作用，能夠消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)［22-23］。研究［24］ 表明： SOD 基因表達(dá)水平升高， 能夠使晚期凋亡的TM3 細(xì)胞明顯減少。干擾抗氧化酶SOD 活性，能夠引起脂質(zhì)過氧化物MDA 在體內(nèi)蓄積，升高氧自由基含量，誘導(dǎo)TM3 細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，加劇細(xì)胞損傷［ 25］。 本研究結(jié)果顯示： 12. 5～50. 0 mg·L－1 SF 能夠使LA 誘導(dǎo)的TM3 細(xì)胞中SOD 活性升高， MDA 水平降低， 調(diào)節(jié)TM3 細(xì)胞在氧化應(yīng)激過程中引起的異常指標(biāo)的變化。

Keap1/Nrf2 信號(hào)通路在生理狀態(tài)下，Keap1 可通過泛素化降解Nrf2。而當(dāng)活性氧產(chǎn)生與清除的平衡被破壞時(shí)， Keap1 則會(huì)失活， 導(dǎo)致Nrf2 清除受阻， 引起Nrf2 的過度蓄積和激活， 并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中， 調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)［7-8］。Caspase-9 是存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶， 參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化與凋亡調(diào)節(jié)［26-27］。研究［28］ 表明：Caspase-9 表達(dá)受到Keap1/Nrf2 信號(hào)通路的調(diào)控， 當(dāng)Keap1/Nrf2 信號(hào)通路表達(dá)受阻， 會(huì)引起Caspase-9 蛋白表達(dá)水平升高，誘導(dǎo)生殖細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。本研究結(jié)果顯示： 12. 5～50. 0 mg·L－1SF 能夠使LA 誘導(dǎo)的TM3 細(xì)胞中Nrf2 蛋白表達(dá)水平明顯升高， Keap1 和Caspase-9 蛋白表達(dá)水平明顯降低， 改善由LA 誘導(dǎo)的TM3 細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激。

綜上所述，SF 可以改善由LA 誘導(dǎo)的TM3 細(xì)胞所引起的細(xì)胞存活率的降低，能夠使TM3 細(xì)胞中SOD 活性升高， MDA 水平降低， 對(duì)TM3 細(xì)胞出現(xiàn)的氧化應(yīng)激具有改善作用， 提示SF 對(duì)LA 誘導(dǎo)的TM3 細(xì)胞氧化應(yīng)激的改善作用可能與影響Keap1/Nrf2 信號(hào)通路有關(guān)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：范紅艷、任曠和王艷春負(fù)責(zé)論文的整體設(shè)計(jì)，劉玥欣負(fù)責(zé)論文的撰寫，來永巍、路倩、徐博和安英負(fù)責(zé)論文的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

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[基金項(xiàng)目] 吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（JJKH20210498KJ）