歐陽(yáng)蕾

（廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司，廣西 梧州 530011）

抗生素是一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，它是由動(dòng)植物、微生物產(chǎn)生的具有抗病原體和活性的物質(zhì)，主要的作用是干擾、抑制細(xì)菌的發(fā)育功能。將抗生素添加在藥品中能夠起到抑制細(xì)胞壁合成的作用，對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞膜具有穿透性，起到抑菌、殺菌、消炎的效果。抗生素大多數(shù)會(huì)被使用在細(xì)菌感染的治療中，有些抗生素可以治療陰性桿菌導(dǎo)致的感染，還有一些抗生素含有內(nèi)酰胺類物質(zhì)可以對(duì)抗高端螺旋體感染。四環(huán)素就是人們常見(jiàn)的一種抗生素，它可以用來(lái)治療螺旋體感染，對(duì)抗其它類型的惡性腫瘤。除了人體用藥之外，家畜動(dòng)物感染也經(jīng)常使用抗生素，例如紅霉素、替米考星治療金黃色葡萄球菌引起的各項(xiàng)感染病癥，又比如利用林可酰胺類抗生素可以治療壞死性腸炎和奶牛急性乳腺炎，這充分說(shuō)明了藥物中抗生素的存在是不可避免的，然而抗生素的耐藥性問(wèn)題終究還是爆發(fā)了出來(lái)，如果不加以控制將會(huì)影響公共健康，這里的控制不是禁止抗生素添加，而是要用科學(xué)的手段檢測(cè)抗生素的含量。

1 微生物檢測(cè)法

微生物檢測(cè)法指的是查看抗生素對(duì)微生物的生長(zhǎng)和發(fā)育是否具有明顯的抑制作用，以此為依據(jù)來(lái)計(jì)算抗生素的活性，常用的方式和手段包括管碟法和比濁法兩種。采用微生物檢測(cè)法靈活性較高，靈敏度也較強(qiáng)，能夠直接顯示該項(xiàng)抗生素是否具有抗菌能力，因此這種方法被廣泛地使用在多種抗生素類藥物的檢測(cè)中。

1.1 管碟法

目前國(guó)際上較為常用的方式是管碟法，管碟法能夠?qū)股氐男r(jià)展開(kāi)有效測(cè)定，使用管碟法需要依靠瓊脂作為介質(zhì)，查看抗生素的擴(kuò)散作用。抗生素在瓊脂之中放置可以形成抑菌圈，計(jì)算抑菌圈的大小可以推算出生物活性以及其前后變化情況。目前管碟法在各個(gè)國(guó)家的抗生素微生物檢測(cè)中都得到了廣泛的使用并取得不錯(cuò)的效果，采用管碟法時(shí)要觀察抗生素在培養(yǎng)皿的擴(kuò)散情況[1]。一般而言，抗生素濃度由上到下會(huì)形成自然弧度和梯度，中心濃度較高，邊緣濃度較小，如果抗生素濃度已經(jīng)大于最低抑制濃度，就說(shuō)明樣本中的細(xì)菌已經(jīng)被有效抑制，從而不能有效繁殖，說(shuō)明抗生素有效，從肉眼上可以看到透明的抑菌圈。要根據(jù)擴(kuò)散定律計(jì)算抗生素總量和抑菌圈直徑之間的關(guān)系，經(jīng)過(guò)實(shí)踐可以發(fā)現(xiàn)二者之間呈現(xiàn)出線性關(guān)系，工作人員可以根據(jù)此項(xiàng)現(xiàn)象來(lái)計(jì)算抗生素的生物活性。我國(guó)藥典所收錄的抗生素檢測(cè)方法大多數(shù)是高效液相色譜法，其次就是微生物檢測(cè)方式，適合用微生物方式做出檢測(cè)的包括青霉素、紅霉素、氨基糖苷類抗生素，還包括卡納霉素鹽酸、大觀霉素，也包括四環(huán)素類抗生素例如土霉素。和中國(guó)藥典相比，歐盟和美國(guó)藥典采用管碟法的案例數(shù)量較多，例如在檢測(cè)大觀霉素、酒石酸泰樂(lè)菌素的時(shí)候，采用管碟法都可以有效地測(cè)試微生物含量。

除了在常規(guī)藥品中檢測(cè)抗生素含量之外，使用管碟法可以檢測(cè)飼料添加劑是否存在非法添加物，也可以檢測(cè)非法添加物質(zhì)中是否含有禁用抗生素。例如，在獸藥散劑中使用管碟法展開(kāi)抗生素檢測(cè)就可以查出卡納霉素生物以及其中間產(chǎn)物。使用管碟法的時(shí)候也可以檢測(cè)物質(zhì)生物活性，測(cè)試重組蛋白是否具有生物化學(xué)活性，從而計(jì)算重組蛋白是否能有效抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，管碟法還可以測(cè)試乳酸菌菌株對(duì)抗生素的藥物是否具有耐藥性和抵抗性，這種方法適合用來(lái)檢測(cè)組分程度較為復(fù)雜的發(fā)酵類藥物，這是它的優(yōu)勢(shì)和特別之處，采用高效液相色譜法等其它方式不能完全替代。在使用管碟法的時(shí)候有一定的技術(shù)要求，工作人員需要具備較強(qiáng)的專業(yè)理論知識(shí)和操作經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)它的操作步驟相對(duì)較為復(fù)雜，容易受到外界環(huán)境因素的不良干擾。相對(duì)于管碟法而言，使用高效液相色譜法并不存在這些問(wèn)題，有一些藥物的抗生素含量測(cè)定可以采用高效液相色譜法來(lái)替代。目前在測(cè)定乳糖酸紅霉素的時(shí)候，官方建議的方式就是高效液相色譜法，在檢測(cè)的過(guò)程中會(huì)更加方便，也可以用該方法來(lái)測(cè)量分拉霉素的含量。和傳統(tǒng)的微生物抗生素檢測(cè)方式相比，后者在檢測(cè)時(shí)精密程度較好并且方便快捷。但必須認(rèn)識(shí)到的是，雖然微生物檢測(cè)方式容易受到環(huán)境的影響，產(chǎn)生一定的誤差，但是將它用來(lái)測(cè)試多組分抗生素?fù)碛衅渌椒ú豢商娲膬?yōu)勢(shì)，因此這種方式依然是主要的檢測(cè)手段，在未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)還會(huì)被廣泛推廣。

1.2 比濁法

比濁法也是常用的微生物檢測(cè)手段之一，它可以在液體培養(yǎng)基中查看抗生素是否對(duì)細(xì)菌有生長(zhǎng)抑制作用，其主要的工作思路是測(cè)試培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)皿濁度值大小，從而和對(duì)照組產(chǎn)生比較。因此，比濁法也是對(duì)抗生素有效定效定價(jià)的一種方式，這種方式特別適合懸濁液的檢測(cè)[2]。和管碟法檢測(cè)相比，比濁法不對(duì)環(huán)境做太高的要求，也不要求檢測(cè)器具和儀器具備過(guò)高的靈敏程度。有些學(xué)者利用比濁法檢測(cè)了藥品乳劑中夫西地酸的含量并通過(guò)了科學(xué)驗(yàn)證，采用比濁法可以檢測(cè)對(duì)象的吸光度和濃度，并支持展開(kāi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，這種方式的精密程度和平均回收率都較好，因此可以大大提高檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。比濁法還可以成功地檢測(cè)泰樂(lè)菌素的含量并計(jì)算線性關(guān)系，如果要用比濁法進(jìn)行微生物的檢測(cè)，其必要條件是確保試驗(yàn)菌穩(wěn)定性較強(qiáng)，因此這一過(guò)程中對(duì)微生物數(shù)量的控制非常關(guān)鍵。將其用于抗生素含量檢測(cè)中耗時(shí)較短，在某種程度上可以替代傳統(tǒng)的擴(kuò)散檢測(cè)法，該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)不使用有機(jī)溶劑，減少了化學(xué)污染產(chǎn)生的概率和可能性，但是這種方法在實(shí)際過(guò)程中不常使用，主要是由于樣品含有雜質(zhì)，容易滋生細(xì)菌，不適合有色渾濁液的樣品檢測(cè)，并且比濁法試管需要具有較高的透明度，培養(yǎng)基要求較為清澈，若完全滿足以上要求會(huì)導(dǎo)致成本提升。

2 高效液相色譜法

高效液相色譜法的英文簡(jiǎn)稱是HPLC，它是柱色譜的常用形式之一，將其運(yùn)用在藥品檢測(cè)中可以有效測(cè)定抗生素含量，這種方式可以在高壓狀態(tài)下檢測(cè)樣品混合物，將其輸入色譜柱固定相之中計(jì)算吸附和分配系數(shù)的差異，達(dá)到不同介質(zhì)分離的效果，再利用兩種色譜柱的相對(duì)移動(dòng)進(jìn)行元素交換，從而達(dá)到不同物質(zhì)分離的效果。高效液相色譜法可以運(yùn)用在各種類型的化工產(chǎn)業(yè)和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中，除了藥品含量檢測(cè)還可以被醫(yī)學(xué)和化學(xué)藥品行業(yè)所采納[3]。我國(guó)藥典收錄了將近兩百種高效液相色譜法的測(cè)定方式，占整體測(cè)試方式的73%左右，在測(cè)試氨基糖苷類抗生素的時(shí)候這一方法特別適用，比如檢測(cè)鹽酸大觀霉素和硫酸依替米星試劑的時(shí)候就可以經(jīng)常使用，也可以用高效液相色譜法檢測(cè)酰胺醇類抗生素，比如琥珀氯霉素和鹽酸林可霉素。可以用該項(xiàng)方法作為檢測(cè)手段的還包括四環(huán)素類藥物，例如抗生素、鹽酸土霉素、鹽酸多西環(huán)素[4]。除了人體用藥之外，獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)文件也規(guī)定了高效液相色譜法可以檢測(cè)的范圍，占整體獸藥檢測(cè)技術(shù)的36%，比如在檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的時(shí)候就可以用來(lái)測(cè)試酒石酸泰萬(wàn)菌素的抗生素含量，經(jīng)常使用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素包括硫酸卡那霉素、泰樂(lè)菌素以及相關(guān)衍生物，還可以用來(lái)檢測(cè)阿莫西林、苯唑西林和普魯卡因青霉素等藥劑。相對(duì)于其他的檢測(cè)方式，高效液相色譜法在檢測(cè)抗生素含量時(shí)操作更加方便，對(duì)環(huán)境要求不高，成本較低，因此適用范圍較大。利用高效液相色譜法發(fā)展的反向分支可以用來(lái)檢測(cè)頭孢洛林濃度，計(jì)算其相關(guān)系數(shù)，這種方法經(jīng)過(guò)驗(yàn)證適合用在原料藥的檢測(cè)中。有些學(xué)者利用高效液相色譜法檢測(cè)萬(wàn)古霉素的樣品抗生素含量并成功地將其運(yùn)用在醫(yī)藥領(lǐng)域，為人體健康服務(wù)。還有一些學(xué)者設(shè)置了LiChroCARTRP-18 色譜柱，測(cè)定了硫酸頭孢喹酮的濃度含量，高效液相色譜法展開(kāi)抗生素含量的測(cè)定具有較強(qiáng)的重復(fù)性能，尤其是對(duì)頭孢類藥物的抗生素含量檢測(cè)可以通過(guò)數(shù)據(jù)的反復(fù)比對(duì)建立驗(yàn)證模型。

3 可見(jiàn)分光光度法

可見(jiàn)分光光度法也叫紫外UV 方法，在波長(zhǎng)800m以內(nèi)可以檢測(cè)待測(cè)樣本的吸光度，這種方式經(jīng)常用于物質(zhì)鑒別和雜質(zhì)的測(cè)定，當(dāng)光束穿透待測(cè)溶液和待測(cè)樣本的時(shí)候，物質(zhì)的吸光程度會(huì)隨著波長(zhǎng)的變化而發(fā)生改變，可見(jiàn)分光光度方法可以用在定量測(cè)量上檢測(cè)溶劑吸光程度，再和對(duì)照組的吸光度進(jìn)行比較，用科學(xué)的系數(shù)計(jì)算法查看樣品溶液濃度[5]。我國(guó)藥典收錄了諸多可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)抗生素含量的先例，從而將此方法確定為官方檢測(cè)手段之一。常見(jiàn)的包括放線菌素和注射用放線菌素，還可以用此方式來(lái)檢測(cè)酰胺醇類抗生素，例如琥珀氯霉素及其衍生物，這種方法在使用時(shí)需要借助恩諾沙星可溶性粉，它的運(yùn)用方便各種藥物品質(zhì)的檢測(cè)，操作方式較為便捷，并且可以有效測(cè)定抗生素含量百分比。相對(duì)于經(jīng)常使用的高效液相色譜方式，可見(jiàn)分光光度法不需要使用昂貴的儀器，經(jīng)濟(jì)性較好，性價(jià)比較高，這種方式可以運(yùn)用在常規(guī)藥品的抗生素檢測(cè)中，比如在350nm 以下的波長(zhǎng)范圍中可以檢測(cè)吸光度小于270nm 的藥品，相關(guān)系數(shù)可以設(shè)置為0.9996，回收率較好，超過(guò)100%。通過(guò)紫外方法可以檢測(cè)恩諾沙星納米乳的線性范圍和平均回收率，從而計(jì)算出抗生素含量。利用紫外法也可以測(cè)試其他霉素預(yù)混劑的含量大小。以上這些成功的運(yùn)用案例都是可見(jiàn)分光光度法的成功表現(xiàn)，和微生物檢測(cè)方法相比較，這種方式較為簡(jiǎn)單快捷，不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生過(guò)高的要求。還有一些學(xué)者利用紫外方法測(cè)試了克拉霉素含量和大觀霉素含量，它在操作時(shí)相對(duì)較為簡(jiǎn)便，因此具有良好的推廣價(jià)值，但是其缺點(diǎn)也是顯著的，那就是紫外線會(huì)受到吸光度的影響而發(fā)生波動(dòng)，導(dǎo)致待測(cè)樣本發(fā)生不平行的問(wèn)題，相近波長(zhǎng)不能彼此區(qū)分，重復(fù)性也不好。在未來(lái)隨著技術(shù)改進(jìn)，這項(xiàng)技術(shù)可以和高效液相色譜法綜合使用。

4 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是除了管碟法、可見(jiàn)分光光度法和高效液相色譜法之外的又一大方法，它的工作原理是把彈性石英毛細(xì)管作為分離通道，用高壓電流作為驅(qū)動(dòng)，對(duì)待測(cè)樣本藥品的分配行為差異展開(kāi)檢測(cè)和分離。目前常用的頭孢菌素抗生素含量的檢測(cè)已經(jīng)有了多種和毛細(xì)管電泳法相關(guān)的檢測(cè)手段，這些檢測(cè)手段并用可以同時(shí)進(jìn)行多種抗生素含量的分析，使用毛細(xì)管電泳方法和高效液相色譜法一樣，其效率都較高，分離能力較強(qiáng)，但是毛細(xì)管電泳方法相對(duì)于前者不會(huì)消耗大量的試劑，但是這種方法也有一點(diǎn)缺陷，那就是不太靈敏，因此在未來(lái)還要對(duì)毛細(xì)管電泳法展開(kāi)技術(shù)革新與拔高。隨著現(xiàn)代科技的手段發(fā)展，更多的新方法將被用于抗生素含量的測(cè)定。比如有些學(xué)者采用干燥綠植片作為工具，對(duì)傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方式展開(kāi)替代，檢測(cè)了恩拉菌素預(yù)混劑中有效成分的含量，這項(xiàng)技術(shù)在使用時(shí)相對(duì)較為簡(jiǎn)單，也可以重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最大限度地避免了微生物檢測(cè)法容易出現(xiàn)的外界干擾因素，大量樣品也可以同時(shí)檢測(cè)，不需等待。還有些學(xué)者利用催化劑例如金納米顆粒檢測(cè)了卡納霉素的含量，TMB 物質(zhì)可以氧化于過(guò)氧化氫，產(chǎn)生吸光度較強(qiáng)的藍(lán)色物質(zhì)，在加入一定的試劑之后，檸檬酸可以催化過(guò)氧化氫的反應(yīng)，從而快速靈敏的測(cè)量微生物的含量。更關(guān)鍵的是，檢測(cè)抗生素含量的方式和手段也可以用來(lái)臨床使用，為醫(yī)生提供新的治療工具，在治療后有利于患者的康復(fù)和保健。并且學(xué)者發(fā)現(xiàn)，大觀霉素利用中性介質(zhì)可以產(chǎn)生更多的衍生物，從而補(bǔ)充了傳統(tǒng)的光譜測(cè)定方式，建設(shè)了熒光法。熒光法的測(cè)試又是一大進(jìn)步，目前在藥物監(jiān)測(cè)系統(tǒng)和抗生素含量檢測(cè)中都發(fā)揮了不錯(cuò)的作用。

5 結(jié)語(yǔ)

抗生素檢測(cè)對(duì)藥品的療效有著非常重要的作用，檢測(cè)藥品中的抗生素含量可以采用多元化的檢測(cè)方法，這些抗生素的檢測(cè)方法各有自身的特點(diǎn)，并且都能滿足不同藥品中抗生素的檢測(cè)要求，藥品檢測(cè)中常見(jiàn)的抗生素的檢測(cè)方法有：微生物檢測(cè)法、高效液相色譜法、可見(jiàn)分光光度法，不同的檢測(cè)方法也有不同的工具和分支，有關(guān)工作人員要酌情選擇，以提高抗生素含量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。在未來(lái)更應(yīng)加大研發(fā)力度，研制出更加高效、便捷、精準(zhǔn)且經(jīng)濟(jì)的抗生素檢測(cè)方法。