張雪麗　于浩淼　閆振貴　楊少華　張亮　楊宏軍

摘要：本研究旨在分離能夠高效裂解耐藥金黃色葡萄球菌的噬菌體，為噬菌體生物制品的研制提供候選材料。以耐氨芐西林金黃色葡萄球菌為宿主菌，用雙層平板法分離噬菌體，通過(guò)透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態(tài)，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性分析及全基因組測(cè)序分析。結(jié)果分離得到一株金黃色葡萄球菌噬菌體，效價(jià)達(dá)2.75×1010PFU/mL，命名為SP688。該噬菌體具有長(zhǎng)的不收縮尾巴，屬長(zhǎng)尾噬菌體科，對(duì)7株耐氨芐西林金葡菌均有裂解效果，最佳感染復(fù)數(shù)為1，可在10h內(nèi)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，在溫度-20-54℃范圍和pH值3-11之間活性穩(wěn)定，對(duì)紫外線敏感。全基因組分析顯示，SP688基因組為環(huán)狀DNA，全長(zhǎng)45499kb，GC含量為34.1%；預(yù)測(cè)到64個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs），其中19個(gè)（29.69%）被預(yù)測(cè)功能。該噬菌體是一株新型裂解耐氨芐西林金黃色葡萄球菌的廣譜噬菌體，可為噬菌體治療提供材料。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；噬菌體；形態(tài)：生物學(xué)特性分析；全基因組分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）03-0132-07

金黃色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌之一。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，金黃色葡萄球菌的耐藥性不斷增加，致使抗生素治療效果不理想，奶牛乳腺炎難以得到控制和根除。同時(shí)，抗生素殘留所引起的棄奶進(jìn)一步加劇了養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失。在國(guó)家提倡“減抗替抗”的政策引導(dǎo)下，需要有新的制劑用于奶牛乳腺炎的防治。

噬菌體是一類(lèi)侵襲細(xì)菌的病毒，具有獨(dú)特的裂解機(jī)制和嚴(yán)格的宿主特異性，同時(shí)具有增殖速度快、研發(fā)時(shí)間短、高效裂解耐藥細(xì)菌等優(yōu)點(diǎn)。隨著對(duì)噬菌體研究的不斷加深，一些可裂解多重耐藥細(xì)菌的噬菌體被發(fā)現(xiàn)，如可裂解金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌等。作為一種安全的生物制劑，噬菌體對(duì)于未來(lái)多重耐藥性細(xì)菌感染的治療具有重要意義。

本研究以從臨床乳腺炎的奶牛乳汁中分離到的耐氨芐西林的金黃色葡萄球菌為宿主進(jìn)行噬菌體的分離篩選，對(duì)篩選出的噬菌體進(jìn)行生物學(xué)特性分析及基因組分析，以期為金黃色葡萄球菌噬菌體的研究及其對(duì)奶牛乳腺炎的治療防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株及污水

供試菌株均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草食家畜疫病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)分離保藏，金黃色葡萄球菌分離于臨床乳房炎患牛乳汁樣品，部分大腸桿菌分離于環(huán)境樣品。污水來(lái)源于濟(jì)南某規(guī)?；膛?chǎng)糞污水混樣。

1.1.2 主要試劑和儀器

LB肉湯培養(yǎng)基購(gòu)白北京陸橋技術(shù)股份有限公司：噬菌體基因組提取試劑盒購(gòu)白上海尚寶生物科技有限公司：DNA酶l（DNase I）、RNA酶A（RNase A）及綠豆核酸酶（Mung Bean Nuclease）購(gòu)白北京阿匹斯生物科技有限公司：0.22μm細(xì)菌濾器購(gòu)自Merck Millipore公司。冷凍高速離心機(jī)、動(dòng)態(tài)酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司：JEM-2100 Plus透射電子顯微鏡（electron microscope，EM）購(gòu)自日本電子株式會(huì)社。

1.1.3 緩存液

參照文獻(xiàn)[9]配制SM緩存液，配方略有調(diào)整，不加入明膠。121℃高壓滅菌15mm，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 噬菌體的富集

將污水混樣12000r/min離心15min除雜，收集上清液。使用0.22μm濾器過(guò)濾上清液，4℃保存?zhèn)溆?。將處于?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌、污水上清液、無(wú)菌LB肉湯培養(yǎng)基按1：5：10體積比充分混勻，于37℃、180r/min搖床培養(yǎng)24h，離心過(guò)濾，備用。

1.2.2 噬菌體的純化

參照雙層平板法分離噬菌體，用無(wú)菌針頭挑取單個(gè)噬菌斑到2mL無(wú)菌離心管中，加入1mL SM緩存液充分混勻，4℃過(guò)夜。次日離心過(guò)濾，將濾液連續(xù)10倍梯度稀釋至10-10。重復(fù)上述操作3-4次，直至得到大小均勻、邊緣清晰、透亮的噬菌斑。

1.2.3 噬菌體效價(jià)測(cè)定

將純化好的噬菌體連續(xù)10倍梯度稀釋?zhuān)總€(gè)濃度取100μL，用雙層平板法培養(yǎng)得到噬菌斑，選擇噬菌斑生長(zhǎng)范圍在20-300個(gè)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)濃度梯度做3個(gè)重復(fù)，取平均值計(jì)算噬菌體效價(jià)。噬菌體效價(jià)（PFU/mL）=噬菌斑平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.2.4 噬菌體的電鏡觀察

取100μL純化后的噬菌體（106PFU/mL）滴加到干凈的膜上，將銅網(wǎng)放入噬菌體液中靜置20min取出，自然吸收20s后吸去多余液體。用醋酸鈾染液染色，2min后取出并吸去殘留的染液，洗滌干燥。接著放入另1滴醋酸鈾染液中復(fù)染，2min后取出，吸去殘留染液，干燥后透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)。

1.2.5 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)

參照Niu等的方法，將噬菌體濃縮液（1×109PFU/mL）連續(xù)10倍稀釋至103PFU/mL，每個(gè)濃度噬菌體稀釋液各取100μL與宿主菌（1×106CFU/mL）1：1共同接種到96孔板中，每濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。37℃溫箱中培養(yǎng)6-10h。以細(xì)菌組為陰性對(duì)照、SM緩沖液組為空白對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，記錄無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)孔的最低噬菌體濃度，即微孔內(nèi)培養(yǎng)液呈澄清透明，無(wú)彌散狀渾濁或絲狀沉淀。同時(shí)測(cè)波長(zhǎng)600nm處吸光值（OD600）。噬菌體一宿主試驗(yàn)的感染復(fù)數(shù)MOI=每孔噬菌體數(shù)／每孔細(xì)菌數(shù)。

1.2.6噬菌體裂解動(dòng)力學(xué)

參照Niu等的方法，將噬菌體濃縮液（1×109PFU/mL）連續(xù)10倍稀釋?zhuān)∶繚舛仁删w稀釋液100μL加入96孔板中，每孔加入100μL宿主菌（106CFU/mL）混合均勻，每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)，以細(xì)菌組為對(duì)照。370C孵育18-20h，并使用動(dòng)態(tài)酶標(biāo)儀每小時(shí)動(dòng)態(tài)讀取OD600值，繪制曲線。

1.2.7 噬菌體的裂解譜測(cè)定

將除宿主菌外的15株大腸桿菌和39株金黃色葡萄球菌活化，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，各取100μL菌液制雙層平板，使用點(diǎn)板的方法，取噬菌體液5-10μL滴加到平板表面。37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日觀察噬菌斑的形成情況。

1.2.8 噬菌體的抗逆性測(cè)定

熱穩(wěn)定性：將初始濃度為109PFU/mL的噬菌體液分裝到2mL的EP管中，分別置于-20、4、25、37、46、54、60、70、90℃溫度中處理1h。以處理前噬菌體液為陰性對(duì)照。處理后的噬菌體液通過(guò)雙層平板法測(cè)定效價(jià)。每處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

紫外線穩(wěn)定性：將初始濃度為109PFU/mL的噬菌體液，分裝到2mL的EP管中。分別在紫外線下照射10、20、30min，以未照射處理組為陰性對(duì)照，雙層平板法測(cè)定效價(jià)。每處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

pH穩(wěn)定性：用H2SO4和NaOH調(diào)節(jié)SM緩沖液至pH值為3、5、6、7、8、11、13。將噬菌體液（109PFU/mL）分別與不同pH緩沖液等體積混合作為不同試驗(yàn)組，與SM緩沖液原液等體積混合作為陰性對(duì)照組，37℃靜置孵育1h后，采用雙層平板法測(cè)定處理后噬菌體的效價(jià)。每處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.9 噬菌體全基因組的測(cè)序與分析

利用噬菌體基因組DNA提取試劑盒獲得噬菌體DNA，委托上海派森諾生物科技有限公司完成基因組測(cè)序。參照HHMI SEA-PHAGES噬菌體基因組學(xué)指南對(duì)噬菌體的基因組進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序、組裝和基因注釋?zhuān)╤ttps：//seaphagesbioinformatics.helpdocsonline.com/home）。采用Illumina TruSeq NanoDNA Sample Prep Kit方法構(gòu)建文庫(kù)。使用ABVSS（http：//www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/abyss）拼接軟件對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行多個(gè)Kmer參數(shù)的拼接，得到最優(yōu)組裝結(jié)果。把reads比對(duì)到組裝好的基因組序列上，統(tǒng)計(jì)組裝序列的GC含量和reads覆蓋深度。運(yùn)用GapCloser（https：／／sourceforge.net/projects/soapdenovo2/files/Gap-Closer/）軟件對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行局部?jī)?nèi)洞填充和堿基校正。使用GeneMarkS軟件對(duì)測(cè)序的基因組進(jìn)行編碼基因預(yù)測(cè)。采用Rcirclize包繪制基因組圈圖。通過(guò)BLAST（basic local alignment searchtool）與NCBI中已有的33株金黃色葡萄球菌噬菌體進(jìn)行基因組比較分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用GraphPad 6軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離

通過(guò)雙層平板法從牛場(chǎng)污水混樣中分離得到一株金黃色葡萄球菌噬菌體，命名為SP688。可見(jiàn)在含有宿主菌的雙層平板上形成較大噬菌斑，邊緣整齊無(wú)暈環(huán)，形態(tài)均一，清晰透亮，平均直徑大小2.5mm（圖1）。

2.2 噬菌體效價(jià)測(cè)定

將純化后的噬菌體連續(xù)10倍梯度稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)雙層平板法計(jì)算各濃度梯度噬菌斑個(gè)數(shù)。經(jīng)多次平行試驗(yàn)后，得出SP688噬菌體效價(jià)為2.75×1010PFU/mL。

2.3 噬菌體電鏡形態(tài)觀察

在透射電鏡下觀察SP688噬菌體的形態(tài)（圖2）發(fā)現(xiàn)，其頭部呈多面體結(jié)構(gòu)，具不收縮的長(zhǎng)尾，尾端有明顯的纖突結(jié)構(gòu)：總長(zhǎng)413.40nm，頭部的長(zhǎng)度和寬度分別為102.1nm和59.51nm，尾巴的長(zhǎng)度為291.52nm，爪子的寬度和長(zhǎng)度分別為33.08nm和19.78nm。

2.4 最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定

將不同濃度的噬菌體稀釋液與宿主菌共同培養(yǎng)后，通過(guò)對(duì)微孔濁度的觀察，發(fā)現(xiàn)在MOI為1時(shí)，微孔內(nèi)液體澄清透亮，無(wú)彌散狀渾濁。同時(shí)測(cè)定OD600數(shù)值，在MOI為1時(shí)，與細(xì)菌組比較差異顯著。結(jié)合兩方法結(jié)果，SP688最佳感染復(fù)數(shù)為1（圖3）。

2.5 噬菌體裂解動(dòng)力學(xué)

將不同濃度噬菌體與宿主菌共同培養(yǎng)，通過(guò)動(dòng)態(tài)酶標(biāo)儀每小時(shí)記錄OD600值，繪制噬菌體的裂解動(dòng)力學(xué)曲線（圖4）。結(jié)果顯示，SP688噬菌體可一定程度抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)速度，減少細(xì)菌數(shù)，高濃度噬菌體在10h內(nèi)能完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

2.6 噬菌體的裂解譜測(cè)定

通過(guò)雙層平板法測(cè)定噬菌體對(duì)54株臨床分離細(xì)菌的裂解作用，得到噬菌體裂解譜（表1）。噬菌體SP688裂解譜范圍較寬，可裂解9株金黃色葡萄球菌，其中7株對(duì)氨芐西林有耐藥性。宿主特異性較強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌無(wú)裂解作用。

2.7 噬菌體的抗逆性

2.7.1 溫度穩(wěn)定性

將在不同溫度孵育過(guò)的噬菌體通過(guò)雙層平板法測(cè)定效價(jià)，結(jié)果（圖5）顯示，在-20℃至46℃時(shí)，噬菌體活性受到影響較小，效價(jià)變化不大。溫度達(dá)到54℃時(shí)，噬菌體開(kāi)始急劇失活，效價(jià)急劇下降，60℃時(shí)完全失活。表明噬菌體對(duì)低溫有一定的耐受性（小于37℃），對(duì)高溫耐受性弱，超過(guò)54℃噬菌體開(kāi)始逐漸失去活性。

2.7.2 噬菌體的紫外線穩(wěn)定性

將在紫外線下照射不同時(shí)間的噬菌體通過(guò)雙層平板法測(cè)定效價(jià)，結(jié)果（圖6）顯示，SP688噬菌體對(duì)紫外線的耐受力較弱，照射10min時(shí)，效價(jià)下降40%左右，照射30min后完全失活。

2.7.3 噬菌體的pH穩(wěn)定性

將在不同pH緩沖液中孵育的噬菌體通過(guò)雙層平板法測(cè)定效價(jià)，結(jié)果（圖7）顯示，噬菌體SP688對(duì)酸堿耐受范圍較大，對(duì)酸、堿均有一定的耐受力，但對(duì)強(qiáng)堿的耐受程度不如強(qiáng)酸。pH值為7.4時(shí)，噬菌體活性最強(qiáng)：當(dāng)pH值為3.0、5.0、6.0、8.5、11.0時(shí)，對(duì)噬菌體活性影響不大，效價(jià)降低20%左右；當(dāng)pH值為13.0時(shí)，效價(jià)降低60%。

2.8 噬菌體基因組測(cè)序

為了解噬菌體SP688的基因組特征，對(duì)其進(jìn)行了Illumina全基因組序列測(cè)定，獲得有效數(shù)據(jù)891.8Mb。組裝后結(jié)果顯示，噬菌體基因組為環(huán)狀DNA（圖8A），全長(zhǎng)為45499kb，GC總含量為34.1%（圖8B）。CeneMarkS軟件預(yù)測(cè)噬菌體SP688基因組含64個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs），其中19個(gè)（29.69%）具有特定功能，可將它們分為以下幾個(gè)模塊：（1）噬菌體結(jié)構(gòu)組成相關(guān)蛋白：衣殼成熟相關(guān)蛋白（004）、主要衣殼蛋白（005）、主要尾蛋白（010）、主要尾蛋白（011）、尾標(biāo)尺蛋白（014）、尾家族蛋白（015）；（2）復(fù)制和代謝相關(guān)蛋白：調(diào)節(jié)蛋H（032）、核酸結(jié)合蛋白（042）、DNA聚合酶A結(jié)構(gòu)域（043）、dUTP酶（053）、轉(zhuǎn)錄激活因子（058）、病毒型復(fù)制修復(fù)核酸酶結(jié)構(gòu)域（061）、SNF2_N家族超家族ⅡDNA/RNA解旋酶（062）、HNH核酸內(nèi)切酶（064）；（3）噬菌體包裝相關(guān)蛋白：末端酶小亞單位（001）、末端酶大亞單位（002）；（4）殺菌抑菌相關(guān)蛋白：穿孔素（023）、含CHAP結(jié)構(gòu)域蛋白（024）、整合酶（025）、毒素-抗毒素系統(tǒng)蛋白（029）。根據(jù)噬菌體基因組的注釋和分類(lèi)，表明其具有自我復(fù)制、組裝和宿主裂解所需的所有核心基因。

根據(jù)Oliveira等對(duì)噬菌體裂解酶的描述，將金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶分為4種不同類(lèi)型：第一類(lèi)由單基因編碼：第二類(lèi)含有Ⅰ組內(nèi)含子：第三類(lèi)由兩段相鄰基因共同編碼：第四類(lèi)含裂解酶間二級(jí)翻譯起始位點(diǎn)的單基因。經(jīng)分析，SP688噬菌體的裂解酶含AMI-3，Amidase_3do-main（PF01520/IPR002508）：SH3-5，SH3_5do-main（PF08460/IPR013667）兩段結(jié)構(gòu)域，屬第三類(lèi)噬菌體裂解酶（圖9A），與SPPI相似度最高（圖9B）。

3 討論與結(jié)論

β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物曾經(jīng)被認(rèn)為是治療金黃色葡萄球菌的有效抗生素，但近年來(lái)由于濫用導(dǎo)致其耐藥菌株分離率越來(lái)越高，嚴(yán)重威脅奶牛健康，臨床防治迫切需要噬菌體等新的抗菌手段。本研究以臨床分離到的奶牛源耐氨芐西林金黃葡萄球菌為宿主菌，分離得到一株裂解性噬菌體，命名為SP688。噬菌體SP688能在含有其宿主菌的雙層平板上形成邊緣整齊、透亮、無(wú)暈環(huán)的噬菌斑，符合裂解性噬菌體的特征14。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，SP688具有長(zhǎng)而不收縮的尾巴，末端有一個(gè)膨大的纖突，符合長(zhǎng)尾科噬菌體的特征。與王一凡等分離到的短尾金黃色葡萄球菌噬菌體P42相比，SP688效價(jià)更高，能達(dá)到1010PFU/mL以上，且裂解譜較廣，對(duì)7株不同的耐氨芐西林金黃色葡萄球菌均有裂解能力。最佳感染復(fù)數(shù)為1，該指標(biāo)的確定有利于快速收獲高滴度噬菌體懸液。分析其裂解動(dòng)力學(xué)曲線發(fā)現(xiàn)，該噬菌體可以一定程度抑制和減少細(xì)菌的生長(zhǎng)速度和數(shù)量，且濃度較高時(shí)可在10h內(nèi)完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。在自然環(huán)境中，噬菌體對(duì)環(huán)境壓力的耐受性決定其侵染宿主的能力，良好的環(huán)境壓力耐受性是噬菌體作為新型生物抑菌制劑的前提。噬菌體SP688對(duì)溫度耐受范圍較寬，在-20-46℃均具有良好的活性，pH值3-11范圍內(nèi)活性良好。與葛志毅等分離到的噬菌體相比，SP688的耐熱能力和耐酸堿能力更強(qiáng)，具備作為環(huán)境消毒劑的應(yīng)用潛力。健康奶牛的乳腺環(huán)境pH值一般在6.4-6.6之間，患乳腺炎時(shí)會(huì)升高至7.2左右：體溫正常范圍在37.5-39.5℃?；赟P688良好的抗性，將其作為乳腺注入劑的應(yīng)用過(guò)程中，也可保持穩(wěn)定的活性，且不會(huì)在食品中殘留，對(duì)人類(lèi)健康和公共衛(wèi)生具有良好意義。

全基因組分析是了解噬菌體最重要的手段。在基因水平上分析噬菌體的安全性是研究噬菌體的重要前提，是解析其結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。本研究中，噬菌體SP688全基因組測(cè)序結(jié)果顯示，其基因組為環(huán)狀DNA，全長(zhǎng)45499kb，包含64個(gè)ORFs，其中已知基因功能的編碼序列（CDs）有19個(gè)（29.69%）。通過(guò)基因組的注釋和分類(lèi)，該噬菌體具有DNA代謝、病毒粒子組裝和裂解宿主所需的所有核心基因。穿孔素（023）、含CHAP結(jié)構(gòu)域蛋白（024）是噬菌體SP688基因組中被注釋到的與裂解相關(guān)的基因，是裂解酶LysGH15起催化作用的關(guān)鍵活性片段，該裂解酶對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出廣譜高效的抗菌活性。一般來(lái)說(shuō)，噬菌體大多采用穿孔素一裂解酶（holin-lysin）系統(tǒng)來(lái)裂解細(xì)菌。穿孔素是一種可插入細(xì)胞質(zhì)膜并在膜上形成小孔的疏水性小蛋白質(zhì)，與細(xì)菌內(nèi)溶素（或裂解酶）協(xié)作，在噬菌體繁殖周期的最后階段降解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，通過(guò)使細(xì)菌內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)的滲透壓失衡導(dǎo)致細(xì)菌溶解，同時(shí)釋放子代噬菌體26。噬菌體SP688裂解酶由該兩段相鄰基因共同編碼，表現(xiàn)出良好的裂解活性，在未來(lái)的應(yīng)用研究中，不僅可以直接應(yīng)用噬菌體SP688來(lái)進(jìn)行疾病治療，還可以通過(guò)蛋白表達(dá)手段制備裂解酶來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。

綜上，本研究分離并鑒定了一株新的可裂解耐氨芐西林金黃色葡萄球菌的噬菌體SP688，其裂解譜廣，裂解能力強(qiáng)，具有較好的環(huán)境耐受性。研究結(jié)果可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)噬菌體制劑提供數(shù)據(jù)支持，為使用噬菌體制劑防控細(xì)菌病提供新的參考。

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS36）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（鄉(xiāng)村振興科技創(chuàng)新提振行動(dòng)計(jì)劃）項(xiàng)目“預(yù)制菜全鏈條智慧生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用”（2022TZXD0021）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CXGC2022A28）