楊澤華，丁毅鵬

（海南省人民醫(yī)院（海南醫(yī)學院附屬海南醫(yī)院）呼吸與危重癥醫(yī)學科，海南 ?？?70100）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）簡稱慢阻肺病，是一種異質(zhì)性肺部疾病［1］。據(jù)最新WHO 數(shù)據(jù)顯示，COPD 是全球第三大死因。并且由于我國人口老齡化、空氣污染和吸煙率的上升等原因，預計未來COPD 的患病率、死亡率和社會負擔仍會增加［2］。在COPD 的研究中，常用到基因測序。傳統(tǒng)的測序方法獲得的是細胞群體的總平均反應，無法反映每個細胞之間的差異性，不能完全揭示疾病的發(fā)病機制等。單細胞測序（single cell sequencing，SCS）技術可以在單細胞水平上對基因組和轉錄組等進行測序，揭示基因結構和表達以及發(fā)現(xiàn)細胞間的異質(zhì)性和稀有細胞等。目前迫切需要這項技術來幫助研究COPD 的發(fā)病機制以及發(fā)現(xiàn)可靠的早期診斷方法和治療方法等，從而減輕疾病負擔。本文將介紹單細胞測序技術及相關進展，并對其在COPD 研究中的應用進行綜述。

1 SCS 技術概述

1977 年，Sanger 等［3］發(fā)明了第一代基因測序技術，基因測序成為探索細胞遺傳物質(zhì)變化和疾病發(fā)展的強有利工具。2009 年Tang［4］首次通過單細胞RNA 測序方式實現(xiàn)了單個細胞內(nèi)5 000 多個mRNA 表達信息的平行檢測，開啟了單細胞技術的測序時代。

SCS 技術的流程主要包括單細胞制備、文庫構建、高通量測序和數(shù)據(jù)處理分析［5］。

單細胞制備的質(zhì)量極大影響測序分析結果，傳統(tǒng)分選方法有梯度稀釋法、顯微操作法、熒光激活細胞分選、激光顯微切割等，不僅效率低，而且容易損傷細胞。目前更多使用高通量的細胞捕獲方法，如微流控芯片捕獲等［6］。

SCS 主要包括：基因組，主要用于檢測單核苷酸突變、拷貝數(shù)變異及染色體結構變異；單細胞轉錄組，可以直觀地反映出細胞間基因表達差異；表觀遺傳組［7］，可從單細胞水平獲得甲基化水平數(shù)據(jù)，補充DNA 變異和RNA 表達之外的數(shù)據(jù)；蛋白質(zhì)組，可以解構細胞群體并推斷蛋白質(zhì)豐度關系；空間轉錄組，可以描繪、分析細胞的空間位置及其在空間中的基因表達譜。多組學［8］可以全面綜合分析細胞，得到更多更全面的遺傳信息。

數(shù)據(jù)處理分析：先把數(shù)據(jù)進行預處理和標準化，然后進行主成分分析降維，再進行t 分布隨機鄰接嵌入或統(tǒng)一流形逼近與投影降維［9］，實現(xiàn)可視化；根據(jù)細胞的特征將大量的細胞分成不同的亞群。對差異基因進行富集分析，可以了解每種細胞類型的生物學功能，揭示和理解生物學過程中的關鍵分子機制；利用擬時序分析，推斷細胞間的發(fā)展過程，可以發(fā)現(xiàn)罕見的細胞類型和隱性狀態(tài)?；谂潴w-受體數(shù)據(jù)庫和單細胞基因數(shù)據(jù)，可以分析細胞間的信息交流等［10］。

2 SCS 技術在呼吸系統(tǒng)疾病中的研究進展

SCS 技術正迅速成為各種研究中不可替代的方法，已經(jīng)應用在許多呼吸系統(tǒng)疾病的研究當中。

呼吸系統(tǒng)疾病中肺纖維化的發(fā)病率在逐漸增加，目前的診斷和治療方法欠佳。Reyfman 等［11］通過正常和纖維化肺組織的單細胞RNA 測序，在纖維化患者中發(fā)現(xiàn)了一個獨特的、新的促纖維化肺泡巨噬細胞群體。通過制作分析肺纖維化的單細胞圖譜，揭示了單個細胞群中纖維化基因表達的共同和不同模式并證明了肺纖維化患者肺泡巨噬細胞和上皮細胞的異質(zhì)性。單細胞RNA 測序可以在早期疾病患者的肺樣本上進行，這樣我們可以識別早期肺纖維化患者并進行有效干預。

肺癌是癌癥死亡的主要原因之一，其內(nèi)部存在明顯異質(zhì)性，這種異質(zhì)性有很重要的研究意義。而SCS 技術在發(fā)現(xiàn)細胞間異質(zhì)性方面有很大的優(yōu)勢。Maynard 等［12］在靶向治療前和治療中，使用從30 名患者獲得的49 份臨床活檢進行轉移性肺癌的單細胞RNA 測序，描繪的細胞圖譜揭示了復雜和動態(tài)的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，為肺癌的精準化治療提供依據(jù)。

3 SCS 技術在COPD 中的研究進展

3.1 COPD 的概述

COPD 以持續(xù)氣流受限為主要臨床特征，以異常的氣道炎癥為病理特征［13］。其危險因素較多，首要因素是主動吸煙或被動接觸二手煙導致的煙草暴露［14］；還有職業(yè)接觸、空氣污染、生物質(zhì)燃料［15］、兒童期哮喘和既往肺部感染史以及α1-抗胰蛋白酶遺傳性缺乏等因素。

COPD 的發(fā)病機制復雜，過去研究發(fā)現(xiàn)與炎癥機制、蛋白酶-抗蛋白酶失衡機制、氧化應激機制和自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂等有關［16］。近些年研究發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA 損傷［17］、異常自噬［18］和細胞焦亡［19］與COPD 的發(fā)病機制有關。研究分析COPD 的發(fā)病機制可以為COPD 的早期診斷、預防和治療提供理論基礎。

COPD 患者常在癥狀明顯后才就診，而此時疾病一般都發(fā)展到了中晚期，臨床干預效果差。并且目前COPD 的診斷金標準肺功能檢查［2］，需要患者的肺功能降低到一定程度才能做出診斷。同時因為肺功能檢查設備成本較高，操作較復雜，需要相對嚴格和復雜的質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)解讀，導致我國肺功能檢查率低。2018 年，COPD 患者中接受過肺功能檢查的僅占總患病人數(shù)的12%［20］。這給COPD 的預防和治療帶來了很大的困難。

3.2 COPD 的研究進展

目前缺乏可靠的早期診斷方法，不能及時對早期COPD 進行有效的干預。如果能篩查診斷出早期COPD 患者，并對其進行有效的干預和治療，可以更好地減緩疾病進展，減輕疾病負擔。當前的治療方法無法阻止疾病的進展，我們需要去發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，尋找更有效的治療方法。

COPD 是基因與環(huán)境相互作用導致的多基因疾病。NHLBI 資助的慢COPD 遺傳流行病學研究（COPDGene）是有史以來調(diào)查COPD 發(fā)展中涉及的遺傳因素的最大規(guī)模的研究之一，它對理解COPD 遺傳基礎至關重要。迄今為止，已有超過20個基因位點確定與COPD 影響狀態(tài)相關，另外一些基因位點顯示與COPD 相關表型如肺氣腫、慢性支氣管炎和低氧血癥相關［21］。

煙霧暴露等環(huán)境因素不能完全解釋COPD 的易感性?；诩易搴腿巳旱难芯勘砻?，COPD 風險的 很 大 一 部 分 與 遺 傳 變 異 有 關［22］，如HHIP 和FAM13A［23］。識 別 與COPD 相 關 的 遺 傳 因 素 可 能有助于解釋疾病的異質(zhì)性，評估個體易感性及預后，并確定新的個性化治療方法。單核苷酸變異對許多人類疾病和性狀都有影響，Ding 等［24］通過病例對照研究首次揭示了TLR9 和TLR2 多態(tài)性對中國人COPD 的發(fā)展具有保護作用。這些研究強烈表明遺傳因素是COPD 易感性的重要及實質(zhì)性因素。

Sakornsakolpat 等［25］對 來 自 英 國 生 物 庫 的35 735 例病例和222 076 例對照進行了全基因組關聯(lián)分析，鑒定了82 個具有全基因組顯著性的基因座。其中對表型的最大貢獻不是來自具有大效應的罕見變異，而是來自許多具有小效應的常見變異的組合效應。這種常見疾病-常見變異模型為全基因組關聯(lián)分析提供了強有力的支持。COPD 中鑒定的幾十到幾百個基因座中，只有一小部分相關基因座被研究了功能效應，如FGF7 基因在影響COPD 風險中的作用［26］和FAM13A 可能通過促進β-catenin降解而影響COPD 的易感性［27］。此類研究通常能對COPD 的發(fā)病機制有新的發(fā)現(xiàn)。

有研究發(fā)現(xiàn)外泌體與COPD 的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，其中，環(huán)狀RNA（circRNAs）在外泌體中具有富集性和穩(wěn)定性［28］，有望成為COPD 的生物標 志 物 或 提 供 新 的 治 療 靶 點。Liu［29］采 集3 例COPD 患者和3 例非COPD 患者的新鮮外周血，檢測其mRNA、miRNA、lncRNA 和CircRNA 的表達，鑒定分析其差異表達，揭示了RNA 在COPD 中的參與和潛在的調(diào)控作用，這將有助于COPD 的病理學研究和COPD 治療靶點的探索。其構建的lncRNA-mRNA 共表達網(wǎng)絡和CircRNA-miRNAmRNA（ceRNA）相互作用網(wǎng)絡有望為未來的COPD 研究提供有價值的信息。

3.3 SCS 技術在COPD 研究中的應用

COPD 是一種復雜的多基因疾病，受遺傳和環(huán)境因素相互的影響。SCS 技術在COPD 中的應用是一個新興的研究領域，目前國內(nèi)外的研究正在積極探索該技術在COPD 發(fā)病機制、病理、生理過程以及診斷和治療方面的應用。它是一種能夠在單細胞水平上對基因組和轉錄組等多組學進行測序分析的技術，可以幫助我們深入了解細胞類型、細胞功能和細胞間的相互作用等方面的細胞生物學問題，目前仍然需要進一步的研究來驗證和擴展這些發(fā)現(xiàn)，并將其應用于臨床實踐中。

SCS 可以幫助鑒定分析COPD 患者肺組織中的不同細胞類型，如上皮細胞、內(nèi)皮細胞、免疫細胞及間質(zhì)細胞等，并進一步研究分析它們在COPD 理過程中的功能和相互作用。國內(nèi)研究報道中，彭玲等［30］利用GEO 公共數(shù)據(jù)庫中18 例COPD 患者及28例健康對照組共219 257 個肺組織單細胞RNA 測序結果，分析高內(nèi)皮細胞小靜脈（HEV）內(nèi)皮細胞與T 淋巴細胞、B 淋巴細胞以及樹突狀細胞的關系，發(fā)現(xiàn)HEV 內(nèi)皮細胞在COPD 中升高，并具有免疫調(diào)節(jié)的作用，有望成為COPD 治療的潛在靶標。越來越多的SCS 數(shù)據(jù)產(chǎn)生并整合到一個可公開訪問的數(shù)據(jù)庫中。這極大地促進了COPD 的相關研究，對探索COPD 發(fā)病機制及發(fā)現(xiàn)新的治療方法有很大的幫助。

SCS 可以幫助分析COPD 患者肺組織中炎癥反應和免疫細胞的變化。通過比較不同細胞類型中炎癥相關基因的表達水平，可以了解COPD 炎癥反應的機制和調(diào)控網(wǎng)絡。國外研究報道中，Sauler等［31］描繪了晚期COPD 受試者或對照肺的移植肺組織的單細胞RNA 測序譜并使用轉錄組網(wǎng)絡分析，確定了COPD 中不同上皮細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞群中以前未認識到的基因表達和細胞相互作用的變化，強調(diào)了COPD 中細胞損傷和炎癥的復雜性和多樣性。未來的研究的特定轉錄失調(diào)的結果將提供對導致疾病的機制的見解。

在COPD 發(fā)展過程中，香煙煙霧是主要危險因素，它對小氣道上皮細胞有誘導作用，而上皮細胞損傷是COPD 重要的病理特征。SCS 可以揭示COPD 發(fā)展過程中上皮細胞損傷的機制，以及相關細胞類型的功能和相互作用。Wohnhaas 等［32］利用單細胞RNA 測序揭示了以前未認識到的小氣道上皮內(nèi)的轉錄異質(zhì)性和對急性和慢性香煙煙霧暴露的細胞類型特異性影響。了解小氣道上皮細胞圖譜和細胞（亞）類型在煙霧暴露反應中的特異性作用可能有助于開發(fā)COPD 的細胞特異性治療方法。

通過單細胞轉錄組測序，可以比較COPD 患者和健康人群中各個細胞類型的基因表達差異。這有助于了解COPD 發(fā)生和發(fā)展過程中細胞內(nèi)基因表達的變化，從而揭示COPD 的潛在機制。Pei等［33］對COPD 患者和健康對照者的血漿外泌體進行測序，并對外周血單核細胞（PBMCs）進行單細胞RNA 測序，然后構建了競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡來描述COPD 中PBMCs 和外泌體之間的相互作用。此外還生成了COPD 患者PBMCs 的外泌體RNA 圖譜和單細胞轉錄組圖譜，描述了免疫功能受損和COPD 發(fā)展之間的可能聯(lián)系，確定了外泌體在介導局部和全身免疫反應中的可能作用，有助于最終闡明COPD 發(fā) 展 的 基 礎 機 制。而Huang 等［34］對 來 自COPD 和具有不同吸煙史的供體的年齡分層，對照肺組織的細胞進行了單細胞RNA 測序分析，為COPD 的發(fā)病機制提供了一個觀點，并證明了靶向單核細胞在COPD 診斷和治療中的潛力。這兩項研究促進了對COPD 發(fā)病機制的理解，并發(fā)現(xiàn)了COPD 中診斷和治療的潛在靶點。

一些研究發(fā)現(xiàn)，COPD 患者的肺組織中存在與鐵死亡相關的基因表達異常。這些異常可能導致鐵在細胞內(nèi)的積累，從而引發(fā)細胞損傷和炎癥反應。此外，COPD 患者肺組織中存在與鐵死亡相關的細胞亞群，如巨噬細胞和上皮細胞。Fan 等［35］綜合分析來自COPD 巨噬細胞的單細胞RNA 測序數(shù)據(jù)，揭示了巨噬細胞鐵死亡在COPD 中的重要作用，新的生物標志物（SOCS1 和HSPB1）可能通過調(diào)節(jié)巨噬細胞鐵死亡參與COPD 的發(fā)病機制。這表明SOCS1 和HSPB1 可以作為COPD 新的治療靶點。

近幾年，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）對全球醫(yī)療保健系統(tǒng)構成嚴重威脅。有研究發(fā)現(xiàn)COPD 患者感染SARS-CoV-2 的風險及感染后死亡率比健康人高。Johansen 等［36］對健康人和COPD 患者接種新型冠狀病毒疫苗7 天后分化的原代支氣管上皮細胞（pBECs）進行了單細胞RNA 測序分析，并將變化與病毒滴度、促炎反應和干擾素產(chǎn)生相關聯(lián)，發(fā)現(xiàn)COPD 的pBECs 更容易受到SARS-CoV-2 感染。我國COPD 患者多，這項研究發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床指導意義，對COPD 患者防治SARS-CoV-2 有積極的影響。

干細胞治療是一種新興的治療方法，被廣泛研究應用于COPD 的治療中，而SCS 可以幫助鑒定COPD 肺組織中的干細胞類型和狀態(tài)。COPD 的特征是不可逆的肺組織損傷，許多研究發(fā)現(xiàn)了肺損傷后遠端氣道干/祖細胞（DASCs）的潛在再生功能。Wang 等［37］把小鼠和人類DASCs 擴增、分析，并移植到受傷的小鼠肺中，然后進行單細胞分析以揭示移植細胞的分化途徑。最后，將人DASCs 移植到COPD 小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)分離的小鼠和人DASCs 可以無限擴增，并能夠在體外進一步分化為成熟的肺泡結構。單細胞分析發(fā)現(xiàn)移植細胞表達典型的Ⅰ型肺泡細胞標志物以及特異性分泌蛋白。這些發(fā)現(xiàn)表明，DASCs 肺內(nèi)移植可以重建功能性肺結構，表明DASCs 移植在治療COPD 中的潛在治療作用。DASCs 在COPD 過程中發(fā)揮多種作用，結合SCS揭示其具體機制，也許可以逆轉COPD 的不可逆損傷，并為開發(fā)新的干細胞治療策略提供理論依據(jù)。

這些研究提供了關于細胞類型、細胞功能和細胞間的相互作用等方面的重要信息，有望進一步理解COPD 的發(fā)病機制，以及發(fā)掘新的診斷及治療方法。

4 討論

在過去十年中，SCS 已被證明是生命科學領域的變革技術之一。目前應用在COPD 研究中，如確定以前未鑒定的細胞亞群、發(fā)現(xiàn)COPD 新的生物標志物、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和通過機器學習算法預測慢阻肺疾病患者相關診斷基因標志物［38］等。但是，目前SCS 技術仍存在較多問題有待改善，如成本問題、單細胞分離獲取的質(zhì)量問題、基因捕獲的效率和質(zhì)量問題、細胞物理位置的缺失、擴增偏倚問題和實驗批次效應［39］等。

由于目前COPD 缺乏可靠的早期診斷方法，無法及時進行早期干預，并且臨床治療無法阻止疾病的進展，導致其發(fā)病率、患病率和死亡率高，造成嚴重的疾病負擔。所以急需找尋可靠的早期診斷方法和有效的治療方法來減解決這一問題。而SCS技術在COPD 發(fā)病機制的研究中有很大的作用，有望實現(xiàn)COPD 的早期診斷、個體化治療和預后預測，提高患者生命質(zhì)量，減輕社會負擔。

作者貢獻度說明：

楊澤華：選題，論文結構設計，文獻收集，撰稿，修稿；丁毅鵬：主要對選題、文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。