趙錚 史帥朋 石明軍 魏兵強

摘要：為了解辣椒果膠裂解酶（Pectin lyase like，PLL）基因家族成員數(shù)量、理化結(jié)構及可能參與的生物學過程，以期為全面鑒定和認識辣椒CaPLLs基因家族的生物學功能提供研究基礎。利用全基因組掃描方法和在線生物信息學工具對辣椒CaPLLs基因家族進行了鑒定和分析。結(jié)果在辣椒參考基因組的9條染色體上共鑒定出28個CaPLLs基因家族成員，且分別隸屬于5個亞族；CaPLLs家族成員的氨基酸序列長度介于183～762 aa，分子量范圍為19.65～84.31 kDa，等電點范圍為5.39～9.44。保守基序及結(jié)構域分析表明，CaPLLs家族成員共有10個保守基序，所有成員均含有Pec_lyase_C結(jié)構域。有多種與激素、脅迫應答和生長發(fā)育相關的順式作用元件存在于CaPLLs基因的啟動子區(qū)域中。由此可見，這28個CaPLLs基因家族成員同一亞家族基因之間高度保守。

關鍵詞：辣椒；果膠裂解酶；基因家庭；生物信息學

中圖分類號：S641.3? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：2097-2172（2024）05-0415-07

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.05.005

Bioinformatics Analysis of Pectin Lyase Gene Family in Peppers

ZHAO Zheng， SHI Shuaipeng， SHI Mingjun， WEI Bingqiang

（College of Horticulture， Gansu Agriculture University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： To understand the number of members of the pectin lyase like（PLL） gene family of pepper， their physicochemical structures， and the biological processes in which they may be involved， the CaPLLs gene family was identified and analyzed using genome-wide scanning and online bioinformatics tools. A total of 28 CaPLLs gene families were identified on nine chromosomes in the reference genome of pepper， belonging to five subfamilies. The length of the amino acid sequence of CaPLLs gene family ranged from 183 to 762 aa， molecular mass ranged from 19.65 to 84.31 kDa， and isoelectric points ranged from 5.39 to 9.44. The analysis of conserved motifs and structural domains showed that there were 10 conserved motifs in CaPLLs family， and all of them contained the Pec_lyase_C domain. A variety of cis-acting elements related to hormones， stress responses， and growth were predicted to be present in the promoter sequences of CaPLLs gene. In this study， 28 members of the CaPLLs gene family were identified， and highly conserved among genes in the same subfamily.

Key words： Pepper; Pectin lyase like; Gene family; Bioinformatics

植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠組成，而果膠由1，4連接的α-D半乳糖醛酸（GalpA）殘基組成，甲酯化程度高。植物細胞壁中的果膠是一種異構酶，包括4種類型：同聚半乳糖醛酸（Homogalacturonan， HG）、木聚糖（0Xylo galacturonan， XGA）、鼠李糖半乳糖醛酸I（RhamnogalacturonanI， RG-I）以及鼠李糖半乳糖醛酸II（Rhamnogalacturonan II， RG-II）［1 - 2 ］。果膠主要存在于初級細胞壁和中間層，不僅可以為高等植物初級細胞壁提供結(jié)構完整性與機械強度［3 ］，而且在快速生長的細胞中調(diào)節(jié)細胞壁的結(jié)構、性質(zhì)和發(fā)育過程［4 ］。

果膠降解需要幾種酶的共同作用，可分為兩大類，分別是從果膠中去除甲氧基的甲基酯酶，以及裂解半乳糖酸單元之間鍵的解聚酶（水解酶和裂解酶）［5 ］。其中果膠裂解酶（Pectate lyase like，PLL）屬于多糖裂解酶家族1（PL1），可以通過β-消除作用裂解HG半乳糖醛酸單元之間的α-1，4糖苷鍵［6 ］。在胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）和芽孢桿菌（Bacillus sp.）的培養(yǎng)物中初次發(fā)現(xiàn)PLL活性的存在［7 ］。接著，在真菌、植物花粉及花柱中也發(fā)現(xiàn)了一些類似的果膠裂解酶［8 ］。高等植物中果膠裂解酶基因PLL，最先是在番茄的花粉中被克隆，得到了2個序列類似于歐文氏桿菌的果膠裂解酶基因，隨后陸續(xù)在其他植物中也鑒定到了PLL基因。有研究表明，番茄PLL基因在成熟的花藥和花粉中表達［9 - 10 ］，PLL基因在植物的分泌組織發(fā)育、花瓣脫落、側(cè)根發(fā)生和葉片衰老花粉發(fā)育和花粉管萌發(fā)等過程中均有被報道，但關于辣椒中的果膠裂解酶基因的數(shù)目以及其調(diào)控模式還未見報道。

辣椒（Capsicum annuum L.）原產(chǎn)于中南美洲熱帶地區(qū)，在墨西哥栽培甚盛，于16世紀后期引入中國，如今中國各地都有栽培并且呈逐年增大的趨勢［11 ］。隨著辣椒全基因組測序的完成，加快了辣椒的基礎研究［12 ］。本研究采用參考基因組掃描方法，鑒定了辣椒CaPLLs家族成員，并分析了基因結(jié)構、染色體定位和順式作用元件，以及蛋白的理化性質(zhì)、保守基序等，旨在為全面鑒定和認識辣椒CaPLLs基因家族的生物學功能提供基礎。

1? ?材料與方法

1.1? ?辣椒CaPLLs基因家族鑒定

辣椒的蛋白及基因序列來自茄科基因組數(shù)據(jù)庫（Sol Genomics Network）。從pfam［Pfam is now hosted by InterPro（xfam.org）］數(shù)據(jù)庫中下載果膠裂解酶保守結(jié)構域（Pectate_lyase_C），隱馬爾可夫模型作為查詢序列。利用HMMER3.0以PF00544為參考序列，查詢其在辣椒中的候選果膠裂解酶基因家族成員，合并結(jié)果并刪除冗余序列。設截斷值E-value <10-5，以保證蛋白質(zhì)序列的可靠性。去冗余后的序列用pfam和SMART［SMART： Main page（embl-heidelberg.de）］進一步篩選，最終確定辣椒果膠裂解酶基因家族成員。利用在線軟件ProtParam（Expasy - ProtParam tool）對CaPLLs家族成員的蛋白質(zhì)序列長度、分子量及等電點等理化性質(zhì)進行分析［11 ］。

1.2? ?進化樹、 染色體定位、 保守基序及結(jié)構域的分析

查找比對擬南芥、水稻和番茄的果膠裂解酶基因家族，并在各自數(shù)據(jù)庫中下載相對應的蛋白序列。利用MEGA7.0構建上述3個物種和辣椒的系統(tǒng)進化樹，構建方法為鄰接法（neighbor-joining， NJ）［13 ］。將Bootstrap的重復次數(shù)設置1000，剩余設置選擇默認選項。利用EvloView（https：//evolgenius.info/evolview-v2/#login）進行可視化分析［14 ］。

利用Mapchart對CaPLLs進行染色體定位及作圖。利用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/）對辣椒CaPLLs蛋白的氨基酸保守基序進行分析，模體基序長度設置為最小15 aa，最大150 aa，保守序列數(shù)目不超過10［15 ］。利用CDD在線網(wǎng)址（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）分析CaPLLs蛋白的結(jié)構域，并利用TBtools對其保守基序和結(jié)構域進行可視化作圖。

1.3? ?基因結(jié)構及順式作用元件的分析

利用GSDS2.0（https： //www. ncbi. nlm. nih. gov/ Structure/cdd/cdd.shtml）分析基因結(jié)構。利用TBtool工具提取CaPLLs編碼序列（coding sequence，CDS）的起始密碼子上游2 000 bp序列作為啟動子序列，啟動子中的順式作用元件預測在PlantCARE在線數(shù)據(jù)庫（https： //bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）中進行分析［16 ］。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?辣椒CaPLLs基因家族鑒定

辣椒參考基因組中共有28個CaPLLs成員被鑒定出來（表1），采用染色體順序與位置命名法，將其命名為CaPLL1～CaPLL28。CaPLLs的編碼序列（CDS）長度為552～2 289 bp。CaPLLs基因家族編碼的氨基酸序列長度介于183～762 aa，分子量變化范圍為19.65～84.31 kDa，其中最大的是CaPLL5，最小的是CaPLL27。等電點介于5.39～9.44，CaPLL8的等電點最高（9.44），CaPLL27的等電點最低（5.39）。CaPLLs的不穩(wěn)定系數(shù)除CaPLL7、CaPLL26、CaPLL18外，其余均小于40，表明其蛋白質(zhì)相對穩(wěn)定。此外蛋白質(zhì)親水性平均系數(shù)（GRAVY）范圍為-0.482（CaPLL20）～-0.166（CaPLL27），說明它們可能為親水蛋白。除此之外，預測到所有CaPLLs均定位于細胞外。

2.2? ?CaPLLs系統(tǒng)進化分析

選用辣椒、擬南芥、水稻和番茄PLL蛋白序列共同構建系統(tǒng)進化樹（圖1）。根據(jù)物種間PLL基CaPLLs基因家族成員，并且其同一亞家族基因之間高度保守。

參考文獻：

［1］ YADAV S， YADAV P K， YADAV D， et al.? Pectin lyase：A review［J］.? Process Biochem， 2009， 44（1）： 1-10.

［2］ JAYANI R S， SAXENA S， GUPTA R. Microbial pectinolytic enzymes： A review［J］.? Process Biochem， 2005， 40（9）： 2931-2944.

［3］ MOHNEN D. Pectin structure and biosynthesis［J］.? Curr Opin Plant Biol， 2008， 11（3）： 266-277.

［4］ JIMENEZ-BERMUDEZ S， REDONDO-NEVADO J， MUNOZ-BLANCO J， et al. Manipulation of strawberry fruit softening by antisense expression of a pectate lyase gene［J］.? Plant Physiol， 2002， 128（2）： 751-759.

［5］ CAFFALL K H， MOHNEN D.? The structure， function， and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides ［J］.? Carbohydr Res， 2009， 344（14）： 1879-1900.

［6］ STARR M P， MORAN F.? Eliminative split of pectic substances byphytopathogenic soft-rot bacteria［J］.? Science， 1962， 135（3507）： 920-921.

［7］ YU J， WANG R， MA W T， et al. Pectate lyase gene vvpl1 plays a role in fruit cracking of table grapes［J］.? Journal of agricultural and food chemistry， 2023， 71（3）： 1643-1654.

［8］ 肖? ?冬.? 番茄果實成熟相關基因LePelC、LeAPETALA2LIKE的表達載體的構建及表達分析［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2009.

［9］ 陳樂天，王慧婷，韓靖鸞，等.? 植物果膠裂解酶的研究現(xiàn)狀及展望［J］.? 華南農(nóng)業(yè)大學報，2019，40（5）：71-77.

［10］ SAFRAN J， UNG V， BOUCKAERT J， et al. The specificity of pectate lyase VdPelB from Verticilium dahliae is highlighted by structural， dynamical and biochemical characterizations［J］.? International journal of biological macromolecules， 2023， 10： 1231-1236.

［11］ 馬正寶，劉? ?銘，杜澤光，等.? 辣椒外切多聚半乳糖醛酸酶基因家族的生物信息學分析［J］.? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2021，52（10）：11-18.

［12］ KIM S， PARKL M， YEOML S I， et al.? Genome sequence of the hot pepper provides insights into the evolution of pungency in Capsicum species［J］.? Nature Genetics， 2014， 46（3）： 270-2795.

［13］ 李秀敏，董? ?軒，湯冰倩，等.? 辣椒WOX基因家族的鑒定及表達分析［J］.? 湖南農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2023，49（3）：291-297.

［14］ 王永富，趙淑芳，茍秉調(diào)，等.? 辣椒CaPIP5K基因家族的鑒定與特異性表達分析（英文）［J］ .? 農(nóng)業(yè)生物技術學報，2022，30（4）： 641-655.

［15］ 徐? ?堅，王? ?燕，陳先知，等.? 大白菜熱激轉(zhuǎn)錄因子基因家族鑒定及表達分析［J］.? 核農(nóng)學報，2014，

28 （4）：586-596.

［16］ 張高原，魏兵強.? 甜瓜WRKY基因家族鑒定及其響應低溫脅迫的表達分析［J］.? 農(nóng)業(yè)生物技術學報，2020，

28（10）：1761-1775.

［17］ 鄭銀珍.? 水稻PLL和PG基因家族的鑒定及功能研究 ［D］.? 武漢：武漢大學，2019.

［18］ 陳飛飛，黃金思，王翕韞，等.? 吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆及表達分析［J］.? 南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2018，42（4）：127-133.

［19］ 洪旭升，李世貴，楊江偉，等.? 馬鈴薯StCDPKs 基因家族成員鑒定與表達分析［J］.? 甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2020，55（5）：73-83.

［20］ PALUSA S G， GOLOVKIN M， SHIN S B， et al.? Organ-specific， developmental， hormonal and stress regulation of expression of putative pectate lyase genes in Arabidopsis［J］.? New Phytol， 2007， 174（3）： 537-550.

［21］ ZHENG Y， YAN J， WANG S， et al.? Genome-wide identification of the pectate lyase-like （PLL） gene family and functional analysis of two PLL genes in rice［J］.? Mol Genet Genomics， 2018， 293： 1317-1331 .

［22］ SUN H， HAO P， MA Q， et al.? Genome-wide identification and expression analyses of the pectate lyase（PEL） gene family in cotton（Gossypium hirsutum L.）［J］.? BMC Genomics， 2018， 19（1）： 1-14.

［23］ YANG L， HUANG W， XIONG F， et al.? Silencing of SlPL， which encodes a pectate lyase in tomato， confers enhanced fruit firmness， prolonged shelf-life and reduced susceptibility to grey mould［J］.? Plant Biotechnol，? 2017，

15（12）： 1544-1555.

［24］ 劉? ?芳，段盼盼，魏? ?敏，等.? 辣椒CUL家族基因的鑒定與表達分析［J］ .? 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2023，39（6）：1275-1285.

［25］ 牛佳斌，唐? ?凱，夏迎萌，等.? 辣椒NRT基因家族的系統(tǒng)鑒定、進化與表達分析［J/OL］.? 南京農(nóng)業(yè)大學學報：1-13. （2023-12-06）［2024-03-10］.? http： //kns.cnki.net/kcms/detail/32.1148.S.20231206.1127.006.html.

收稿日期：2024 - 04 - 24

基金項目：甘肅農(nóng)業(yè)大學省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（S202310733050）。

作者簡介：趙? ?錚（2003 —），女，河南許昌人，本科在讀，專業(yè)方向為園藝。Email： 3107078996@qq.com。

通信作者：魏兵強（1980 —），男，甘肅秦安人，研究員，博士，主要從事蔬菜遺傳與分子育種工作。Email： bqwei@gsau.edu.cn。