摘要：為探究紫花苜蓿（Medicago sativa L.）茉莉酰氨基酸結(jié)合物合成酶（Jasmonoyl amino acid conjugate synthase，JAR1）的基因功能，本試驗(yàn)對(duì)‘草原4號(hào)’紫花苜蓿中克隆到的MsJAR1基因進(jìn)行了生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)MsJAR1基因cDNA序列長(zhǎng)度為1 740 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）編碼 579 個(gè)氨基酸殘基，含有GH3保守結(jié)構(gòu)域。MsJAR1與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、紅三葉（Trifolium pratense）、豌豆（Pisum sativum）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、相思子（Abrus precatorius）的同源性均在80%以上。煙草亞細(xì)胞定位顯示該蛋白定位于葉綠體。MsJAR1基因在老葉中表達(dá)量最高，花器官次之；薊馬取食、鹽和干旱脅迫可誘導(dǎo)該基因表達(dá)，初步推測(cè)其參與紫花苜蓿應(yīng)答薊馬取食及干旱和鹽脅迫防御反應(yīng)。本研究為進(jìn)一步探究紫花苜蓿MsJAR1基因功能提供了參考。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；MsJAR1；基因克隆；表達(dá)模式

中圖分類(lèi)號(hào)：S892.6""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""nbsp; 文章編號(hào)：1007-0435（2024）05-1370-08

Cloning and Expression Analysis of MsJAR1 in Medicago sativa

DAI Rui1， CHEN Qi1， SHUANG Shuang1， ZHANG Yan1， ZHANG Zhi-qiang1，2*， MI Fu-gui1，2*

（1. Colleg of Grassland， Resources and Environment，Inner Mongolia Agricultural University，Inner Mongolia Autonomous

Region， Hohhot， 010010， China; 2. Technology Engineering Center of Drought and Cold-resistant Grass Breeding in North of

the National Forestry and Grassland Administration， Institute of Grassland and Resources Environment， Inner Mongolia

Agricultural University， Hohhot， Inner Mongalia 010010， China）

Abstract：To explore the function of jasmonoyl amino acid conjugate synthase（JAR1） gene in alfalfa，a novel gene， MsJAR1 （OK602801），was cloned，characterized and bioinformatic analyzed from Medicago sativa L.. The results showed that the cDNA sequence of MsJAR1 gene was 1 740 bp in length，and the open reading frame encoded 579 amino acid polypeptide，containing the GH3 conserved domain. Amino acid sequence alignment indicated that the homology of deduced MsJAR1 with Medicago truncatula，Trifolium pratense，Pisum sativum，Cicer arietinum and Abrus precatorius was all more than 80%. Subcellular localization analysis in tobacco showed that the MsJAR1 protein located in the chloroplast. The MsJAR1 gene expression was the highest in old leaves，followed by floral organs. In addition，thrips feeding，salt and drought stress could induce the expression of MsJAR1 gene，which provided a reference for further exploring the function of MsJAR1 gene in alfalfa.

Key words：Alfalfa;MsJAR1; Gene cloning;Expression analysis

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是經(jīng)濟(jì)效益較高且世界上種植面積最廣的豆科牧草之一［1］，具有飼草產(chǎn)量高、蛋白含量高、適口性好等優(yōu)點(diǎn)［2］。隨著我國(guó)草地畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，對(duì)優(yōu)質(zhì)苜蓿的需求逐年增加，苜蓿種植面積也不斷擴(kuò)大。我國(guó)幅員遼闊，不同區(qū)域的氣候地形差異較大，不同苜蓿種植地區(qū)蟲(chóng)害發(fā)生狀況不同，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)已報(bào)道的苜蓿害蟲(chóng)常見(jiàn)種為苜蓿薊馬（Frankliniella occidentalis）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）、小葉葉蟬（Empoasca flavescens）等［3］。近年來(lái)，隨苜蓿種植面積增加，薊馬種群增速較快，對(duì)苜蓿生產(chǎn)的危害日漸顯著［4］。

植物與植食性昆蟲(chóng)之間存在著復(fù)雜的分子互作機(jī)制［5］，其中，茉莉酸（Jasmonic acid，JA）途徑［6］是最常見(jiàn)信號(hào)途徑之一。當(dāng)植物處于逆境時(shí)，會(huì)產(chǎn)生信號(hào)促使JA合成，在茉莉酸-異亮氨酸合成酶（Jasmonoyl amino acid conjugate synthase，JAR1）作用下形成茉莉酸-異亮氨酸（Jasmonic acid-isoleucine，JA-Ile）復(fù)合物。JA-Ile與茉莉酸受體蛋白COI1結(jié)合，會(huì)使轉(zhuǎn)錄因子MYC2的表達(dá)不再被抑制，繼而激活下游的靶基因［7］，生成多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而調(diào)控植物的抗逆性。

近些年，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)不同植物JAR1基因做過(guò)研究，為深入分析JAR1基因的生物學(xué)功能提供了理論指導(dǎo)。在黃燈籠辣椒中發(fā)現(xiàn)CcJAR1基因?yàn)檐岳蛩岚被厦富?，主要在抗病分子機(jī)制中發(fā)揮重要作用［8］；擬南芥受到鹽脅迫時(shí)引起的JA信號(hào)傳導(dǎo)激活則依賴(lài)JAR1和蛋白酶體的功能［9］；橡膠樹(shù)JAR1過(guò)表達(dá)后，在JA、吲哚乙酸（Indoleacetic acid，IAA）、乙烯利（Ethephon，ET）、脫落酸（Abscisic acid，ABA）和赤霉素（Gibberellic acid，GA）處理下，會(huì)對(duì)HbJAR1基因的表達(dá)起到不同程度的上調(diào)作用［10］；豌豆幼苗經(jīng)蚜蟲(chóng)取食后，JA/MeJA濃度顯著上升，導(dǎo)致JA/MeJA相關(guān)基因（LOX1、LOX2、OPR1 和 JAR1）上調(diào)表達(dá)，從而觸發(fā)對(duì)豌豆蚜的抗性響應(yīng)［11］。本研究以‘草原4號(hào)’紫花苜蓿為研究材料，從中克隆得到JAR1基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式分析，以期為該基因相關(guān)功能的研究與挖掘提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

試驗(yàn)材料為‘草原4號(hào)’紫花苜蓿。選取顆粒飽滿的苜蓿種子，于2022年4月種植于以營(yíng)養(yǎng)土和蛭石作為基質(zhì)的花盆中，置于光照16 h、黑暗8 h且溫度為22℃的室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔天澆水，在溫室中培養(yǎng)45 d，用250 mM Nacl模擬鹽脅迫處理，以正常生長(zhǎng)條件下的幼苗為對(duì)照，在不同時(shí)間處理?xiàng)l件下（0 h，2 h，4 h，8 h，12 h和24 h）取樣；使用空氣干旱法［12］對(duì)苜蓿植株進(jìn)行干旱脅迫，在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h和24 h下取樣；將生長(zhǎng)40 d左右的幼苗每株接種100只薊馬，并用300目尼龍布罩住，以未經(jīng)過(guò)薊馬處理的幼苗為對(duì)照，同時(shí)在第0 d，3 d，7 d，10 d和14 d收集樣本；在紫花苜蓿結(jié)莢期，分別對(duì)植物根、莖、老葉、嫩葉、花、莢和種子進(jìn)行取樣，用于組織特異性分析；以上處理每個(gè)樣品均重復(fù)3次，液氮速凍后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 取保存樣品各150 mg，將液氮倒入研缽進(jìn)行磨樣，使用TRIzon Rragent（康為世紀(jì)生物科技有限公司）試劑從葉片樣品中提取總RNA，利用Nano Drop檢測(cè)RNA質(zhì)量，將所提取RNA放置于-80℃保存。利用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）獲得樣品cDNA，置于-20℃儲(chǔ)存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 目的基因克隆 以前期‘草原4號(hào)’紫花苜蓿全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選出茉莉酸信號(hào)途徑中編碼茉莉酰氨基酸結(jié)合物合成酶（JAR1）的基因，設(shè)計(jì)特異性引物：Jar1-F：5′-TTCTCTGCCACCCCAGAG-3′和Jar1-R：5′-TCAATTGAATGCAGTACTG-3′。以‘草原4號(hào)’紫花苜蓿的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為50 μL，包含cDNA模板4 μL（10 ng·μL-1），2×Es Taq Master Mix（Dye） 25 μL，上下游引物各2 μL（10 μmol·L-1），ddH2O 17 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；98℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保存。用凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司，中國(guó)）回收產(chǎn)物，采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取陽(yáng)性單菌落，經(jīng)過(guò)菌落以及菌液PCR檢測(cè)后，送北京擎科生物科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物學(xué)信息分析 利用NCBI Blast在線網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)，使用DNAMAN軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)制作，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［13］；SMART（http：//smart.embl.de）在線工具分析保守結(jié)構(gòu)域；利用Expasy Prot Param tool工具分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)［14］。

1.2.4 qRT-PCR分析 利用Primer 3.0在線軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物JAR1-PCR-：5′-GCGGACTAATTTTCCGCGAG-3′和JAR1-PCR-R：5′-GGGAACGGTGACTCTGCTAC-3′。不同組織部位的cDNA為模板取 4 μL，上下引物各0.4 μL，SYBR qPCR Master Mix 10 μL（康為世紀(jì)生物科技有限公司），ddH2O 5 μL，ROX Reference Dye（50×）0.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s；95℃ 15 s；40個(gè)循環(huán)。每樣品3次重復(fù)，并采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量［15］。內(nèi)參引物為Actin-F：5′-TTTGAGACTTTCAATGTGCCCGCC-3′和Actin-R：5′-TAGCATGTGGGAGTGCATAACCCT-3′。

1.2.5 亞細(xì)胞位置預(yù)測(cè)與定位 利用PSORT軟件對(duì)MsJAR1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；構(gòu)建pCPB-MsJAR1-GFP瞬時(shí)表達(dá)載體，以空載體pCPB-GFP為對(duì)照，將構(gòu)建好的瞬時(shí)表達(dá)載體與空載體對(duì)照同時(shí)注射到煙草不同葉片中，48 h后在共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號(hào)，最終確定MsJAR1蛋白位置。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析與處理 使用Excel 2010 統(tǒng)計(jì)計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)，使用SPSS Statistics 18.0 軟件進(jìn)行方差分析，使用t檢驗(yàn)比較5%顯著性水平下的平均值。使用Origin 2019 軟件制作條形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsJAR1基因克隆

采用TRIzon法提取‘草原4號(hào)’紫花苜蓿葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌及測(cè)序，最終獲得一條全長(zhǎng)1 740 bp 的cDNA序列（圖1）。該基因序列ORF框編碼含579個(gè)氨基酸殘基（圖2），基因登錄號(hào)為OK602801。

2.2 MsJAR1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 MsJAR1蛋白理化性質(zhì) MsJAR1蛋白保守結(jié)構(gòu)域具有JAR1特征性結(jié)構(gòu)域，屬于GH3家族成員（圖3A）。紫花苜蓿MsJAR1蛋白分子式為C2942 H4615 N763O857 S24，其中異亮氨酸（Leu）含量最高為10.4%，谷氨酸（Glu）含量為8.3%，纈氨酸（Val）含量為7.1%；蛋白分子量為65 156.04 Da，等電點(diǎn)為6.24，脂肪指數(shù)為93.03，平均親水指數(shù)為-0.109，不穩(wěn)定指數(shù)為35.47，MsJAR1蛋白為親水性穩(wěn)定蛋白（圖3B）。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，MsJAR1氨基酸序列包含43.35%的Alpha螺旋、5.18%的bate折疊、15.20%的延伸鏈和36.27%的不規(guī)則卷曲，Alpha螺旋和不規(guī)則卷曲占主要成分（圖3C）。利用SWISS-MODEL對(duì)編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符（圖3D）。

2.2.2 MsJAR1序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 利用DNAMAN軟件及NCBI-Blast（www.ncbi.nlm.nih.gov）分析后發(fā)現(xiàn)，MsJAR1氨基酸序列與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、紅三葉（Trifolium pratense）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、相思子（Abrus precatorius）、花生（Arachis hypogaea）中相關(guān)氨基酸的相似度分別為97.67%，89. 33%，88.17%，85.85%，81.34%（圖4A）。進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，MsJAR1蛋白與其他豆科植物的JAR1氨基酸序列如蒺藜苜蓿、紅三葉、豌豆（Pisum sativum）、相思子、木豆（Cajanus cajan）、大豆（Glycine max）等聚為一類(lèi)（圖4B）。

2.3 MsJAR1蛋白亞細(xì)胞定位

PSORT軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MsJAR1蛋白初步定位于葉綠體內(nèi)（圖5），然后采用煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)以進(jìn)一步確定MsJAR1蛋白在細(xì)胞中的確切定位。以空載體pCPB-GFP為對(duì)照，利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)MsJAR1-GFP主要定位在葉綠體細(xì)胞中（綠色熒光），同葉綠體自發(fā)熒光（紅色熒光）融合；而空載體的GFP熒光呈現(xiàn)彌散的狀態(tài)存在于整個(gè)細(xì)胞中（圖6）。

2.4 MsJAR1表達(dá)模式分析

經(jīng)對(duì)MsJAR1基因在紫花苜蓿根、莖、老葉、嫩葉、花、豆莢和種子中的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)該基因在所有組織中均有表達(dá)，其中老葉中的表達(dá)量最高，約為種子的90倍，花中的表達(dá)量約為種子的45倍；嫩葉和莖中的表達(dá)量接近，是種子表達(dá)量的18倍左右（圖7A）。薊馬侵染誘導(dǎo)下，MsJAR1基因表達(dá)量在3 d，7 d和10 d被顯著誘導(dǎo)（圖7B）；不同時(shí)間鹽脅迫處理下，MsJAR1基因的表達(dá)量全部上調(diào)，其中8 h和2 h的表達(dá)量分別為對(duì)照（0 h）的20倍和15倍，而24 h的表達(dá)量無(wú)顯著影響（圖7C）；不同時(shí)間干旱脅迫處理下，其表達(dá)量均顯著上調(diào)，與0 h相比4 h和12 h基因的表達(dá)量較高，介于1.5倍和2.0倍之間（圖7D）。

3 討論

JAR1可以催化JA形成JA-Ile［16］，激活JA信號(hào)途徑。JA信號(hào)途徑通過(guò)調(diào)控植物下游防御基因的表達(dá)，激活下游靶基因，生成多種次級(jí)代謝產(chǎn)物并啟動(dòng)植物的防御反應(yīng)［17］。目前JAR1基因已在大豆、擬南芥、水稻、葡萄、桑樹(shù)、白楊等植物中有過(guò)報(bào)道［18-21］。本研究從‘草原4號(hào)’紫花苜蓿中克隆到全長(zhǎng)1 740 bp的cDNA序列，編碼一個(gè)含579個(gè)氨基酸殘基的蛋白。序列分析發(fā)現(xiàn)MsJAR1基因與蒺藜苜蓿、紅三葉、豌豆和相思子中的同源基因親緣關(guān)系較近，推測(cè)MsJAR1基因與這幾個(gè)物種在功能上具有相似性。蛋白質(zhì)作為基因功能的主要執(zhí)行者，需要在正確的亞細(xì)胞區(qū)隔中定位并維持生物體內(nèi)多種生化過(guò)程高效進(jìn)行［22-24］，以保證生物體正常生命活動(dòng)。煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)發(fā)現(xiàn)MsJAR1蛋白定位在葉綠體，這與長(zhǎng)春花中CrJAR1蛋白［7］和辣椒CaJAR1蛋白［25］結(jié)果相似，MsJAR1進(jìn)入葉綠體能夠發(fā)揮相應(yīng)調(diào)控功能。

植物對(duì)逆境環(huán)境的耐受性與植物激素密切相關(guān)，茉莉酸作為植物體內(nèi)源信號(hào)分子，可介導(dǎo)植物生長(zhǎng)的多種方面，如花器發(fā)育、根系生長(zhǎng)、毛狀體形成等［26］，并且在植物抗逆響應(yīng)中發(fā)揮重要作用［27］。通過(guò)qRT-PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)MsJAR1基因在不同組織部位均有表達(dá)，但主要在老葉中表達(dá)，花器官次之，說(shuō)明MsJAR1基因可能對(duì)葉片及花期階段的相關(guān)化合物合成起到調(diào)控作用，這與番茄SlJAR1基因的研究結(jié)果［28］相似。擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，葉片在受到機(jī)械損傷后傷口會(huì)迅速誘導(dǎo)JA-Ile的累積［29］。由于薊馬的取食能夠激活JA的合成以及JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)［30-31］，因此，當(dāng)薊馬在植株上造成傷口時(shí)，會(huì)導(dǎo)致JA-Ile含量的增加，從而發(fā)揮抗蟲(chóng)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，MsJAR1基因的表達(dá)量在被薊馬取食3 d、7 d、10 d所誘導(dǎo)，說(shuō)明MsJAR1基因可能參與苜?？顾E馬應(yīng)答反應(yīng)。

通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)域分析可知MsJAR1蛋白屬于GH3家族成員，GH3家族可通過(guò)維持激素穩(wěn)態(tài)在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抵抗脅迫中起到重要作用［32］。MsJAR1基因的表達(dá)會(huì)隨著物種及環(huán)境刺激的不同發(fā)生變化。在水稻和大豆的研究中發(fā)現(xiàn)，外源茉莉酸甲酯處理能夠提高水稻幼苗耐鹽性和大豆幼苗對(duì)鹽脅迫的抗性［33-34］，JA信號(hào)調(diào)控基因OsJAZ9與OsbHLH062互作提高抗氧化能力［35-36］，增加對(duì)鹽脅迫的耐受性。在擬南芥中，JAR1基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致JA-Ile含量增加，從而會(huì)提高植株對(duì)干旱脅迫的耐受性［37］；與突變體相比，JAR1過(guò)表達(dá)植株在輕度干旱條件下能夠通過(guò)澆水減緩葉片的萎蔫程度，此外，過(guò)表達(dá)株系的葉片相對(duì)含水量（RWC）較高，在干旱脅迫下受到的影響較小，表明JAR1基因的過(guò)表達(dá)延長(zhǎng)了擬南芥對(duì)干旱脅迫的耐受性［37］。本研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿MsJAR1基因在兩種脅迫條件下均被高度誘導(dǎo)，說(shuō)明MsJAR1可能參與紫花苜蓿鹽脅迫和干旱脅迫的防御反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆到‘草原4號(hào)’紫花苜蓿MsJAR1基因，其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 740 bp，編碼579個(gè)氨基酸殘基，屬于GH3家族成員。亞細(xì)胞定位顯示該蛋白定位于葉綠體，在葉片和花中表達(dá)量最高，且受薊馬取食、鹽脅迫和干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明MsJAR1基因可能參與苜蓿對(duì)薊馬、干旱和鹽脅迫的防御反應(yīng)。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）

收稿日期：2023-12-06；修回日期：2024-01-18

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校“青年科技英才支持項(xiàng)目”（NJYT23009）；國(guó)家自然科學(xué)基金（32160333；32060388）；苜蓿分子育種體系構(gòu)建及種質(zhì)創(chuàng)制（BR22-11-12）；苜蓿新品種選育及制繁種關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)（CCPTZX2023B04）;內(nèi)蒙古自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（S202311029）資助

作者簡(jiǎn)介：

代蕊（1999-），女，蒙古族，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，主要從事草育種方面研究，E-mail：18747659997@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：zhangzq19890102@126.com;Mfgui@yahoo.com.cn